원래 GFP - Pem1 박사 레이 리의 선물했다. 이 작품은 NIH와 엘리슨 의료 재단에서 VG에 부여하여 이름으로 지원했습니다

이 프로토콜에서는 DSBs가 과도 표현 드문 절삭 endonuclease I - SceI 3 생체내에서 유도된 아르 1,2를 구성 chromosomally 통합 기자와 DNA DSB 복구 분석하는 방법을 설명합니다. 통합 분석은 염색체 컨텍스트 내에서 DSB 복구를 분석의 이점을 제공합니다. 그러나,이 프로토콜은 기본 세포와 함께 작업할 때 문제가있을 수 있습니다 passaging 장시간 휴대를 필요로합니다. 대체 접근법은 기자 구조가 I - SceI이나 HindIII의 endonucleases와 체외에서 소화하고 선형 DNA로 세포에 transfected 아르 extrachromosomal 분석이다. exctrachromosomal 분석 프로토콜 4 다음 수정을 아래에서 설명하는 통합 분석과 유사합니다. extrachromosomal 분석은 기자 구조의 통합을 생략하고 대신 I - SceI이나 HindIII와 transfection 제어와 같은 pDsRed2 - N1의 0.1 μg과 함께 체외로 선형 플라스미드 NHEJ 기자의 0.5 μg으로 세포를 공동 transfect하십시오. HR 분석을위한 플라스미드 공동 transfect 2 μg의 인사 기자 I - SceI이나 HindIII와 0.1 μg pDsRed2 - N1과 선형. transfection 후 외과 삼일하여 세포를 분석할 수 있습니다. extrachromosomal 분석은 passaging 광범위한 세포를 피하고, 여러 세포 라인의 분석을 촉진, 기본 격리에 DSB 복구의 분석을 위해 수 있습니다. 1. NHEJ와 HR에 대한 리포터 구조 NHEJ 기자 카세트 5 Pem1 유전자 (GFP - Pem1)에서 설계 3킬로바이트 인트론과 GFP의 유전자를 포함하고 있습니다. Pem1 인트론은 DSBs의 유도를위한 HindIII와 I - SceI endonucleases (그림 1A)에 대한 인식 시퀀스 둘러싸인 adenoviral 엑슨가 포함되어 있습니다. I - SceI 사이트 거꾸로 방향에 있습니다. I - SceI가 nonpalindromic 인식 순서를 가지고, 따라서이 거꾸로 사이트가 호환되지 않는 DNA 종료 (그림 1C)을 생성합니다. 호환되지 않는 DNA가 가장 자연스럽게 발생 DSBs을 모방 끝납니다. 그대로 NHEJ 카세트는 adenoviral 엑슨은 GFP ORF를 방해 제외 GFP 있습니다. I - SceI로 DSBs의 유도되면, adenoviral 엑슨이 제거되고 NHEJ는 GFP 유전자 (그림 2)의 기능을 복원합니다. 이 NHEJ 기자의 독특한 기능은 인트론은 삭제 및 삽입을 용인할 수 있기 때문에 그것이 NHEJ 이벤트의 다양한 스펙트럼을 감지 수있다는 것입니다. HR 기자 카세트 1 (그림 1B)도 GFP - Pem1을 기반으로합니다. HR 카세트에서 GFP - Pem1의 첫 번째 엑손 세 제한 사이트 I-SceI/HindIII/I-SceI의 삽입과 함께 22 BP 삭제가 포함되어 있습니다. 삭제 GFP가 NHEJ 이벤트에 의해 재구성 수 없습니다 보장합니다. 두 I - SceI 사이트 I - SceI는 소화가되지 종료 (그림 1C)을 출발하므로, 거꾸로 방향에 있습니다. GFP - Pem1의 첫 번째 복사본은 GFP - Pem1의 promoter-less/ATG-less 첫번째 엑손과 인트론옵니다. 그대로 구조는 GFP 음수입니다. I - SceI의 소화에 의해 DSB의 유도에 따라 기능 GFP 유전자가 처음으로 GFP - Pem1의 엑슨의 두 변이 사본 사이의 분자내 또는 분자간 유전자 변환하여 재구성합니다. GFP 유전자의 두 번째 복사본은, 첫 번째 ATG 코돈의 두 번째 엑손을 부족한 넘고 또는 단일 스트랜드 어닐링이기 때문에하면 GFP 활동을 복원하지 않습니다. 이 디자인은 포유 동물 세포에서 지배 HR 경로 (그림 3)입니다 유전자 변환의 독점적인 검색을 위해 수 있습니다. 2. 기자의 통합 게놈으로 구성 <ol><li> NHEJ 또는 HR 기자 플라스미드의 양질의 준비를합니다. 최상의 결과는 Qiagen 엔도 무료 키트를 사용하십시오. 280분의 260 nm의 흡광도에서 플라스미드의 농도 및 순도를 측정합니다. </li><li> 50 μl의 NheI 50 U (반응의 전체 볼륨) 37 6 시간 동안 함께 소화에 의해 플라스미드 기자 10 μg을 Linearize ° C 배양기 (증발을 방지하기 위해, 건조 블록을 사용하지 마십시오.) Qiagen QiaexII 키트, 10 MM 트리스 - HCL pH는 8.0 20 μl로 elute DNA와 소화 솔루션에서 DNA를 정화. 280분의 260 nm의 흡광도에서하여 DNA 농도 및 순도 측정. 보통, 당신은 정화하는 동안 DNA의 20~30%을 잃게됩니다. 소화되지 않은 기자 건설과 함께 젤에 작은 나누어지는 (2 μl)를 실행하여 수율과 소화를 확인합니다. 정화 기자 선형 구조는 20 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li><li> transfection을위한 준비에서 최고의 성장 상태로 전지를 가져와. 냉동 유리병에서 시작하는 경우, transfection 전에 두 번 세포를 분리. 합류 세포의 접시부터 시작하는 경우 한 번 그들을 분할. </li><li> 70-80%의 합류 (보통 일반적인 인간의 섬유아 세포 이틀 동안, 도금 5x10 5 cells/100 mm 판 경우)에 세포를 성장. 그것은 대수 성장에 세포를 가져 최고의 transfection 효율을 위해 중요합니다. 적극적으로 성장하는 문화는 M 단계에서 세포를 (표면에 부착된 둥근 세포로 본)이 포함되어 있습니다. </li><li> TransfAmaxa Nucleofector의 다음 제조 업체의 권장 사항을 사용하여 셀을 요법. 섬유아 세포는 NHDF 솔루션 및 프로그램 U20을 사용하십시오. transfection에 대한 두 개의 100mm 접시 (~ 2x10 6 세포)에서 세포를 수확. 그것은 이상 세포를 trypsinize하지 않는 것이 중요합니다. 빨리 접시에서 분리 세포의 80 %로 trypsinization를 중지합니다. NHDF 솔루션에있는 세포를 Resuspend. 세포 NHDF 솔루션으로 구분되며, 따라서 부화 시간을 최소화하고 부드럽게 세포를 섞는다. 선형 기자 구조 0.5 μg으로 세포를 Transfect. 기자의 단일 복사본의 통합에 정상적인 인간의 섬유아 세포의 결과와 함께 사용이 transfection 조건은 integrants의 대부분을 구성. </li><li> transfection 후 1 MG / ML geneticin (G418) 24 시간을 추가하여 chromosomally 통합 기자 구조와 세포를 선택합니다. 70-10일에 대한 선택을 계속합니다. </li><li> G418 모성 식민지를 (여러분이 개별 식민지 또는 수영장 저항력 클론을 선택할 수 있습니다) 선택하십시오. 약 5 100mm 접시에 문화를 확장합니다. 나중에 사용할 세 접시를 고정하고 원하는 휴대폰 번호 (일반적으로 열 100mm 플레이트 다섯 transfections에 대한 충분)로 남은 두 접시를 확장합니다. </li><li> 세포 70-80%의 합류 (이일 섬유아 세포에 대한 100mm 플레이트 당 5x10 5 세포를 도금 후)에 도달하면 세포는 I - SceI이 플라스미드 표현과 transfected 준비하고 있습니다. </li></ol> 3. I - SceI의 Endonuclease의 과도 표현에 의해 DSB의 유도 <ol><li> Transfect Amaxa Nucleofector을 (섬유아 세포에 대한 NHDF 솔루션과 U20 프로그램을 사용하여 사용하여 transfection 효율 제어로 플라스미드와 0.1 μg pDsRed2 - N1 (Clontech)를 표현 5 μg I - SceI의 혼합물로 logarithmically 성장 문화의 ~ 2x10 6 셀 (두 접시) ). </li><li> (2) 5 μg pDsRed2 - N1,, 제어 (3) 5 μg 플라스미드을 표현하지 않는 동시에 5 μg은 EGFP - 표현 플라스미드 것은 (I)와 함께 ~ 2x10 6 세포를 trasfecting하여 외과 세 보정 컨트롤을 준비 형광 단백질 (우리가 플라스미드 인코딩 HPRT minigene를 사용하고있다). </li><li> GFP와 DsRed 단백질의 표현을위한 충분한 시간을 제공하기 위해 나흘 동안 세포를 성장. </li><li> transfection 후 GFP와 DsRed의 검출에 대한 필터와 형광 현미경에 의해 거꾸로 transfection과 GFP와 DsRed 단백질의 표현의 효율성을 확인 (선택 사항) 3 일. </li></ol> 4. 유동세포계측법하여 GFP +와 DsRed + 세포 분석 <ol><li> 나흘 transfection 수확 I - SceI transfected 세포 및 제어 세포 후에. PBS 500 μL의 세포를 Resuspend 및 외과 튜브에 세포를 전송할 수 있습니다. 이 단계에서 그것은 모든 세포를 수확하고 둥근 모양의 세포를 가지고하는 것이 중요합니다. 이것을 달성하기 위해, 그것은 더 이상 trypsinization 시간이나 강한 트립신을 사용하는 것이 좋습니다. 세포의 99 %가 접시에서 분리되었는지 확인하고 현미경으로 세포를 관찰하여 둥근 모양을했습니다. (호일로 얼음 양동이 커버) 빛으로부터 보호 얼음 세포 보관하십시오. 몇 시간 동안 얼음에 세포를 저장하는 것이 가능합니다. 를 위해 최상의 결과를 즉시 수확 후 세포를 분석할 수 있습니다. </li><li> GFP, DsRed, 그리고 부정적인 컨트롤과 함께 외과를 보​​정합니다. 분석의 모든 형광 세포를 (그림 4) 포함하기 위해 전압 및 색상 보정을 조정하십시오. 실험 샘플의 형광 강도는 컨트롤보다 낮은 될 것을 명심하십시오. </li><li> 분석 I - SceI 외과의 세포를 transfected. 우리는 각각의 치료를 위해 최소한 2 만 셀을 계산합니다. GFP와 DsRed 그 25 % 이하로 GFP의 퍼센트 이상 또는 DsRed + 세포를 유지하는 것이 좋습니다 형광. 사이에 잠재적인 간섭을 방지하기 위해 DsRed + 또는 GFP + 세포의 비율이 높은 경우 pDsRed2 - N1 또는 I - SceI 플라스미드의 양을 줄일 수 있습니다. 우리 실험에서 우리는 플라스미드 pDsRed2 - N1의 양을 조정하는 데 필요한,하지만 I - SceI 플라스미드니다. </li><li> GFP + 세포의 %가 DNA DSB 복구의 효율성에 해당하고 DsRed + 세포의 비율은 transfection의 효율성을 나타냅니다. DsRed + 세포에 GFP + 세포의 비율로 DNA DSB 복구의 상대적 효율성을 계산. </li><li> 수리 최종 분기점은 수리의 정확성을 테스트하기 위해 합성 수 있습니다. 기자의 구조 복제 E.coli의 기원과 kanamycin 저항 유전자 (그림 1)가 포함되어 있습니다. 이것은 효소 EcoRI, recircularization 및 관할 E.coli 세포에 변화와 게놈 DNA를 소화하여 구조를 구조 수 있습니다. 구조 plasmids은 다음 제한 소화 및 시퀀싱에 의해 분석됩니다. </li></ol> 5. 대표 결과 제어 transfections 및 NHEJ 및 HR 실험의 일반 외과의 결과는 그림 4와 5에 표시됩니다. 형광 강도와 형광 세포의 수가 integrat를 포함하는 I - SceI transfected 세포에 낮은 것입니다에드 NHEJ 및 HR 구조 (그림 5) GFP 이러한 세포에서 DsRed 구성의 사본 번호의 차이에 의한 제어 (그림 4)에 비해. 실험의 각 셀에 통합 기자 구조의 한 복사본을 포함하므로 성공적인 복구 이벤트 reconstitute은 세포의 일부에서 GFP 유전자 것입니다. 인간의 섬유아 세포에서 0.1 μg pDsRed2 - N1과 Transfection은 세포 당 약 1 플라스미드 사본을 제공합니다. NHEJ과 HR의 효율성은 GFP + / DsRed + 세포의 비율로 계산됩니다. NHEJ 2 인간의 세포에서 HR보다 더 효율적인 프로세스입니다. 인간의 섬유아 세포에서 NHEJ 효율은 일반적으로 0.6-1.3이며, HR 효율 0.05-0.3입니다. DSB 효율이 비율 GFP로 측정되기 때문에 + / DsRed + I - SceI 및 DsRed2 - N1의 plasmids의 혼합물에서 세포의 변화가 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 플라스미드의 품질 또한 transfection 효율을 변경하여 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 지속적인 측정을 얻으려면, 그것도 한 실험 이내에 동일한 플라스미드 믹스를 사용하는 것이 중요합니다. 또한, DSB 복구 효율 세포 유형, 세포주기 단계와 통합 구조의 염색체 위치에 의해 영향을받습니다. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 기자 NHEJ (A)와 HR (B)에 의해 DNA DSB 복구의 분석을 위해 구조. (C) 호환되지 않는 DNA는 두 거꾸로 I - SceI 사이트의 소화에 의해 생성된 종료 SD, 스플 라이스 기증자는, SA, 스플 라이스 수용체, 음영 사각형, polyadenylation 사이트, 네오 / 카나, 하나의 ORF는 두 발기인에 의해 제어 :.에서는 SV40 부여 네오 마이신 저항 포유 동물 세포 및 E. 대장균의 β - lactamase 부여 kanamicyn 저항, 오라, E. 대장균 pUC 복제 기원. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. . 기자 NHEJ의 분석을 위해 구성이에서 GFP 유전자가 비활성 상태 구조 있으나 DSB 성공 NHEJ의 유도에 따라 구성이 GFP +집니다. 아래와 같이하면 NHEJ하여이 기자의 수리 제품입니다. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 기자는 유전자 변환하여 HR의 분석을 위해 구조. 유전자 변환 (GC)에 의해 I - SceI, HR에 의해 DSBs의 유도시 적극적인 GFP 유전자를 재구성. GC, 크로싱 오버 (X - 이상), 단일 스트랜드 (SSA) 어닐링하고 NHEJ : 아래의 주요 DNA 복구 경로에서이 기자의 수리 제품입니다. X - 이상 수리 제품이 분자내 재조합 표시되는, exramolecular 재조합 같은 제품을 제공 하나의 염색체에 위치합니다. 적극적인 GFP 단백질을 표현하는 유전자 (GFP +) 녹색으로 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 외과 분석을위한 매개 변수의 보정. (A) 섬유아 세포가 자동 형광 세포를 제외위한 대조군으로 사용, 플라스미드 pHPRT와 transfected. (B) 섬유아 세포가 GFP + 세포 (녹색 영역)의 게이팅 설정을 사용, 플라스미드 pEGFP와 transfected. (C) 섬유아 세포는 DsRed + 세포 (적색 영역)의 게이팅 설정에 사용되는 플라스미드 pDsRed2 - N1와 transfected. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. chromosomally 통합 기자 구조와 정상적인 인간의 섬유아 세포에서 NHEJ (A)와 HR (B)의 분석의 전형적인 결과입니다.

<ol>
	<li>Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF2+is+required+for+repair+of+nontelomeric+DNA+double-strand+breaks+by+homologous+recombination.">TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).</li><li>Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+nonhomologous+end+joining+and+homologous+recombination+in+human+cells.">Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells.</a> DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+site-specific+endonuclease+stimulates+homologous+recombination+in+mammalian+cells.">Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).</li><li>Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+by+homologous+recombination,+but+not+by+nonhomologous+end+joining,+is+elevated+in+breast+cancer+cells.">DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells.</a> Neoplasia. 11, 683-691 (2009).</li><li>Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+end+joining+becomes+less+efficient+and+more+error-prone+during+cellular+senescence.">DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).</li><li>Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+by+nonhomologous+end+joining+and+homologous+recombination+during+cell+cycle+in+human+cells.">DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells.</a> Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

형광 NHEJ 및 인사 기자 assays은 별도로 생체내 각 DSB 복구 경로를 측정하기위한 양적 방법을 제공합니다. 외과 안정 20000 세포에서 10 GFP의 + 세포를 검색할 수 assays 매우 민감합니다. assays는 DSBs 2의 유도 후 몇 분, 아님 몇 시간 이내에 GFP + 세포의 모양을 감지하여 &quot;실시간&quot;에 복구 이벤트를 측정하기위한 적응 수 있습니다. 또한, GFP + 세포의 분석 DSB 복구가 다양한 약물 치료되...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>EndoFree Plasmid Maxi kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12362</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Qiaex II Gel Extraction Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>20021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amaxa Nucleofector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>AAD-1001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Geneticin (G418)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11811-031</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pDsRed2-N1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clontech</td>
<td>632406</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Round bottom tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352058</td>
<td>FACS tubes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of dna double-strand break (dsb) repair in mammalian cells

DNA 이중 가닥의 휴식 시간은 유전 정보 및 세포 사망의 대규모 손실로 이어질 수있는 가장 위험한 DNA의 병변입니다. 가입 nonhomologous 엔드 (NHEJ)와 상동 재조합 (HR) : 두 가지 주요 경로를 사용하여 셀 수리 DSBs. NHEJ와 HR의 Perturbations 자주 조기 노화와 tumorigenesis와 관련된, 따라서 그것은 각 DSB 복구 경로을 측정하는 양적 방법이 중요합니다. 저희 연구실은 NHEJ와 HR의 민감하고 정량적 측정을 허용 형광 리포터 구조를 개발했습니다. 구성은 DSBs의 유도를위한 드문 절감 I - SceI의 endonuclease에 대한 인식 사이트를 포함하는 설계 GFP 유전자를 기반으로합니다. GFP 유전자가 추가 엑슨에 의해 inactivated, 또는 돌연변이에 의해 그대로 시작 구조는 GFP 아무것도 없습니다. NHEJ 또는 HR하여 I - SceI 유발 나누기의 성공적인 복구 기능 GFP 유전자를 복원합니다. 유동세포계측법로 가늠 GFP 양성 세포의 수는 NHEJ 또는 HR 효율 양적 측정을 제공합니다.

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Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

이 문서는 GFP 기반의 형광을 설명합니다<em&gt; 생체내에</em&gt; 별도로 상동 재조합을 계량하고 nonhomologous 포유 동물 세포에 입사 최종 assays.

포유 동물 세포의 DNA 이중 가닥 브레이크 (DSB) 수리 분석

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

analysis-of-dna-double-strand-break-dsb-repair-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

31.5K 조회수.  University of Rochester. 이 문서는 GFP 기반의 형광을 설명합니다 생체내에 별도로 상동 재조합을 계량하고 nonhomologous 포유 동물 세포에 입사 최종 assays.

비디오: Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

사용 포유류 골격 근육의 유전자 Transfection VIVO에서 Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

연구

생물학

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Dissociated 성인 포유류의 뉴런으로 DNA의 Microinjection Intranuclear

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

포유 동물 세포에 Glycoproteins의 N - 연결 설탕 체인 펄스 체이스 분석

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

사용 Schwann - astrocyte 상호 작용 분석 체외에서 Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Microinjection하여 포유 동물 세포에서 mRNA 원자력 수출 속도론 분석

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.