Name: odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth at JoVE.com

המחברים מאשרים תמיכה עבור עבודה זו על ידי מענקים U54 RR022220 ו P50 GM076547 ל- JDA מהמכון הלאומי האמריקני לבריאות. FDM הוא פוסט דוקטורט עם המכון הקנדי לחקר הבריאות. אנו מודים גם למרכז לוקסמבורג למערכות ביו-רפואה ולאוניברסיטת לוקסמבורג לתמיכה.

<ol>
	<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li><li>Sellick, C. A., Campbell, R. N., Reece, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galactose+metabolism+in+yeast-structure+and+regulation+of+the+leloir+pathway+enzymes+and+the+genes+encoding+them.">Galactose metabolism in yeast-structure and regulation of the leloir pathway enzymes and the genes encoding them.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 269, 111-150 (2008).</li><li>Yoshikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotypic+analysis+for+identification+of+genes+affecting+growth+under+ethanol+stress+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).</li><li>Bryan, A. K., Goranov, A., Amon, A., Manalis, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mass,+density,+and+volume+during+the+cell+cycle+of+yeast.">Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 999-1004 (2010).</li><li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+fitness+and+genetic+interactions+in+yeast+on+a+genome+scale.">Quantitative analysis of fitness and genetic interactions in yeast on a genome scale.</a> Nat Methods. 7 (12), 1017-1024 (2010).</li><li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327 (5964), 425-431 (2010).</li><li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map.">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446 (7137), 806-810 (2007).</li><li>Zackrisson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scan-o-matic:+High-Resolution+Microbial+Phenomics+at+a+Massive+Scale.">Scan-o-matic: High-Resolution Microbial Phenomics at a Massive Scale.</a> G3 (Bethesda). 6 (9), 3003-3014 (2016).</li><li>Bean, G. J., Jaeger, P. A., Bahr, S., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ultra-high-density+screening+tools+for+microbial+'omics'.">Development of ultra-high-density screening tools for microbial 'omics'.</a> PloS One. 9 (1), e85177 (2014).</li><li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous,+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant.">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS Biol. 10 (5), e1001325 (2012).</li><li>Herricks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Cell+Doubling+Evaluation+by+Living+Arrays+of+Yeast.">One-Cell Doubling Evaluation by Living Arrays of Yeast.</a> ODELAY! G3 (Bethesda). 7 (1), 279-288 (2017).</li><li>Mast, F. D., Ratushny, A. V., Aitchison, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+cell+biology.">Systems cell biology.</a> J Cell Biol. 206 (6), 695-706 (2014).</li><li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+methods+of+microscope+control+using+&#181;Manager+software.">Advanced methods of microscope control using &#181;Manager software.</a> J Biol Methods. 1 (2), e10 (2014).</li></ol>

למחברים אין מה לגלות.

Assay ODLAY יש כמה נקודות קריטיות להבטחת המדידות פנוטיפי לשחזור ואמין. הנקודה הקריטית הראשונה היא הכנה עקבית של תרבויות השמרים. יש להקפיד לקצור את תאי השמרים מן הצמיחה הלוגריתמית. אם תרבויות יש רווי, אז ההטרוגניות האוכלוסייה שלהם יהיה מוגבר אשר עלול לערפל הטרוגניות הנגרמת על ידי גורמים גנטיים או סביבתיים ( למשל, מקור פחמן) 11 . הנקודה הקריטית השנייה היא הכנה עקבית של התקשורת. באופן כללי, נפח גדול של פתרון 10X מדיה מלאי צריך להיות שנוצר ולאחר מכן נעשה שימוש לאורך זמן כדי למזער את האפקטים אצווה. גיבוש מדיה לפי משקל, ככל הניתן, מסייע לשפר את עקביות המדיום לאורך זמן על ידי הבטחת צפיפות של אגר ואת התוכן הכולל של המים של agarose ניתן לפקח מקרוב. הנקודה הקריטית השלישית כוללת מזעור או ביטול כל דפורמציה מכנית של agarose אותי. דפורמציה מכנית של התקשורת תהיה הנפוצה ביותר להתרחש במהלך ההפרדה של agarose מן שקופיות הזכוכית. כמו טכניקות מעבדה רבות, בפועל נדרש לשלוט בשלב זה. שינוי בזמן בפיגור כפי שמתואר באיור 4 , קשורה לעיתים קרובות לאחד משלושת הגורמים: עיוות מכני של המדיום agarose, וריאציה בעובי אגר מעוצב, או מקור אור יציב. אם המדיום agarose משתנה Z- גובה על פני מערך מנומר, וריאציה גובה עלול להציף את טווח של שגרת פוקוס אוטומטי, גורם לתמונות הראשונית להיות קצת מחוץ להתמקד. מסיבה זו, לבדוק את גובה המיקוד במספר כתמים במרכז לאורך הקצוות של מערך הבחין כדי להבטיח את שגרת פוקוס אוטומטי יש מספיק טווח Z כדי למצוא את המיקוד. אם יש צורך, השתמש בחלונית &#39;פוקוס אוטומטי&#39; כדי להגדיל את טווח המיקוד ולהגדיל את מספר שלבי המיקוד. קונדיט שלישי אפשרייון שעלול להוביל להתמקדות ירודה הוא מקור אור לא יציב או מהבהב, אשר יכול לשבש את ציון המיקוד מחושב עבור Z- גובה מסוים. נורות הלוגן טונגסטן נוטים להבהב הרבה לפני הנורות לשרוף. ההשפעה של המיקוד לקוי הוא ציין בדוגמה אחת שבה עקומות הצמיחה לטבול בין הראשון והשני נקודות זמן ( איור 5 א ), ואילו במקום הסמוך אין לטבול אותו ( איור 5 ב &#39; ). במקרה זה, מצב המיקוד המסכן הוקל על ידי החלפת מקור האור הלוגן טונגסטן. בפועל, המחברים מצאו כי כדי להפחית את הבהוב של 100W טונגסטן נורות הלוגן, הנורות צריך להיות מוחלף כל 500 שעות או בערך כל 2 חודשים כאשר המיקרוסקופים נמצאים תחת שימוש כבד. כדי למנוע בעיות מיקוד ירודות מנורה מהבהבת, החלף את מקור האור של הלוגן טונגסטן לעיתים קרובות או החלף את נורת ההלוגן באמצעות מקור אור דיודה. Anדוגמא למערך המציג וריאציה נמוכה בזמני ההכפלה וכן זמני פיגור אחידים יותר מוצגים באיור 6 . מערך נתונים זה נלקח עם דיודה מאיר אשר מספק תאורה יציבה יותר לאורך זמן תוך ביצוע פוקוס אוטומטי. בעוד שרבים מהנקודות שהוזכרו כאן לאופטימיזציה של הכנת המדיה עשויות להיות מובנות מאליהן, בספרות המסכים הגדולים ביותר לא משכפלים היטב זה עם זה 8 , 11 . לכן, יש לנו תיאר בקפידה את ההכנה של תרבויות התקשורת agarose כך מסכי פנוטיפי לשחזור יותר עשוי להיווצר. Assay ODLAY מוגבל כעת התפוקה בהשוואה להצמדת מבחני מבוסס כגון מערכים גנטיים סינתטיים או assay Scan-O-Matic. בעוד שיטות אלה להגדיל את מספר זנים נמדדים, הם חסרים יכולת לפתור תאים בודדים אNd ולכן לא ניתן למדוד הטרוגניות האוכלוסייה שאנו רואים בתוך זנים שמרים משובטים. מקור ההטרוגניות של אוכלוסייה זו אינו מובנת כיום, אך מיזוג הטכנולוגיה והחישוב כפי שמוצג כאן מציע הזדמנות להתייחסות אובייקטיבית למנגנונים הסלולאריים הבסיסיים 12 . המחברים מבקשים לציין כי ODELAY כרגע מותאם רק עבור מותג מיקרוסקופ מסוים סוג הגוף. שינוי ODLAY עבור מערכות מיקרוסקופ אחרות הוא ישר קדימה אבל ידרוש ידע של קוד פתוח 13 API. עם זאת, הן ה- API, כמו גם את הסקריפטים ODELAY כתובים להיות מותאמים בקלות למערכות שונות מבחני ניסיוני. בעוד ODELAY פותחה במקור עבור שמרים, היינו מסוגלים לנצל את זה ללא שינוי כדי לבחון את הצמיחה של Mycobacterium smegmatis . תצפית של המושבה האחרת להרכיב מיקרואורגניזמים הואאפשרי עם שינויים בקוד המקור שסופק 11 . באופן כללי, ODELAY הוא כלי רב עוצמה וגמיש להשוואת מיקרואורגניזמים הגדלים בתנאים סביבתיים שונים הפרעות גנטיות.

פנוטיפים גדילה של מיקרואורגניזמים הם אינדיקציה חזקה של הכושר הגנטי הבסיסי שלהם למצב סביבתי נתון. הצמיחה מופרדת באופן קלאסי לשלושה משטרי צמיחה שונים: שלב השלב, שלב הפאזה וצמיחת פאזה נייחת 1 . כל שלב גדילה יכול לגלות היבטים שונים של כושר התלויים בתנאים סביבתיים וגנטיים שונים. לדוגמה, זמן השהיה, או משך הזמן האורגניזם מבלה בשלב השהיה לפני תחילת הצמיחה מעריכי, יכול להצביע על יכולתו של אורגניזם להגיב לתנאים סביבתיים שונו 2 . הכפלת זמן הגידול במהלך שלב הפלט, המדד הנפוץ ביותר של כושר הסלולר, מגלה את היעילות הכוללת של יכולתו של אורגניזם לחלק על ידי חילוף החומרים ושימוש בחומרים סביבתיים לשכפול. שלב נייחים, שבו הצמיחה לאחר שלב יומן מופחת במהירות, הוא אינדיקטור נוסף של כושר, שהוא קבועLy משמש נקודת סיום הצמיחה במקום מבוססי מבחני שמרים צמיחה. כמה שמרים צמיחה שמרים זמינים כיום נחשב שיטות סטנדרטיות להערכת פנוטיפים הצמיחה בשמרים 3 , 4 , 5 . מבחני אלה מבוססים בעיקר על שיטות גידול שמרים או על מוצק או בתקשורת נוזלית. על מוצק התקשורת, המושבה להצמיד מבחני להעביר מספר קטן של תאים על גבי אגר מוצק עם סיכה, תאים שמרים מותר לגדול לתקופה מוגדרת של זמן. המושבות הם צילמו ואז הגודל שלהם מושווים בנקודת קצה מסוף 6 . אלה מושבות pinning המושבה הוכיחו חזקים וניתן להרחבה כדי ליצור מסך רחב הגנום. לאחרונה, הדמיה תקופתית באמצעות סורקים שטוחה שטוח עדשות יחיד רפלקס (SLR) מצלמות שולבו אלה מבחני להקליט צמיחה המושבה לאורך זמן 7 , 8, 9 . עם זאת, הפתרון של התקנים אלה מונע מהם לגלות תאים בודדים ולכן, אלה מושבות הצמיד המושבה לא ישירות לצפות בפיגור זמן ולא ניתן להבחין וריאציה בין תאים בודדים לגדול לתוך מושבות. מבחני צמיחה מבוססי נוזלים הועסקו גם כדי לבצע מסכי גנום רחבים 3 . צימוד assay צמיחה נוזלית עם מיקרוסקופ זמן לשגות חשף ההטרוגניות האוכלוסייה בזמן הכפלת תאים בודדים זהים גנטית, אשר מציעה נקודת מבט חשובה להבנת רגולציה גנטית הסתגלות סביבתית. עם זאת, assay זה אינו מודד היבטים אחרים של צמיחה כגון זמן השהיה כושר נשיאה 10 . כאן אנו מציגים שיטה לאפיין את כל שלבי הצמיחה של המושבה להרכיב מיקרואורגניזמים על מדיה מוצקה באמצעות assay אנחנו מונח ODELAY 11 . ODELAY מורכב utiliZing גבוהה התפוקה זמן לשגות מיקרוסקופ כדי להקליט תמונות של תאים בודדים גדל לתוך מושבות על מוצק התקשורת. אוכלוסייה זו של תאים בודדים הגדלים לתוך מושבות מגלה את ההטרוגניות הבסיסית של האוכלוסייה, אשר לא זוהה על ידי מדידות פחות רגישות אחרות כגון ניקוד נקודות קצה סופיות. אנו מדגימים את השיטה על שמרים, אבל ODELAY ניתן להחיל על כל אורגניזם זה מראה בניגוד מיקרוסקופ שדה בהיר.

<table><tbody><tr><td>Agarose UltraPure</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm</td></tr><tr><td>Yeast Extract Peptone (YEP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Complete Suplement Mixture (CSM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP114560222</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P2906</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Strain BY4741</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4741</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Strain BY4742</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4742</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>1 case</td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate flat bottom</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Hydra liquid handleing robot</td><td>Thermo</td><td>1096-DT-100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydra 100 mL tips Extended Length DARTS</td><td>Thermo</td><td>5527</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Plate Reader</td><td>Biotek</td><td>H4MLFAD</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 10X/0.3NA objective</td><td>Leica</td><td>11506289</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB with image processing tool box</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroManager</td><td>Open Imaging</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software</td></tr><tr><td>ODELAY Microscope Chamber</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings</td></tr><tr><td>ODELAY Agar Molds</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings</td></tr></tbody></table>

odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth

פנוטיפים גדילה של מיקרואורגניזמים הם אינדיקטור חזק של הכושר הגנטי הבסיסי שלהם וניתן להפריד בין 3 משטרי צמיחה: שלב בפיגור, שלב שלב, שלב נייח. כל שלב גדילה יכול לגלות היבטים שונים של כושר הקשורים לתנאים סביבתיים וגנטיים שונים. מדידות ברזולוציה גבוהה וכמותית של כל 3 שלבי הצמיחה הם בדרך כלל קשה להשיג. כאן אנו מציגים שיטה מפורטת לאפיין את כל השלבים 3 צמיחה על מדיה מוצקה באמצעות assay שנקרא תא בודד הכפלת הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). ODLAY מכמת פנוטיפים הצמיחה של תאים בודדים גדל מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ. שיטה זו יכולה ישירות לבחון את ההטרוגניות האוכלוסייה עם כל פרמטר הצמיחה בתאים זהים גנטית גדל מושבות. הטרוגניות אוכלוסייה זו מציעה נקודת מבט ייחודית להבנת רגולציה גנטית ואפיגנטית ותגובותהפרעות גנטיות וסביבתיות. בעוד שיטת ODLAY מודגם באמצעות שמרים, זה יכול להיות מנוצל על כל המושבה היוצרים מיקרואורגניזם זה גלוי על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר.

<html> תמונות לדוגמה של שמרים גדל במיקרוסקופ זמן לשגות מוצגים באיור 3 ב . לאחר עיבוד הזמן לשגות תמונות, נתונים נציג קבוצה השוואת זנים שמרים BY4741 &amp; BY4742 מוצג באיור 4 . במערך זה לדוגמה, יש וריאציה מעט מאוד זמן הכפלה בין עמדות שונות על הצלחת. אם בינוני agarose מוכן כראוי, אז סטייה ברורה הן זמן הכפלת זמן השהיה יהיה ברור עמדות נקודה חופפות עם האזור המעוות של ג&#39;ל agarose. בעוד שכפול פעמים נראה אחיד יחסית, דוגמה זו מציגה שינויים במידות הזמן בפיגור. מערך נתונים עקבי יותר מוצג באיור 6 . במערך זה זמן הפיגור וכפל הזמן הם אחידים. <html> Files / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: אגר עובש עובש. הרכיבים של עובש אגר מוצגים ב ( א ). להרכיב את הבסיס כפי שמוצג ב ( B ) ולאחר מכן מהדק את הבסיס עם קליפים קלסר קטן. מניחים את החלקים זקוף יותר בחלל של הבסיס ( ג ) ולאחר מכן המחנה שקופיות עובש כפי שמוצג ( D ). מבט צד מראה את הזווית של התבנית ואת הכיוון של קרף עובש הדרוש הפרדה עקבית של אגר מן השקופית זכוכית ( E ). הערה המיקום של האגודל ואת האצבע, כמו גם את הקו הישר של אגר להפריד את השקופית ( F ) ולשים לב את החץ האופקי. קו ההפרדה צריך לנוע באופן שווה לכיוון החצים האנכיים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> = &quot;Jove_content&quot; עבור: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> איור 2: שיטת סוניקציה ואיתור. Sonicate את הצלחת במים הקרח באמצעות מחזיק דלי צנטריפוגות לעזור לתמוך את הצלחת ( א ). הנח את הצלחות ממדרגות 3.8.1 החוצה לזיהוי על צלחת agarose ( B ). כמו כן, לארגן את הטיפים כך את הקצה השמאלי ביותר קצה יש עצה אחת במצב C10 ולאחר מכן ארבעה טיפים אחרים עם הקצוות שלהם מנותקים כך שהם לא לקרוס את מחזיק צלחת ( ג ). מניחים את הטיפים הנותרים בארבעה קופסאות כך שהמקומות הפנימיים של 24 הטייסים כבושים ( D ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3: ODELAY ממשק משתמש גרפי. צילום מסך של ממשק משתמש גרפי עבור &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot; ( A ). ממשק זה מאפשר ניטור של המצלמה עבור התאמת הגדרות תאורה מיקרוסקופ עבור מצבי epifluorescent ובהיר שדה. החצים האדומים מצביעים על הלחצנים &#39;פוקוס&#39; ו&#39;מעבר &#39;המפעילים את המצלמה כדי לרכוש תמונות במהירות ולפתוח את תריס האור המועבר בהתאמה. החצים הכחולים משמשים להעתקת הבמה למקור ולאחר מכן הגדרת המקור עם הלחצן &quot;Go Origin&quot; ו- &quot;Set&quot;. חיצים ירוקים מצביעים על &quot;אפס&quot; ו &quot;ODELAY !!!&quot; לחצנים המאפסים מצבי תמונה של ODELAY לתנאים הנוכחיים ומפעילים אוסף תמונות של ODELAY. זמן לשגות תמונות של שמרים גדל על בינוני מוצק ב 0, 3, 6, ו 9 שעות לאחר תצפית ( ב ). צילום מסך של ממשק המשתמש הגרפי עבור &quot;ODELAY_IPT.m&quot; או th<html> עיבוד תמונה כלי ( C ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> איור 4: דוגמה פלט ODLAY. מערך נתונים זה משווה זנים BY4741 ו BY4742 על מדיה YPD. נתון זה הוא דוגמה של שקף agarose מוכן היטב; עם זאת, הגדרות פוקוס אוטומטי אינן אופטימליות. הנתונים המוצגים בכל עמוד, משמאל לימין, הם: יכולת הנשיאה ביומן 2 באזור המושבה; הכפלת הזמן, נתון דקות; ו בפיגור זמן, נתון דקות. בדוגמה זו, פעמים הכפלה של כל הכתמים על קו השקופית אגר למעלה גם עם כמות קטנה של זמן הכפלת כפול לכיוון העמודה. עם זאת, פעמים בפיגור להשתנות במידה ניכרת במערך זה._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> איור 5: דוגמאות לעקומת הצמיחה. דוגמה זו ממחישה כיצד המיקוד הראשוני המסכן עלול לגרום לזמן השהיה המשוער (t lag ) להגדלה ( A ), ואילו המיקום הסמוך מציג זמן פיגור קצר יותר ( B ). T d הוא זמן הכפלת דקות, ו l בפיגור הוא זמן השהיה דקות. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> איור 6: דוגמה לניסוי המבוצע בהצלחה. הXample של זן BY4742 נבדק לאחר החלפת נורת הלוגן טונגסטן עם מנורה דיודה ולהבטיח את המיקוד האוטומטי מוגדר כראוי. נראה כי כל זמני ההכפלה חופפים היטב והזמן בפיגור נראה עקבי. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth at JoVE.com

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

אנו מציגים שיטה לכימות פנוטיפים הצמיחה של תאים שמרים בודדים כפי שהם גדלים לתוך מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ בשם, אחת הכפלה הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). הטרוגניות האוכלוסייה של תאים זהים גנטית גדל לתוך מושבות ניתן לצפות ישירות לכמת.

ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

odelay-large-scale-method-for-multi-parameter-quantification-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Views.  Institute for Systems Biology.  אנו מציגים שיטה לכימות פנוטיפים הצמיחה של תאים שמרים בודדים כפי שהם גדלים לתוך מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ בשם, אחת הכפלה הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). הטרוגניות האוכלוסייה של תאים זהים גנטית גדל לתוך מושבות ניתן...

Video: ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetics

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

כימות כרונולוגי שמרים תוחלת החיים על ידי תולדה של תאים בני

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are used as models in lipid metabolic research or for industrial lipid production. Lipid droplets are highly dynamic storage bodies and their cellular content represents a convenient readout of the lipid metabolic state. Fluorescence microscopy is a method of choice for quantitative analysis of cellular lipid droplets, as it relies on widely available equipment and allows analysis of individual lipid droplets. Furthermore, microscopic image analysis can be automated, greatly increasing overall analysis throughput. Here, we describe an experimental and analytical workflow for automated detection and quantitative description of individual lipid droplets in three different model yeast species: the fission yeasts Schizosaccharomyces pombe and Schizosaccharomyces japonicus, and the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Lipid droplets are visualized with BODIPY 493/503, and cell-impermeable fluorescent dextran is added to the culture media to help identify cell boundaries. Cells are subjected to 3D epifluorescence microscopy in green and blue channels and the resulting z-stack images are processed automatically by a MATLAB pipeline. The procedure outputs rich quantitative data on cellular lipid droplet content and individual lipid droplet characteristics in a tabular format suitable for downstream analyses in major spreadsheet or statistical packages. We provide example analyses of lipid droplet content under various conditions that affect cellular lipid metabolism.

Here, we present a MATLAB implementation of automated detection and quantitative description of lipid droplets in fluorescence microscopy images of fission and budding yeast cells.

ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Immunology and Infection

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

ניתוח מדויק, תפוקה גבוהה של התפתחות חיידקים

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The fermentable carbon concentration mainly governs how the yeast cells generate ATP; thus, the variation in fermentable carbohydrate levels drives the energetic metabolism of S. cerevisiae. This paper describes a high-throughput method based on exponential yeast growth to estimate the effects of concentration changes and nature of the carbon source on respiratory and fermentative metabolism. The growth of S. cerevisiae is measured in a microplate or shaken conical flask by determining the optical density (OD) at 600 nm. Then, a growth curve is built by plotting OD versus time, which allows identification and selection of the exponential phase, and is fitted with the exponential growth equation to obtain kinetic parameters. Low specific growth rates with higher doubling times generally represent a respiratory growth. Conversely, higher specific growth rates with lower doubling times indicate fermentative growth. Threshold values of doubling time and specific growth rate are estimated using well-known respiratory or fermentative conditions, such as non-fermentable carbon sources or higher concentrations of fermentable sugars. This is obtained for each specific strain. Finally, the calculated kinetic parameters are compared with the threshold values to establish whether the yeast shows fermentative and/or respiratory growth. The advantage of this method is its relative simplicity for understanding the effects of a substance/compound on fermentative or respiratory metabolism. It is important to highlight that growth is an intricate and complex biological process; therefore, preliminary data from this method must be corroborated by the quantification of oxygen consumption and accumulation of fermentation byproducts. Thereby, this technique can be used as a preliminary screening of compounds/substances that may disturb or enhance fermentative or respiratory metabolism.

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Here we present a protocol to estimate the respiratory and fermentative metabolism by fitting the exponential growth of Saccharomyces cerevisiae to the exponential growth equation. Calculation of the kinetic parameters allows for the screening of influences of substances/compounds on fermentation or mitochondrial respiration.

שמר האפייה קינטיקה גידול אקספוננציאלי בתרבות אצווה כדי לנתח את חילוף החומרים הנשימה ואת Fermentative

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...