עבודה זו מומנה על ידי מכון לאומי למחקר דנטלי Craniofacial מענק F32 (NIDCR) (DE021929) לJLF וDE016402 מענק NIDCR R01 לRAS

1. הכן את מחטי טונגסטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך מוט טונגסטן במחצית באמצעות מספרי תיל כדי שהמוט לא מתכופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השחל את המוט עד הסוף מחודד של 5 3/4 כוס בורוסיליקט פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השארת כ 3/4 בשל דבק המוט מהזכוכית, לדבוק המוט לקצה פיפטה עם חרוז קטן של &quot;דבק חם להמיס&quot; (מוזיאון), המהווה את מקל הדבק המשמש לאקדח דבק. HMA צריכה להיות נמסה במהירות בלהבת אלכוהול, נזהר שלא לשרוף את הדבק וליצור עשן שחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג המלקחיים, לכופף את קצה מוט טונגסטן (כ 1/4 מהקצה העליון) עד לזווית של ° 45. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את פיפטה פסטר, הנח על 1/8 מקצה מוט טונגסטן ללהבת לפיד פרופאן. החזק את הקצה יציב ובדיוק בניצב ללהבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את המחט מתוך להבת רגע גרגר כתום זעיר של טונג נאעשרה זבובי הנחה של המחט. </li></ol> 2. הכן פיפטות Spemann <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במבער בונזן, מחמם את הקצה הצר של פיפטה פסטר עד הזכוכית זמן קצר מעבר ללהתחדד מתחילה להתמוסס. להסיר מלהבה ולמשוך את הקצה עד פיפטה הופכת אטומה. להיות בטוח שיש עדיין חלק של החלק מחודד שיש OD של כ 0.7-1.0 מ&quot;מ. לשבור את הסוף סגר על 4 סנטימטר מלהתחדד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף סביב 2 רגל (60 סנטימטר) של צינור גומי לקצה הרחב (הפתוח) של פיפטה. מכה בקצה השני של צינור הגומי כדי לוודא ששום אוויר יכול לעבור את החלק מחודד של פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במכל דלק פרופן עם לפיד להבת עיפרון מצורף, לחמם אזור סגלגל בצד אחד של פיפטה בדיוק מתחת לתחילה להתחדד. לפוצץ באוויר בעדינות רבה וכל הזמן דרך צינורות גומי עם כמות קטנה של לחץ (כ כמות הלחץ הדרושה כדי לומר תחילת letter &quot;P&quot; ברמת שיחה). כאשר הזכוכית הופכת רכה בצד אחד ומתחילה לקרוס כלפי חוץ, להסיר במהירות את פיפטה מהאש ולפוצץ קשה ויציב דרך צינורות הגומי. זה יגרום לחלק המחומם של הזכוכית כדי ליצור בועה בצורת נקניק שעלולה לצוץ, וזה בסדר. אם הבועה קטנה מדי, נסה נמס ונושב הזכוכית שוב. החלון הפתוח הסופי בכוס צריך להיות סביב 0.25 ב( 6.35 מ&quot;מ) רחב על ידי ארוך 0.5 ב( 12.7 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצבעה לקצה חד כלפי מעלה, לגרד את הבועה לתוך מיכל פסולת זכוכית בעת נושבת בעדינות דרך צינורות כדי למנוע שברי זכוכית מלהיכנס לפיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בלהבת הגז, לשרוף את הקצוות הנותרים של הבועה ואש פולנית צידי החלון הפתוח. יש להיזהר שלא להמס את הפיר של פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בעיפרון נקודת יהלום, ציון הסוף מחודד של פיפטה כ 1.25 ב( 30 מ&quot;מ) מהחלון ולשבור את הקצהעם מלקחיים כדי שפתיחת פיפטה נחתך בצורה נקיה (טפטפות נזרק עם טיפים שבורים או לא אחידים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים והקצה של להבה ממבער אלכוהול, לכופף את החלק הצר של פיפטה 0.375 ב( 9.5 מ&quot;מ) מהקצה לזווית של כ 60 מעלות כך שהחלק הכפוף הוא במישור אנכי בעת פתיחת החלון הוא בעמדת 1:00 לשימוש ביד ימין ו -11:00 לשימוש ביד שמאל. צעד זה מתבצע הטוב ביותר במתחם ללא טיוטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אש פולנית הקצה באמצעות להבת האלכוהול תחת מיקרוסקופ לנתח. הקפד שלא לסגור את הקצה אלא להשאיר את הפתח עגול וחלקה ללא כל התכווצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי חתיכה של צינור גומי 1 ב( 25 מ&quot;מ), לרסס את חתיכת הצינור עם 70% אתנול, והחלק את צינורות מעל הפיר של פיפטה עד פתיחת החלון מכוסה לחלוטין. זה מתפקד כמו &quot;הסרעפת&quot; של פיפטה Spemann. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח הנורה מיליליטר לטקס גומי 2מעל התחתית הפתוחה של פיפטה. הנורה שומרת על לחץ שלילי בפיפטה Spemann. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרגל באמצעות פיפטה Spemann, להעביר חרוזים כרומטוגרפיה של סביב 100-200 מיקרומטר בקוטר ממקום מסומן באחד צלחת פטרי למקום מסומן באחר תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנקות את פיפטה Spemann, הסר את נורת הגומי ופיפטה המקום, להטות כלפי מטה, בכוס גבוהה מרופדת בצמר גפן או גזה בתחתית ומלאה במים מזוקקים וחומר ניקוי זכוכית. </li></ol> 3. לעקר ודגירת ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב ביצים עם 70% אתנול ומניח את הביצים במגשי ביצי פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ביצים באינקובטור מחומם ב37.5 ° C ו 85-87%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביצים עד שהם מגיעים HH9.5, כ 26 שעה שליו ו48 שעות לברווז. </li></ol> 4. חלון ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת חתיכה קטנה של מעטפת חיצונית מהחלק העליון של הביצה עם מלקחיים, נזהרת שלא לנקב מ &#39;הקליפה הפנימיתembrane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק עם 18 G על ידי מחט 1 אינץ, לתקוע חור בקצה הצר של הביצה ולסגת כ 1-2 מיליליטר של חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את סרט הדבקה שקופה מעל החור והסימן לנקב בקליפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור &quot;חלון&quot; על פני השטח העליונים של הביצה (באמצעות סרט ההדבקה השקופה) באמצעות מספריים מעוקלים. </li></ol> 5. דמיינו עוברים ולהתכונן לניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מוט זכוכית, מבריש בעדינות כמות קטנה של אדום ניטרלי (0.02 גר &#39;/ מיליליטר בBSS של האנק) על העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את קרום vitelline ולמשוך אותו על פני העובר באמצעות מחט טונגסטן חדד להבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-לאטום את הביצה על ידי הצבת קלטת שקופה מעל החלון. </li></ol> 6. הפרד את רקמות התורמות מהעובר התורם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסרט מהחלון על הביצה של עובר התורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את הקיפול העצבי מהאאקטודרם הצמוד של עובר התורם, להפוך את החריצים בשני sides של הצינור העצבי, באמצעות מחט חדדה להבה טונגסטן (מיוצרת כמתואר לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, חצה את הצינור העצבי ברמות הקדמית וגם האחוריים הרצויות של השתל ולהפריד את השתל משאר הצינור העצבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקיפול העצבי מן עובר התורם או באמצעות פיפטה Spemann או סוג אחר של micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, הוצא את הקלטת מהחלון על ביצת המארח ולהשתמש פיפטה Spemann למקום הקיפול העצבי תורם לצד עובר המארח בסמוך לאזור של הצינור העצבי שיקבל את ההשתלה. </li></ol> 7. הפרד את רקמות המארח והשתלת רקמות התורמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הקיפול העצבי מהצינור העצבי של עובר המארח, כפי שנעשה עם התורם. תשמור על עצמך כדי להסיר את שתל בגודל שווה כמו הרקמות התורמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחפו בעדינות רקמות מארח זה רחוק מהעובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, עם מחט טונגסטן בוטה או הקצה המעוגל של מילcropipette, בעדינות להזיז את עצבי התורם לקפל לתוך הצינור העצבי מארח, שמירה על אוריינטציות Antero, אחורי וdorso-הגחון הראויה. ודא השתל הוא תחוב בלאורך הצדדים, אבל להיות בטוח שלא לתקוע או נזק לרקמות הבסיסיות. כדי לעזור לעקוב אחר פתק הכיוון המקורי סימטריה כלשהו ברקמות התורמות או מכתים ההפרש מהאדום ניטרלי. אנחנו גם צילום מסמך עובר התורם עם הרקמה הנלווית נכרתה, כמו גם את הכימרה מייד לאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיסת מלח סטרילית יש להוסיף לביצה אם עובר המארח מראה סימנים של התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת, בזהירות מחדש חותם ולתייג את הביצה, ובעדינות להחזיר אותו לחממת לחות גבוהה (70-80%) שבו עובר chimeric יכול להתפתח לשלב הרצוי לניתוח. </li></ol> 8. אוסף של מפלצות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד לאסוף עובר chimeric במקבע של סרה קרה טרי ומניח אותם באופן מיידי על rocker על 4 מעלות צלזיוס לקיבעון O / N. זה יאפשר זיהוי רגיש יותר של תאי שליו עם הנוגדן אנטי שליו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ביטוי גני מנתח באמצעות RT-qPCR, להקפיא עובר ישירות בחנקן נוזלי לפני מיצוי RNA. </li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הרכס העצבי הוא אוכלוסיית תאים עוברית חולפת שנודדת בהרחבה לאורך כל העובר ומבדיל לסוגים שונים של תאים, כוללים כונדרוציטים וosteoblasts, שתורמים לשלד craniofacial. השתלת רכס עצבי במערכת chimeric שליו-הברווז תרמה רבה להבנה של יחסי גומלין הרקמה ומסלולי איתות המווסתים את התפתחות שלד craniofacial שלנו. עם זאת, בהתחשב בפוטנציאל העצום של רכס עצבי גם לייצר תאי שריר חלק, תאי שומן, מלנוציטים, תאי שוואן, ותאי עצב, מערכת הכימרה שליו-הברווז יש לו פוטנציאל אדיר ליישומים עתידיים, במיוחד בשילוב עם הקידום המהיר של ביולוגיה של תאי גזע ורפואה רגנרטיבית. מאז שליו וברווז הם שני מינים התרבו באופן מסחרי, אספקה ​​מוכנה של ביצים מופרות זולות יחסית היא זמינה ממגוון רחב של משקים. לכן, טכניקה זו צריכה להיות נגישה לresearcשלה הפועל במגוון רחב של תקציבים ושטח מתקן. למרות שטכניקה זו היא חזקה מאוד, נותרו מספר מגבלות. כמו טכניקות ניתוחיות אחרות, את האיכות ואת הכדאיות של מפלצות שליו-ברווז להסתמך על מיומנויות כירורגיות של החוקר, ולכן, לא תהיה וריאציה יותר הבין ותוך אישי בין ניסויים בהשוואה לדגמים אחרים, כגון עכבר ניצול אלה גנטיקה. יתר על כן, יש גם וריאציה בשיעורי של פיתוח ושלבים של עוברי אדם שתורמים לשחזור ולהצלחה של כל השתלה. עוברי עופות הם גם מאוד רגישים להתייבשות ולכן שלבים קריטיים במהלך הניתוח כוללים שמירה על רמות האור נמוכים, הזמן מתחת למיקרוסקופ עד למינימום, את הביצים חתומות עם קלטת ככל האפשר, ולחות גבוהה בחממה לאחר הניתוח ל להימנע מהתייבשות. במונחים של כדאיות של מפלצות, usually בין 50-75% לשרוד, למרות שאחוזים אלה יכולים להקטין את מעלה את שלב האיסוף. בפגישת 4-6 שעות טיפוסית של ניתוח, מנתח מנוסה יכול ליצור 10-15 מפלצות. ההצלחה של ההשתלה תלויה גם במידה רבה על איכות הכלים. כלים טובים מובילים לתוצאות עקביות יותר, לשחזור. באמצעות לפיד פרופאן כדי להפוך את מחטי טונגסטן מאפשר מחטים חדות ביותר להתבצע. הסוג של לפיד המשמש עושה הבדל גדול משום שהיא שולטת בגודל של הלהבה. יכול לשמש גם חידוד אלקטרוליטי, אך גישה זו אינה מתקרבת אפילו לייצור מחטים חדות כ. השתמש במוטות טונגסטן במקום חוט נגלל כך שהמחטים יכולות להתבצע ישר. Micropipette Spemann, בעוד זמן רב וקשה לעשות, הוא כלי אידיאלי להעברת רקמות. פיפטה יכולה להיות מותאמת אישית עם פתחים בגדלים שונים, וניתן להשתמש בם שוב ושוב. גורם קריטי למנצליםmicropipette ga Spemann הוא לקבל קצת נוזל בפיפטה לפני שתיגע בקצה אל פני השטח של העובר. חלק מהנוזל תמיד יזרום החוצה כאשר קשר הוא עשה עם המניסקוס על העובר. לחיצה על הסרעפת מאפשרת רקמת נוזל ושתל להיפלט בדיוק רב, ואילו מעט מרפה על הסרעפת בעדינות מוצצת את רקמת שתל מתורם לתוך פיפטה. שמירה קצת לחץ חיובי על הסרעפת שומרת על רקמת שתל מתורם בקצה פיפטה במהלך העברה, ולחץ נוסף קטן בסרעפת מאפשר את רקמת שתל מתורם כדי להיות ממוקמת במכוון במארח. להגנה של פיפטה Spemann במהלך אחסון ועיקור, הסר את הנורה מהקצה הרחב ובזהירות הכנס את הקצה מחודד לתוך הנורה. הנח את פיפטה Spemann במבחנה זכוכית, לכסות את החלק העליון בנייר אלומיניום, וחיטוי לפני הניתוח. לאחר טפטפות מרובה הן מחדשעדי לעבור עיקור שוב לניתוח, להפוך את טפטפות, לחמם אותם כמעט לרתיחה באותה התמיסה של מים מזוקקים וחומר ניקוי זכוכית, ולאחר מכן לשטוף שוב ושוב במים מזוקקים. טפטפות החיטוי בצינורות הבודדים שלהם. צינור הגומי שיוצר את הסרעפת ואת הנורה הגומי יש להחליף לאחר מספר עיקורים או כאשר הם הופכים לחשוכים ונוקשים. רבים מהרכיבים של פרוטוקול זה כרוך בציוד מסוכן. לדוגמא, את ההליך להכנת Micropipette Spemann כולל שלושה סוגים של להבות, כמו גם חימום, מושך, נושבת, כיפוף, חיתוך, ליטוש וזכוכית. לכן, לובש ציוד מתאים מגן אישי (PPE) שמגביר את הבטיחות כגון משקפי מגן וחלוק מעבדה הוא קריטי. בנוסף, משום שאנשים רבים סובלים מ, או שיש לו את הפוטנציאל להתפתח, אלרגיות ביצה, תמיד להשתמש בכפפות בעת הטיפול בביצים. עם אמצעי זהירות אלה בחשבון, מערכת chimeric שליו-ברווז isa שיטה בטוחה, יעילה ונגישה יחסית שיש לו יישומים רבים בעתיד.

שלד הפנים מתפתח מהצמיחה ושילוב של תהליכי פנים מרובים שמורכבים מרכס העצבי וmesenchyme mesodermal המוקף ectodermal ושכבות אפיתל endodermal 1-11. אירועי morphogenetic בתוך כל תהליך נשלטים על ידי אינטראקציות איתות ברורות בין mesenchyme וepithelia סביב 12-16. שינויים באינטראקציות אלה איתות ו / או effectors במורד הזרם שלהם לתרום לפנוטיפים מחלה ויכולים גם להיות רלוונטי להתפתחות של שלד craniofacial 17, 18. לכן, הבהרת העיתוי ואופי אינטראקציות רקמה יש פוטנציאל גדול להגדיל את ההבנה של הביולוגיה התפתחותית ואבולוציה של שלד הפנים שלנו. השימוש בעוברי chimeric לחקור אינטראקציות רקמה יש היסטוריה ארוכה בביולוגיה התפתחותית. גישה זו הייתה חלוץ ידי הנס Spemann והמעבדה שלושגילו את &quot;מארגנים&quot; עובריים על ידי השתלת רקמות בין העוברים של מינים דו חיים שונים. Spemann היה אמן של טכניקות מיקרו כירורגים שיד כישוריהם כהשלמה הפיתוח של כלים מיוחדים, בעיקר פיפטה Spemann. ויקטור המבורגר היה סטודנט לתואר שני במעבדה של האנס Spemann בפרייבורג במהלך 1920s, וזה כאשר ניסויי ההשתלה המקוריים שהובילו לפרס נובל של Spemann בוצעו. כאשר המבורגר עבר לאוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס ב1935, הוא פרט את התהליך של קבלת micropipette Spemann בידנית של ניסויי אמבריולוגיה 19. דרו Noden היה סטודנט לתואר שני במעבדתו של המבורגר באוניברסיטת וושינגטון עד 1972. לאחר שעברו לאוניברסיטה של ​​מסצ&#39;וסטס, אמהרסט ולאחר מכן לאוניברסיטת קורנל, Noden המשיך בודה ובאמצעות micropipettes Spemann להשתלות כירורגית מעורבת מפלצות שליו חומוס. &amp;160 #;. בעוד סטודנט לתואר שני, אחד מהמחברים (ריץ&#39; שניידר) התאמנו עם דרו Noden באוניברסיטת קורנל 1995-1998 הפרוטוקול להכנת micropipette Spemann הבא מבוסס על תיאורים שנכתבו על ידי המבורגר וNoden, וכולל שינויים שנערכו נעשו על ידי שניידר. השימוש במפלצות שליו חומוס ללימוד פיתוח craniofacial ובמיוחד להבנת תרומתם של תאי רכס עצביים היה חלוץ ידי Noden ועל ידי Le Douarin בתחילת 1970s, שנסקרו בLe Douarin אח&#39; 20. גישה זו אומצה באופן נרחב במחקרים רבים ועל ידי חוקרים רבים אחרים 1, 4, 5, 21-38. השיעורים המקבילים של צמיחה ומורפולוגיה של שליו וחומוס עושים השתלות בתוכם אידיאליים לחקר גורל תא ומעקב שושלת. עם זאת, בגלל הדמיון בין השליו וחומוס, שינויים מורפולוגיים induced ידי תאי תורם הוא קשה לפענוח. לעומת זאת, מערכות chimeric עופות אחרות כללו ברווז מקומי כדרך ללמוד מנגנונים ההופכים את העוברים נפרדים 39-50 מבחינה אנטומית. באופן ספציפי יותר, מערכת chimeric שליו-הברווז מציעה יתרונות מרובים להבחנה את השפעותיו של התורם במחשב המארח, ולהיפך. ראשית, עוברי שליו וברווז נבדלים בגודל גוף ובצורה, אשר מספק דרך ישירה כדי לחקור תורם או מנגנוני מארח ספציפי של היווצרות דפוס על ידי assaying לתחומים ההפרש של ביטוי גנים (איורים 1 ו-B). שנית, יש עוברי שליו וברווז שיעורים שונים במידה ניכרת של התבגרות, עם שליו בקיעה ב17 ימים וברווז בקיעה ב28 ימים. רכס עצבי מושתל שומר על קצב ההבשלה הפנימי שלה בתוך סביבת המארחת, ובכך, זיהוי של שינויים זמניים בביטוי גנים, אינטראקציות רקמות, histogenesis, והמורפוגנזה אפשרי51-57. לבסוף, נוגדני גרעין אנטי שליו (ש ¢ PN) מאפשר תרומות סלולריות תורם ולארח להיות באופן קבוע נבדלות זו מזו על ידי הכרת חלבון שבא לידי ביטוי בכל מקום בתאי שליו, אבל נעדר מתאי ברווז.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">1x PBS</td>
			<td style="width:180px;">TEK</td>
			<td style="width:145px;">TEKZR114</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Hank&#8217;s BSS w/o Phenol Red</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">14025-092</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Neutral Red</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">N4638-5G</td>
			<td style="width:252px;">.22&#181;m filter-sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">18G Needles</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">305195</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">5 ml syringe</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">309646</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">No. 5 Dumont forceps</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">11252-20</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Straight Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14028-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Curved Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14029-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Spemann Pipet</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Hand-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Egg holder</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Glass ashtray and modeling clay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Alcohol burner</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">04-245-1</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Transparent tape</td>
			<td style="width:180px;">3M Scotch</td>
			<td style="width:145px;">600</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Glass Stirring Rod</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">11-380C</td>
			<td style="width:252px;">Tip is narrowed and rounded using a flame</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Tungston wire (.004 x 3 inches)</td>
			<td style="width:180px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:145px;">7190</td>
			<td style="width:252px;">Tip is flame-sharpened in a propane torch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bunsun burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;S49117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>&#160;22-183-632</td>
			<td>9-inch (229 mm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:169px;">rubber tubing</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-178C</td>
			<td style="width:252px;">amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">&#160;Propane fuel cylinder</td>
			<td>BernzOmatic</td>
			<td>UL2317</td>
			<td style="width:252px;">&#160;TX-9 with torch style &#34;A&#34; with a screw-on brass &#34;pencil flame&#34; torch&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond point pencil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-268912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber bulbs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S32325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras

הדור של עוברי chimeric הוא גישה נפוצה ורבה עוצמה כדי לחקור את הגורל תא, אינטראקציות רקמות, ומינים ספציפי תרומות להיסטולוגית ופיתוח מורפולוגי של עוברי החולייתנים. בפרט, השימוש בעוברי chimeric ביסס את חשיבותו של רכס עצבי בהכוונת מורפולוגיה המינים ספציפיים של מתחם craniofacial. השיטה המתוארת במסמך זה מנצלת שני מיני עופות, ברווז ושליו, עם מורפולוגיה craniofacial שונה להפליא. שיטה זו מאוד מקלה על החקירה של רגולציה מולקולרית ותאית של דפוס מינים ספציפיים במתחם craniofacial. ניסויים בעוברי chimeric שליו וברווז כבר חשפו אינטראקציות עצביות בתיווך פסגת רקמות והתנהגויות תאים אוטונומיים המווסתים את תבנית מינים ספציפיים בשלד craniofacial, השרירים, וintegument. המגוון הגדול של נגזרי רכס עצביים מצביע על פוטנציאל משמעותיעבור יישומים עתידיים של מערכת chimeric שליו-ברווז להבנת התפתחות חוליות, מחלה, והתפתחות.

לפני ניתוח נוסף, את היעילות של ההשתלה צריכה להיות assayed. להיסטולוגית, ביטוי מורפולוגי, או גן מנתח בדגימות רקמה, צריכים להיות מזוהים על ידי אימונוהיסטוכימיה תאי שליו באמצעות נוגדן ש ¢ PN כמתואר 36. עבור RNA ניתוחים, מינים ספציפי תרומות לרקמות של עניין יכולות להיות מחושבים באמצעות אסטרטגיה המבוססת על ה-PCR 58. לאחר היעילות של ההשתלה אומתה, ניתן להעריך מדדי תוצאה מורפולוגיים או מולקולריים נוספים במפלצות. יחסי גומלין בין תאי התורם העצביים פסגה ורקמות הנגזרים מארח סביב העומדות בבסיס histogenesis והמורפוגנזה של מתחם craniofacial הנכונים בעבר נחקרו בהרחבה. בפרט, mesenchyme רכס העצבי מפנה את מורפולוגיה מינים ספציפית של הפנים 7, 13, 51, 59, דפוס נוצה 52, דפוס שרירים 56 </s<html> עד&gt;, וסחוס 53, 57 באמצעות הוויסות של ביטוי גני המארח. לדוגמא, mesenchyme רכס העצבי מכתיב כאשר צורות עצם בלסת התחתונה על ידי temporally ויסות ביטוי Bmp4 55. לאחרונה, החקירות מתמקדות באינטראקציות רקמות המתרחשות בשלב מוקדם מאוד בפיתוח craniofacial. בהקשר זה, ניסויי ניצול מפלצות שליו-ברווז הראו עוברי מארח להשפיע על הגירת רכס עצבית על ידי קביעת גבולות מורפולוגיים. כלומר, בעוברי quck chimeric, תאי רכס עצביים שליו תורם נודדים לתוך קשת הלסת התחתונה, ברווז המארח בדפוס כמו ברווז (1D איור). למרות תרומת מארח זה לגודל אוכלוסיית הרכס העצבית, הרכס העצבי התורם ממשיך לייצר שלד לסת תחתון, שהוא בגודל ובצורה (איור 1E) כמו שליו. דואר 1 &quot;עבור: תוכן width =&quot; 6in &quot;עבור: src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1. מערכת Chimeric שליו-ברווז. (א) שליו ו( ב &#39;) גולגלות ברווז להציג הבדלים ניכרים בגודל ובצורה, ובכך, מתאימות בצורה אידיאלית לשימוש במערכת chimeric ללמוד פיתוח craniofacial (שונה מTokia et al. 56). (C) עיצוב ניסיוני להפקת עוברים חד צדדיים chimeric quck משליו HH9.5 בהתאמה במה ועוברי ברווז. הקיפול העצבי מוסר מצד אחד של עוברים שליו ואחרי חתיכה של הקפל העצבי מקבילה הוסר הושתלו עוברי ברווז. (ד) תאי תורם שליו (ירוק) יכולים להיות מיושמים במפלצות באמצעות נוגדן אנטי שליו (Q ¢ PN) כפי שמוצג בתצוגת הגחון של עובר chimeric HH12. (F) בלסתות quck בHH38, שליו תורם נגזר מקל7; של סחוס הוא קצר יותר וישר יותר מזה שנצפה לסחוס הנגדי הברווז נגזר מארח של מקלה, שהוא גדול יותר ומעוקל. נדפס Tokita et al., Dev. ביו. 306, 377 (2007) באישור Elsevier.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras at JoVE.com

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת עוברי chimeric שנועדו לבחון את תרומתם מינים ספציפיים של רכס עצבי ו / או רקמות אחרות לפיתוח craniofacial.

הערכת תרומות מינים ספציפיות כדי Craniofacial פיתוח באמצעות מפלצות שליו-ברווז

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  University of California at San Francisco.  מאמר זה מתאר שיטה ליצירת עוברי chimeric שנועדו לבחון את תרומתם מינים ספציפיים של רכס עצבי ו / או רקמות אחרות לפיתוח craniofacial. 

Video: Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

הפיתוח של יישומים טיפולית חדשה באמצעות מיקרופלואידיקה

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

בשנת vivo Bioluminescent הדמיה של גידולים החלב באמצעות ספקטרום IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

ממוקד רקמות מפלצות עובריים: דג הזברה Gastrula השתלת תאים

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

הערכת נכסים איתות של Ectodermal epithelia במהלך פיתוח Craniofacial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Electroporation של Mesenchyme Craniofacial

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

גישה חצי כמותי להערכת גיבוש biofilm באמצעות פיתוח המושבה מקומט

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

הערכת תפקוד עורקי התנגדות Murine באמצעות לחץ Myography

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...