ITSN, PI3K-C2β ו וקטורים לשלוט בשימוש בפרוטוקול זה זמינים המחברים על פי דרישה, עבור לא מסחריות בלבד. המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר צ&#39;אנג הו דנג עבור חביב במתן ייעוץ ו ריאגנטים השתמשו בהקמת פרוטוקול BiFC במעבדה O&#39;Bryan. Kaw נתמך על ידי מימון של ג&#39;רום קרן לז&#39;ן. עבודה במעבדה O&#39;Bryan נתמך על ידי תרומות של (HL090651) NIH, DOD (PR080428), קרן Baldrick סנט, ואת ג&#39;רום קרן לז&#39;ן.

א BiFC כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר fluorophore. ישנם fluorophores מרובים, כגון YFP ונוגה, שפועלים גם שותפים BiFC היתוך (טבלה 1). מסתיים אמינו ו-carboxy הטרמינל של ונוס מסוגלים ליצור מורכבות על 37 מעלות צלזיוס, בעוד שברי BiFC YFP דורשים הדגירה טרום ב 30 ° C כדי להקל על היווצרות fluorophore 2. זה הדגירה בטמפרטורה נמוכה עשויה לשנות כמה תהליכים תאיים וצריך להילקח בחשבון בעת ​​בחירת שברים. וקטורים עבור פיוזינג ונוס הסופית carboxy-של חלבונים זמינים Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/pgvec1">http://www.addgene.org/pgvec1</a> ; seepBiFC-VN173 ו-VC155 pBiFC) יחד עם מבנים נוספים לשימוש שולטת, למשל, <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> ו pBiFC-bFosVC155 2. וקטורים נוסף, לרבות אמינו מסוף וקטורים ונוס (pFLAG VN173 ו-PHA-VC155), זמינים בכתובת האתר הבא: <a href="http://people.pnhs.purdue.edu/%7Ehu1/">http://people.pnhs.purdue.edu/ hu1 ~ /</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תג החלבון של עניין. שברי BiFC הם התמזגו מסתיים אמינו או carboxy-הטרמינל של חלבונים מועמד. חלבונים מסוימים עשויים שלא לאפשר תיוג בסוף או בשל הפרעה של תפקוד החלבון. לדוגמה, רבים מבני superfamily ראס של GTPases הם השומנים שונה בכל התקשרות carboxy-הסופית ובכך מניעת של שברי BiFC בסוף זה. לפיכך, חשוב לקבל קצת מושג איך הקובץ המצורף של שברי BiFC עשוי להשפיע על התפקוד של חלבונים של עניין. אם לא ברור כיצד תיוג חלבון ישפיע שילובים פונקציה מרובים שלה צריך להיבדק. בנוסף בקטע BiFC, והמקשר פפטיד עשוי להיכלל להגדיל את הגמישות בין fluorophore מקוטעת החלבונים מועמד. בעוד אתרי שיבוט מרובים (MCS) ב וקטורים BiFC לקודד קצר מותח חומצת אמינו אשר עשויים לספק גמישות מספקת, RSIAT, KQKVMNH ו linkers RPACKIPNDLKQKVMNH שימשו בהצלחה בניסויים BiFC 3,9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע תנאים transfection. בדיקות לפני מוטציות רבות, ניסויים לשלוט כמה צריך להתבצע. שני הראשונים שילובים BiFC כי יש לנסות הם שני חלבונים סוג בר שידוע כי הם אינטראקציה מסוג אחד פרוע מוטנטים שאינם אינטראקציה. באמצעות שני אלה שילובים, כמויות שונות של דנ&quot;א פעמים transfection צריך להיבדק כדי לקבוע התנאים האופטימליים לאיתור אות BiFC עבור חלבונים מועמד. מומלץ לבדוק 0.25ug, 0.5ug, 1.0ug של לבנות כל BiFC עבור יחיד גם מנה 6 באר. למחרת לפקח תאים transfection על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע זמן אופטימלי לפיתוח האות. <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">PBiFC-bJunVN173</a> ו-pBiFC bFosVC155 2 בונה הם שולטת חיובית שימושי BiFC ו זמינים Addgene (ראה לעיל). בנוסף, ניתוח המערבי כתם יש לבצע על מנת לאשר ביטוי שווה של בונה. התנאים צריכים להיבחר כך אות ניאון הוא ציין בין שני חלבונים סוג בר, אבל לא מעט כדי לאותת הוא ציין בין סוג בר חלבונים מוטנטיים. לבסוף, היא הטובה ביותר לשמור על ביטוי החלבון נמוך ככל האפשר כדי למנוע כל אי - אינטראקציות ספציפיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע אם תוספת של שברי BiFC משנה את לוקליזציה של חלבונים של עניין. כל לבנות BiFC מכיל גם HA או epitope תג הדגל. Immunostain transefected תאים HA הן או epitope תג הדגל וכן גם את החלבון אנדוגני (במידת האפשר) כדי לקבוע אם תג BiFC משפיע לוקליזציה של חלבונים של עניין. </li></ol> ב ציפוי ו transfection של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים COS (1.3x10 5) הם אחד על אחד מצופה צלחת תחתית זכוכית Matek ושתי בארות צלחת 6-באר לדגימה. אפשר תאים להתיישב לילה בשעה 37 ° C. סוגי תאים חלופיים שרלוונטיים יותר את החלבונים מועמד הריבית עשוי לשמש גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן DNAs עבור transfection. בדרך כלל אנו מנצלים Lipofectamine (Invitrogen) עבור transfections COS. עם זאת, ריאגנטים אחרים עשויים להיות מתאימים יותר עבור הקו הסלולרי של עניין. מאז תערובת transfection יפוצל בין מנה כוס אחת התחתונה שתי בארות של צלחת 6-היטב, השתמש את הכמות המתאימה של ה-DNA כדי להסביר את החלוקה הזאת. מדולל דנ&quot;א 250uL של נסיוב חינם (SF) DMEM. הוסף CFP את כמות 1 / 5 של DNAs BiFC סך כביקורת transfection. עבור כימות BiFC, התאים רק שהם חיוביים CFP ינותחו נוכחות של אות BiFC. שים לב ספקטרה CFP תהיה חפיפה עם כמה זוגות BiFC בטבלה 1, ולכן פקד transfection חלופיצריך אולי. מדולל ב Lipofectamine 250uL SF DMEM (10uL Lipofectamine/1ug של ה-DNA). מערבבים את הדנ&quot;א דילולים Lipofectamine. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20min. הערה: Lipofectamine: יחס ה-DNA יכול להשתנות בהתאם לסוג התא. השתמש בשיטה transfection מתאים לקו הנייד של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים 2x חם עם SF DMEM. הוסף 2ml של המדע הבדיוני DMEM על כל צלחת זכוכית התחתון או גם של המנה 6 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול כל התערובת באופן שווה בין transfection צלחת כוס אחת התחתונה שתי בארות מנה 6 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות 5hrs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה transfection ולהחליף עם התקשורת מלאה (DMEM 10% FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים לילה בשעה 37 ° C. משך הדגירה transfection הבאים ישתנו בהתאם ברמות הביטוי של חלבונים של עניין. דגירה ממושכת עלולה לגרום לאינטראקציה לא מוגדרים כך שלב זה יהיה צורך נקבע באופן אמפירי. </li></ol> ג הכנת תאים עבור הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם בדקו בתחילה תחת מיקרוסקופ epifluorescent כדי להבטיח שליטה חיובית ניאון. אם לא, זה עשוי להיות נחוץ כדי לאפשר לתאים זמן נוסף על 37 מעלות צלזיוס עד אות הוא ציין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים 3x עם PBS (pH 7.4). כדי התאים בצלחת תחתית זכוכית paraformaldehyde להוסיף 2% (pH 7.4). תקן תאים 10min על הקרח. יש לשטוף את התאים 3x עם PBS (pH 7.4). תאים חנות ב 4 ° C מכוסה 1mL PBS (pH 7.4). תאים לא צריך להיות קבוע עבור הדמיה, אבל ברגע שברי BiFC הרפורמה fluorophore שלם הוא ניתוח ובכך למנוע הפיכה של אינטראקציות דינמי 3. כמו כן, יש לזכור כי תאים מבולבל תמשיך לפתח האות. Lyse התאים בצלחת 6-הבאר להכין lysates לניתוח כתם המערבי. חשוב כי כל התאים מוכנים באותו זמן כל כך התאים lysed מייצגים את התאים הדמיה. </li></ol> ד דימות תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוצמת הקרינה יחושב לכל תא. הקפד תאים תמונה בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CFP נכלל כביקורת tranfection ורק תאים חיובי CFP שנבחרו לניתוח אותות BiFC. אנחנו עושים את ההנחה כי אם התא transfected עם CFP, הוא transfected גם עם בונה BiFC. גישה זו מבטיחה כי התאים אשר צילמו חוסר איתות BiFC הן שליליות בשל חוסר של אינטראקציה בין החלבונים של עניין ולא בשל העדר של אחד או שני מבנים BiFC ביטוי באותו תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים LSM Zeiss 510 מיקרוסקופ confocal הדמיה התא. בעת שימוש במיקרוסקופ חשוב לשמור את הזום, חריר, לזכות גלאי, מגבר אופסט, גודל המסגרת, מהירות סריקה, סריקה ממוצע, וכוח לייזר עקבי. כאשר משתמשים בכל מערכת הדמיה חשוב לשמור הגדרות קבוע כך שההנהרה להשוות בין דגימות. כמו כן, כאשר כימות הקרינה חשוב פיקסלים לא רוויים. </li></ol> א כימות הקרינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fluorescence ניתן לכמת באמצעות כל תוכנת הדמיה. אנו מנצלים ImageJ אשר זמין באופן חופשי מ-NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/). פתיחת קבצי תמונה ImageJ. עבור מדידות AnalyzeSet. סמן את התיבות עבור שטח ו Mean ערך גריי בתיבת המדידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הכלי &#39;בחירה יד חופשית &quot;, לצייר מתאר מסביב לקצה של התא כולו בערוץ CFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השארת זה המתאר במקום, משמרת לערוץ YFP. עבור AnalyzeMeasure. ערך אפור ממוצע הוא סכום של ערכי האפור של כל הפיקסלים בבחירה מחולק במספר של פיקסל (כלומר, את עוצמת הקרינה הממוצעת באזור של התא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תמונה לצייר עיגול בערוץ YFP באזור שאינו מכיל תאים. קחו מדידה עבור אזור זה כרקע. נפחית את הרקע של כל תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערך ממוצע האפור ממוצע מינוס על רקע כל התאים צילמו במדגם אחד. זו תהיה עוצמת הקרינה הממוצעת בקרב האוכלוסייה של תאים. היינו ממליצים על 60 תאים במשך שלושה ניסויים לכימות. </li></ol> פ נציג תוצאות: המעבדה שלנו מתמקדת חלבון רב בתחום פיגומים, intersectin (ITSN) אשר מקיים אינטראקציה עם חלבונים רבים להסדיר הביוכימיים והאיתות מספר 10,11,12,13,14. ITSN מכיל שני Eps15 הומולוגיה (EH) תחומים, אזור מפותל, מפותל, וחמישה הומולוגיה Src 3 (SH3) תחומים. איזופורם יותר של ITSN מכיל גם הומולוגיה DBL (ד&quot;ה) ו pleckstrin (PH) הומולוגיה תחומים לפעול בתיאום כגורם חילופי גואנין נוקלאוטיד עבור Cdc42 15. זהו מבנה מודולרי מקדמת חלבון: אינטראקציות חלבון וגורם ITSN מועמד אידיאלי עבור ניסויים BiFC. לוקליזציה של subcellular ITSN יכול לשנות את השותפים שלה, ולכן מחייב לשנות את המסלולים מוסדר על ידי ITSN (unpublisהד נתונים). לאחרונה במעבדה שלנו הוכיחה כי ITSN מסדיר הישרדות העצבית באמצעות רגולציה של רומן בכיתה השנייה PI3K, PI3K-C2β 11. אמינו מסוף Pro עשיר של תחום C2β-PI3K מכיל שני אתרי קישור תחומים SH3 של ITSN. באמצעות שיתוף immunoprecipitation עם ITSN PI3K ו-C2β מוטנטים גמימה הראינו כי SH3A ITSN של תחומים SH3C אינטראקציה עם האזור אמינו הטרמינל של C2β-PI3K. בשלב הבא, השתמשנו BiFC לדמיין את לוקליזציה subcellular של מורכבות זו. ITSN היה התמזגו אמינו הסופית של ונוס (pFLAG-VN173) ו-PI3K C2β בונה התמזגו carboxy-הסופית של ונוס (PHA-VC155). כפי בקרה אחר שלילי, פפטיד הלא ספציפית היתה התמזגו PHA-VC155. VN-ITSN ו-VC-PI3K C2β יצרו מורכבות BiFC עם הפצה לפסק (איור 2A, לוחות העליונה). מוטציות תחום Pro עשיר של C2β-PI3K כי לשבש את שיתוף משקעים של ITSN PI3K ו-C2β ירד האות BiFC (איור 2A, לוחות נמוך) 11. זה ההבדל בין אות BiFC ITSN ושני PI3K-C2β חלבונים לא היה בשל ההבדלים ביטוי חלבון (תרשים 2B). <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig1.jpg" alt="איור 1" /> . באיור 1 ב BiFC, fluorophore (במקרה זה ונוס) מחולק אמינו (VN) - ו carboxy (VC), מסוף מסתיים. קצוות אלה התמזגו שני החלבונים של עניין. כאשר שני החלבונים אינטראקציה, שברי VN ו VC שייך מחדש וכתוצאה מכך הכינון מחדש של fluorophore ואת הקרינה באתרים של אינטראקציה. BiFC היא דוגמה ספציפית של assay שבר השלמה חלבון (PCA) למדידת חלבון: אינטראקציות חלבון 5. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ITSN PI3K ו-C2β צורה מורכבת BiFC. א VN-tagged ITSN היה שותף tranfected עם VC-tagged PI3K C3β-WT או תחום פרולין עשיר מוטציה (PI3K-C2β-PA). ITSN ו-WT PI3K C2β צורה מורכבת (ירוק). CFP (אדום) שימש שליטה transfection ב כתם המערבי בוצעה להפגין ביטוי שווה של בונה. VC-tagged בונה מתויגים HA. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643table1.jpg" alt="טבלה 1" /> טבלה 1. ישנם מספר וקטורים התואמים BiFC. YN155: 1-155aa של YFP; YC155: 155-238aa של YFP; YN173: 1-172aa של YFP; YC173, 173-238aa של YFP; VN155: 1-154aa של ונוס; VC155: 155-238 של ונוס; VN173: 1-172aa של ונוס; VC173: 173-238aa של ונוס; CN155 1-154aa של CFP; CC155-155 238aa של CFP, GN173: 1-172aa של ה-GFP, CitN155: 1-155aa של סיטרין, CitC155: 155-238aa של סיטרין, CitN173: 1-172aa של סיטרין, CitC173: 173-238aa של סיטרין, CerN173: 1-172aa של Cerulean 2,3,9.

<ol>
	<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+interactions+by+fluorescence+complementation.">Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40, 61-66 (2006).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+by+protein+fragment+complementation+strategies.">Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies.</a> Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).</li><li>Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+strategies+to+delineate+MAP+kinase+signaling+pathways+using+protein-fragment+complementation+assays+(PCA).">Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA).</a> Methods. 40, 287-293 (2006).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li><li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).</li><li>Martin, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+regulates+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis,+ubiquitylation,+and+signaling.">Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling.</a> Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).</li><li>Das, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuron+survival+through+an+intersectin-phosphoinositide+3'-kinase+C2beta-AKT+pathway.">Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway.</a> Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).</li><li>Mohney, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+activates+Ras+but+stimulates+transcription+through+an+independent+pathway+involving.">Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving.</a> JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).</li><li>Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+can+regulate+the+Ras/MAP+kinase+pathway+independent+of+its+role+in+endocytosis.">Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).</li><li>Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+an+adaptor+protein+involved+in+clathrin-mediated+endocytosis,+activates+mitogenic+signaling+pathways.">Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways.</a> J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).</li><li>O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogenesis+and+endocytosis:+What's+at+the+INTERSECTIoN?.">Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN?.</a> Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET.">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

BiFC היא שיטה מצוינת חזותי חלבון: אינטראקציות חלבון בתאים שלמים בקביעת לוקליזציה subcellular של קומפלקסים אלה. היתרונות של BiFC הן כי רק חלבונים אינטראקציה הם פלורסנט, אינטראקציות חולף הם התייצבו, שלאחר עיבוד של הנתונים הדמיה היא מינימלית. שני החסרונות של שיטה זו הינם זמן ההב?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-013</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>35-011-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matek</td>
<td>P35G-1.5-14C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>35-3846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18324020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>21-031-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>LSM510 META</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation

הגדרת הפצה subcellular של קומפלקסים איתות הכרחי להבנת פלט מורכב. בשיטות המקובלות כגון immunoprecipitation אינם מספקים מידע על לוקליזציה המרחבי של קומפלקסים. לעומת זאת, BiFC מנטר את האינטראקציה מידור subcellular של קומפלקסים חלבונים. בשיטה זו, חלבון fluororescent מחולק ללא פלורסנט שברי אמינו ו-carboxy מסוף אשר התמזגו אז שני החלבונים של עניין. אינטראקציה של תוצאות חלבונים הכינון מחדש של fluorophore (איור 1) 1,2. הגבלה של BiFC היא שברגע fluorophore מקוטעת הוא מחדש המתחם הוא בלתי הפיך 3. מגבלה זו יש יתרון באיתור אינטראקציות חולף או חלש, אבל מונע ניתוח הקינטית של דינמיקה מורכבת. אזהרה נוספת היא כי flourophore מחדש דורש 30 דקות להבשיל לזרוח, שוב מניעת התצפית של אינטראקציות בזמן אמיתי 4. BiFC היא דוגמה ספציפית של assay שבר השלמה חלבון (PCA) המעסיקה חלבונים הכתב כגון ירוק גרסאות חלבון פלואורסצנטי (BiFC), dihydrofolate רדוקטאז, ב-lactamase, ו בלוציפראז למדוד חלבון: אינטראקציות חלבון 5,6. שיטות חלופיות ללמוד חלבון: אינטראקציות חלבון בתאים כוללים העברת הקרינה שיתוף לוקליזציה פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) 7. עבור לוקליזציה משותפת, שני חלבונים מתויגים בנפרד במישרין עם fluorophore או עקיף על ידי immunofluorescence. עם זאת, גישה זו מובילה רקע גבוהה של אי - אינטראקציה חלבונים ולכן קשה לפרש שיתוף לוקליזציה נתונים. בנוסף, בשל מגבלות רזולוציה של מיקרוסקופיה confocal, שני חלבונים עשוי להופיע ללא שותף מקומי בהכרח אינטראקציה. עם BiFC, הקרינה היא נצפתה רק כאשר שני החלבונים עניין אינטראקציה. סריג הוא עוד שיטה מצוינת ללימוד חלבון: אינטראקציות חלבון, אבל יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית. סריג ניסויים דורשים את התורם acceptor להיות של בהירות stoichiometry דומים בתא. בנוסף, יש להסביר לדמם דרך של התורם לתוך התעלה acceptor ולהיפך. בניגוד סריג, BiFC יש קצת רקע הקרינה, קצת פוסט עיבוד של נתוני התמונה, אינו מחייב overexpression גבוה, והוא יכול לזהות אינטראקציות חלשות או חולף. תהודה פליטת אור העברת אנרגיה (ברט) היא שיטה דומה סריג פרט התורם הוא אנזים (בלוציפראז למשל) המזרז מצע להפוך bioluminescent מרגש ובכך acceptor. ברט חסרה את הבעיות הטכניות של לדמם דרך הקרינה רקע גבוהה אך חסר את היכולת לספק מידע מרחבי בשל היעדר מצע של לוקליזציה ל 8 תאים ספציפיים. בסך הכל, BiFC היא שיטה מצוינת חזותי לוקליזציה subcellular של קומפלקסים חלבונים כדי לקבל תובנה איתות מידור.

Watch this Scientific Journal Video about Bimolecular Fluorescence Complementation at JoVE.com

Bimolecular Fluorescence Complementation

Subcellular לוקליזציה של חלבונים חשוב בקביעת הרגולציה במרחב ובזמן של איתות התא. כאן אנו מתארים השלמה הקרינה bimolecular (BiFC) כשיטה פשוטה לניטור אינטראקציות המרחבי של חלבונים בתא.

השלמה Fluorescence bimolecular

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Research

JoVE Journal

Biology

27.8K Views.  University of Illinois at Chicago. Subcellular לוקליזציה של חלבונים חשוב בקביעת הרגולציה במרחב ובזמן של איתות התא. כאן אנו מתארים השלמה הקרינה bimolecular (BiFC) כשיטה פשוטה לניטור אינטראקציות המרחבי של חלבונים בתא.

Video: Bimolecular Fluorescence Complementation

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Microbes typically live in communities. The spatial organization of cells within a community is believed to impact the survival and function of the community1. Optical sectioning techniques, including confocal and two-photon microscopy, have proven useful for observing spatial organization of bacterial and archaeal communities2,3. A combination of confocal imaging and physical sectioning of yeast colonies has revealed internal organization of cells4. However, direct optical sectioning using confocal or two-photon microscopy has been only able to reach a few cell layers deep into yeast colonies. This limitation is likely because of strong scattering of light from yeast cells4.
Here, we present a method based on fixing and cryosectioning to obtain spatial distribution of fluorescent cells within Saccharomyces cerevisiae communities. We use methanol as the fixative agent to preserve the spatial distribution of cells. Fixed communities are infiltrated with OCT compound, frozen, and cryosectioned in a cryostat. Fluorescence imaging of the sections reveals the internal organization of fluorescent cells within the community.
Examples of yeast communities consisting of strains expressing red and green fluorescent proteins demonstrate the potentials of the cryosectioning method to reveal the spatial distribution of fluorescent cells as well as that of gene expression within yeast colonies2,3. Even though our focus has been on Saccharomyces cerevisiae communities, the same method can potentially be applied to examine other microbial communities.

We present a protocol for freezing and cryosectioning yeast communities to observe internal patterns of fluorescent cells. The method relies on methanol-fixing and OCT-embedding to preserve the spatial distribution of cells without inactivating fluorescent proteins within a community.

Cryosectioning קהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...