אני רוצה להודות Sreemanti Basu לספק את הנתונים בתרשים 1. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH מענק AI069358 וקרן מחקר BloodCenter.

א השלימו את הארנב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארנב משלימים במלאי יש להפשיר בטמפרטורת החדר, ואת aliquoted מכן לתוך 0.5 ו / או 1 מ&quot;ל כרכים קפואים ב -20-80 מעלות לאחסון ארוך טווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרבה כל אחד משלים צריך להיות טיטרציה כדי לקבוע את ריכוז העבודה האופטימלית. בדרך כלל, דילול של 1:10-01:20 הוא אופטימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משלימים הארנב אינו presterilized תמיד לפני המכירה, בהתאם לשימוש הסופי של התאים, להשלים את צריכה להיות מסוננים מעוקרים כאשר aliquoted קפואים או לפני כן על התאים. </li></ol> ב בחירה נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לא כל הנוגדנים יעילים בכל ההפעלה משלימים, ולכן נוגדנים תחילה להיבדק על הפעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שניהם עכבר חולדה MAB יעילים בכל ההפעלה משלימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדני IgM הם בדרך כלל היעילה ביותר לשימוש תמוגה-Induced משלימים תא ואחריו IgG. Isotypes IgG ההפעלה הטובה ביותר עבור להשלים להשתנות בין המינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדן כל צריך להיות טיטרציה לשימוש אופטימלי בצפיפות תא של 10 7 תאים / מ&quot;ל. </li></ol> ג יסוד פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את אוכלוסיית התאים מתחילים 5 x 10 7 תאים / מ&quot;ל במדיום חום FCS המכיל מומת. היקף הסופי של התאים יהיה כפול נפח ההתחלה. זכור לשמור כמה תאים כך דלדול ניתן לכמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל נוגדן יש להוסיף את ההשעיה התא בריכוז הדילול מראש תקין או. מערבבים היטב את התאים על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את כמות משלימים הצורך. ההפשרה המניות משלימות בטמפרטורת החדר. אם משלימים אינו סטרילי, לעקר אותו באמצעות חלבון נמוך מחייב מזרק מסנן קצה. כדי המזרק, להוסיף כמה מ&quot;ל של מדיום לפני תוספת של להשלים את ולסנן ישירות לתוך שפופרת המכילה את התאים נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמת עוצמת השמע הסופי בצינור כך התאים ב 1 x 10 7 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 ° C למשך שעה אחת, ערבוב כל 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התאים להתעלמות supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם המדיום פעמיים. פסולת התא ידבק לצד צינורות קלקר. תאים מתים ופסולת ניתן למנוע בעזרת מסננת התא או על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את תא טוהר על ידי השוואה בין אוכלוסיית תאים של עניין לפני ואחרי דלדול. Cytometry זרימה אימונוהיסטוכימיה שתי שיטות טובות קביעת טוהר התא. </li></ol> נציג תוצאות בעת שימוש MAB היא היעילה ביותר בכל הפעלה, משלימים דלדול תא אחרי סיבוב אחד גדול אז 95%. זה שמוצג באיור 1 בו התחלנו עם splenocytes העכבר מורכב בתאי T 32.2% αβ כפי זוהה על ידי ביטוי TCRβ (eBioscience, סן דייגו, קליפורניה) על ידי cytometry הזרימה. אנחנו מתרוקנים שתאי T ספציפיים באמצעות מב עבור Thy1, חלבון לידי ביטוי כל ותאי T, אבל לא לויקוציטים אחרים. הנוגדן השתמשנו היה Y-19 עכברוש IgG2c 2. בעקבות ההליך המתואר, האוכלוסייה TCRβ צומצם 1.56%, ירידה גדולה יותר מאשר 95%. <img src="/files/ftp_upload/1487/1487fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. דלדול thy1 + בתאי T הטחול על ידי הפעלת המשלים. Splenocytes עכבר סך הכל התקבלו על ידי homogenization של הטחול ואת תמוגה של RBC. Anti-thy1 ו ארנב תינוק משלימים בריכוזים מראש נוספו ההשעיה תא בודד של splenocytes כזה ריכוז התא האחרון היה 1 x 10 7 תאים / מ&quot;ל. לאחר הדגרה במשך שעה 1 ב 37 ° C, התאים נשטפו פעמיים הוערכו על ידי הרחקה trypan כחול כדאיות התא. היעילות של דלדול הוערכה על ידי זרימת cytometry השוואת אחוז + תאים TCRβ לפני דלדול (פאנל משמאל) לאחר דלדול (פאנל מימין). הפס האופקי מציין מכתים חיובי ומספר מעל הבר הוא אחוז חיובי.

<ol>
	<li>Janeway, C., Travers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+System+in+Health+and+Disease.">The Immune System in Health and Disease.</a> Immunobiology. , (1994).</li><li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+activities+of+antibodies+against+brain-associated+T+cell+antigens+II.+Stimulation+of+T+cell-induced+B+cell+proliferation.">Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation.</a> Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).</li></ol>

טיהור של אוכלוסיות תאים היא הליך שכיח נדרש ללמוד את תפקידם. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה של depleting אוכלוסיות תאים באמצעות אנטיגן ספציפי לערמונית נוגדנים דלדול משלימים. דלדול האוכלוסייה בכל תא ניתן להשיג אם נוגדן משלימים-הפעלת זמין סמן מסוים בשושלת. כאן אנו הדגימו את דלדול של תאים T באמצעות ספציפי עבור MAB Thy1, חלבון לידי ביטוי בעצם כל אוכלוסיות תאים טי. אנחנו מתרוקנים מעל 95% של תאים T αβ ואת splenocytes הנותרים עלה מ% 68 ל% 98. רמה זו של תא טוהר דומה אסטרטגיות טיהור אחרים, כולל FACS והפרדה חרוז מגנטי. דלדול משלים היא טכניקה מהירה שניתן לבצע ב 1.5 שעות פעם את האוכלוסייה התא החל מתקבל. יתרון נוסף של דלדול משלימים זה במעבדה כל יכול לבצע את הטכניקה, כי היא אינה דורשת ציוד יקר ריאגנטים. רק החלקים העיקריים של הציוד הנדרש הם אמבט מים צנטריפוגות. משלימים הארנב ניתן לרכוש ממגוון רחב של ספקים במחיר סביר (ראה טבלה של ריאגנטים) ו מב רבים ניתן לרכוש ATTC גדל באופן מקומי כדי לשלוט בעלויות. לעומת זאת, FACS דורש cytometer לזרום עם קיבולת מיון התא יעלה בששת דמויות MAB מתויג fluorescently יקר. הפרדה חרוז מגנטי במחיר בינוני, אך דורש רכישת מגנט, חרוזים מגנטיים, אשר יכול להיות יקר. בנוסף, כמה אסטרטגיות מגנטי ההפרדה חרוז גם דורשים רכישה של עמודות. אבן הנגף העיקרית לשימוש משלימים עבור דלדול התא הוא הזמינות של השלמה עם הפעלת MAB סגוליות את האנטיגן הנדרשת. למרות נוגדנים אנושיים עכבר חולדה כל יש את היכולת לתקן משלימים, isotypes כמה טובים יותר מאחרים. למרות IgM מכל שלושה מינים הוא יעיל מאוד בתיקון להשלים את isotypes IgG להשתנות. כך מב כל חייב להיות הראשון נבדק במחקר ניסיוני כדי לקבוע את יעילותו. עבור נוגדנים שאינם היעילה ביותר, שני סבבים של דלדול משלימים ניתן לבצע מבלי להשפיע על הכדאיות של אוכלוסיות תאים הנותרים. כמו חיסכון בעלויות, נוגדנים יש טיטרציה עבור יעילות אופטימלית. בנוסף, נוגדנים בשימוש לא צריכים להיות מטוהרים. Hybridoma supernatants ו מיימת עבודה נוזל בדיוק כמו יעילה, אשר נוח במיוחד עבור נוגדנים IgM, אשר קשה לטהר. כמו עם הנוגדנים, קיים הכרח כי המשלים להיות טיטרציה במחקר פיילוט. ריכוז גבוה מדי תגרום לאובדן של הכדאיות של הלא ממוקד אוכלוסיות תאים. חשוב גם הוא כי זמן דגירה אינו עולה על 60 דקות. בפרוטוקול שלנו, אנחנו עמיתים דגירה הנוגדנים ואת משלימים ביחד. עם זאת, התאים יכולים להיות מתויג עם נוגדן עבור 15-30 דקות, לשטוף לפני תוספת של השלמה. כאשר משתמשים באסטרטגיה זו, הקפד לבצע את incubations נוגדן על הקרח כדי למנוע אובדן של האנטיגן התא על פני התא, כפי שקורה עם חלבונים מסוימים על ידי תיקון ו מכסת או הפנמה הקולטן. למרות היעילה ביותר, החיסרון העיקרי כדי להשלים את דלדול בהשוואה לשיטות אחרות היא שזה לא יכול לשמש סלקציה חיובית. לכן קשה להשיג subpopulations של תאים. לדוגמה, קשה יהיה לטהר את שולי B אזור תאים תאים B פוליקולרית, אשר היה הטוב ביותר לעשות זאת על ידי FACS. במצב זה, הפעלת המשלים יכול לשמש כדי לרוקן בתאי T כדי להפחית את מספר התאים להיות מיון. אסטרטגיה זו תפחית את הזמן למיין, אשר היה לחסוך כסף יהיה פחות קשות על התאים. מאז הטיהור של אוכלוסיות תאים ספציפיים היא דרישה נפוצה מספר אסטרטגיות פותחו. היתרונות העיקריים של האסטרטגיה דלדול משלימים הם, בפשטות שלה affordability טכני חיסכון בזמן.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>3-4 week baby rabbit complement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pel-Freez Biologicals</td>
<td>31061-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>various</td>
<td>various </td>
<td>An incubator set at 37 &deg;C can also be used.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

depletion of specific cell populations by complement depletion

טיהור של אוכלוסיות תאים חיסוניים נדרש לעתים קרובות כדי ללמוד פונקציות הייחודיים שלהם. ב, גישות מסוים מולקולרית כגון בזמן אמת PCR וניתוח microarray דורשים בידוד של אוכלוסיות תאים עם טוהר גבוהה. אסטרטגיות טיהור נפוצים כוללים תא פלורסנט מיון מופעל (FACS), הפרדה חרוז מגנטי דלדול משלימים. מבין שלוש אסטרטגיות, דלדול משלימים מציע את היתרונות של להיות מהר, לא יקר, עדין על תאים תא תשואה גבוהה. המערכת השלמה מורכבת ממספר רב של חלבונים פלזמה שכאשר מופעל ליזום מפל proteolytic שהגיעה לשיאה היווצרות של מורכבות קרום התקף המהווה הנקבוביות על פני שטח התא והתוצאה היא מוות של תאים<sup&gt; 1</sup&gt;. מסלול קלאסי מופעל על ידי נוגדנים IgM ו IgG ו תוארה לראשונה כמנגנון להרוג חיידקים. עם הדור של נוגדנים חד שבטיים (מב), מפל משלימים שניתן להשתמש בהם כדי lyse כל האוכלוסייה התא באופן אנטיגן ספציפי. דלדול של תאים על ידי מפל השלמה מושגת על ידי תוספת של תיקון משלימים אנטיגן ספציפי נוגדנים ומשלימים ארנב לאוכלוסייה תא ההתחלה. התאים מודגרת למשך שעה אחת בכל 37 ° C ו התאים lysed יוסרו לאחר מכן על ידי שני סבבים של כביסה. מב עם יעילות גבוהה עבור קיבוע משלים בדרך כלל לרוקן 95-100% מהאוכלוסייה תא ממוקד. בהתאם לאסטרטגיה טיהור לאוכלוסייה תא ממוקד, דלדול משלימים ניתן להשתמש לטיהור התא או להעשרה של אוכלוסיות תאים כי אז יכול להיות מטוהרים נוסף בשיטה הבאים.

Watch this Scientific Journal Video about Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion at JoVE.com

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

כדי ללמוד ביעילות את הפונקציה של אוכלוסיות תאים חיסוניים טיהור שלהם נדרש לעתים קרובות. דלדול משלים היא טכניקה מהירה וזולה עבור בידוד של אוכלוסיות תאים חיסוניים עם טוהר גבוהה.

דלדול של אוכלוסיות תאים ספציפיים על ידי דלדול משלים

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

depletion-of-specific-cell-populations-by-complement-depletion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.1K Views.  Blood Research Institute. כדי ללמוד ביעילות את הפונקציה של אוכלוסיות תאים חיסוניים טיהור שלהם נדרש לעתים קרובות. דלדול משלים היא טכניקה מהירה וזולה עבור בידוד של אוכלוסיות תאים חיסוניים עם טוהר גבוהה.

Video: Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual complement components can be quantified however this does not provide any information as to the activity of the pathway. The CH50 is a screening assay for the activation of the classical complement pathway (Fig 1) and it is sensitive to the reduction, absence and/or inactivity of any component of the pathway. The CH50 tests the functional capability of serum complement components of the classical pathway to lyse sheep red blood cells (SRBC) pre-coated with rabbit anti-sheep red blood cell antibody (haemolysin). When antibody-coated SRBC are incubated with test serum, the classical pathway of complement is activated and haemolysis results. If a complement component is absent, the CH50 level will be zero; if one or more components of the classical pathway are decreased, the CH50 will be decreased. A fixed volume of optimally sensitised SRBC is added to each serum dilution. After incubation, the mixture is centrifuged and the degree of haemolysis is quantified by measuring the absorbance of the haemoglobin released into the supernatant at 540nm. The amount of complement activity is determined by examining the capacity of various dilutions of test serum to lyse antibody coated SRBC. This video outlines the experimental steps involved in analysing the level of complement activity of the classical complement pathway.

Measuring the 50% Haemolytic Complement CH50 Activity of Serum

The classical pathway is activated by antibody and culminates in target cell lysis. The CH50 assay provides a measure of the complement activity of a serum sample. This video demonstrates the steps involved in determining the CH50 of a serum sample, the calculations and interpreting of results.

מדידת משלים Haemolytic 50% (CH 50) פעילות של סרום

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

בידוד של פידליטי גרסאות של וירוסים RNA ו אפיון תדירות המוטציה וירוס

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

דלדול המשאבים ואת הכינון מחדש של מקרופאגים בעכברים

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

ויזואליזציה של סינפסה החיסונית על ידי פליטה מאולצת דלדול מגודרת בזמן צבע כפול (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver (extravascular hemolysis) or leading to intravascular lysis of RBCs. Alloantibodies (e.g. ABO) or autoantibodies to RBC antigens (as seen in autoimmune hemolytic anemia, AIHA) leading to complement activation are potentially harmful and can be - especially when leading to intravascular lysis - fatal1. Currently, complement activation due to (auto)-antibodies on RBCs is assessed in vitro by using the Coombs test reflecting complement deposition on RBC or by a nonquantitative hemolytic assay reflecting RBC lysis1-4. However, to assess the efficacy of complement inhibitors, it is mandatory to have quantitative techniques. Here we describe two such techniques. First, an assay to detect C3 and C4 deposition on red blood cells that is induced by antibodies in patient serum is presented. For this, FACS analysis is used with fluorescently labeled anti-C3 or anti-C4 antibodies. Next, a quantitative hemolytic assay is described. In this assay, complement-mediated hemolysis induced by patient serum is measured making use of spectrophotometric&#160;detection of the released hemoglobin. Both of these assays are very reproducible and quantitative, facilitating studies of antibody-induced complement activation.

Here we describe two assays for measuring complement activation induced by antibodies against red blood cells. The major advantage over the current assays is their quantitative and easy-to-interpret nature.

שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל<em&gt; במבחנה</em&gt; דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure that optimizes B-cell receptor (BCR) signaling and BCR-mediated antigen acquisition. Both the remodeling of the actin cytoskeleton and the reorientation of the microtubule network towards the antigen contact site are essential for immune synapse formation. Remodeling of the actin cytoskeleton into a dense peripheral ring of F-actin is accompanied by polarization of the microtubule-organizing center towards the immune synapse. Microtubule plus-end binding proteins, as well as cortical plus-end capture proteins mediate physical interactions between the actin and microtubule cytoskeletons, which allow them to be reorganized in a coordinated manner. Elucidating the mechanisms that control this cytoskeletal reorganization, as well as understanding how these cytoskeletal structures shape immune synapse formation and BCR signaling, can provide new insights into B cell activation. This has been aided by the development of super-resolution microscopy approaches that reveal new details of cytoskeletal network organization. We describe here a method for using stimulated emission depletion (STED) microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and transfected GFP-tagged microtubule plus-end binding proteins in B cells. To model the early events in immune synapse formation, we allow B cells to spread on coverslips coated with anti-immunoglobulin (anti-Ig) antibodies, which initiate BCR signaling and cytoskeleton remodeling. We provide step-by-step protocols for expressing GFP fusion proteins in A20 B-lymphoma cells, for anti-Ig-induced cell spreading, and for subsequent cell fixation, Immunostaining, image acquisition, and image deconvolution steps. The high-resolution images obtained using these procedures allow one to simultaneously visualize actin structures, microtubules, and the microtubule plus-end binding proteins that may link these two cytoskeletal networks.

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

We present a protocol for using STED microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and microtubule plus-end binding proteins in B cells that have spread on coverslips coated with antibodies to the B-cell receptor, a model for the initial phase of immune synapse formation.

להמחיש את אקטין ואת Microtubule Cytoskeletons על הסינפסה B-cell המערכת החיסונית באמצעות מיקרוסקופ דלדול (STED) פליטה מאולצת

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...