<p class="jove_content"&gt; אנו מודים לד&quot;ר שואנג יו לקריאה ביקורתית של כתב היד. PCL12 המבנה היה קישור טופס ד ד&quot;ר כריסטופר מתנה. עבודה זו נתמכה על ידי שני מענקי קרן לאומי למדע (0842708 ו1026958) ומענק AHA (09GRNT2250529) לFS.</p

1. בנייה של תולעים מהונדסים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרנספורמציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את רפידות הזרקה. מניחים ירידה של חמה, 2% מומסת במי agarose, על coverslip זכוכית. במהירות למקום coverslip שני על הירידה בקלילות וקש עליו. לאחר agarose הוא הגדילו, שקופיות coverslips זה מזה, ואופה coverslip-הכרית בתנור ואקום ב 80 ° CO / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למשוך pipettes. אנו משתמשים בחולץ סאטר P-97 כדי למשוך 1/0.5 מ&quot;מ OD / מזהה ורוסיליקט נימים עם נימה. Pipettes מזויפים עם קצה סגור אשר נפרץ בשלב מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת הזרקה. הפוך את תערובת ההזרקה המכילה את ה-DNA של עניין (20 ng / μl למבנה) בתוספת פלסמיד דנ&quot;א הריק לריכוז סופי של 150 ng / μl. צנטריפוגה את תערובת ההזרקה כדי להסיר כל זיהום. שלב זה הוא קריטי משום שחומרים מזהמים להפחית את יעילות שינוי. העבר את 5 μl העליון (מזהמים ופסולת אחרים מצטברים בתחתית) לצינור טרי ל-Bדואר בשימוש בהזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען תמהיל הזרקה ידי קפילריות. התחתון של פיפטה הוא שקוע בתמהיל ההזרקה. בדרך כלל 0.5 μl מספיקים כדי להזריק 100 תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען פיפטה הזרקה. הכנס את פיפטה על בעל micromanipulator ולשבור אותו פתוח על ידי שפשוף הקצה שלה כנגד קצה להחליק את מכסה רכוב על שקופיות זכוכית או לחלופין נגד פסולת על כרית agarose. זהו צעד חיוני כמו טיפים נזק גדול מדי תולעת וסתומים טיפים קטנים בקלות רבה מדי. האיכות של הקצה השבור יכולה להישפט על ידי הצורה והכי חשוב על ידי קצב הזרימה. קצב הזרימה ניתן להעריך על ידי גודל הבועות זורמות מהקצה הפתוח השקוע בטיפת שמן 700 halocarbon של בתגובה ללחץ הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התולעים למשטח זריקה. מקום טיפת שמן halocarbon 700 על משטח זריקה ולהעביר כמה (1 או 2 למתחילים) תולעים לנפט. השתמש בתולעת להרים לדחוף את התולעים למטה על הכרית עדy לדבוק agarose. תולעים צריכים להיות מונחה בשורות עם צדדים הגחון פונים לאותו כיוון. הימנע מלגעת בראשו של התולעת. אם לאחר מספר ניסיונות התולעים לא מצליח לדבוק בכרית, להחליף עם כרית טרי או להגדיל agarose עובי ו / או ריכוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את פיפטה לתוך התולעת. על ידי הזזת הבמה, למקם את התולעת בפיפטה. מקם את פיפטה בליבה של בלוטת המין המרכזית היא כי הציטופלסמה שלה שותפים רבים גרעיני תאי נבט. זה מגדיל את הסיכוי להעביר דנ&quot;א מוזרק לצאצאים רבים. פיפטה צריכה לשקר כמעט במקביל לתולעת (~ 15 ° -25 ° זווית). לדחוף אנכי קצה פיפטה במורד הגוף של התולעת עד שהעור הוא בדיכאון. לאחר מכן הקש בעדינות על מניפולטור כדי לגרום לכניסתו של טיפ. לקבלת התוצאות הטובות ביותר להזריק שתי בלוטות המין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את פתרון ה-DNA. תפעיל לחץ על פיפטה עד שמתנפח בלוטת המין. לעצור את הזרימה ולמשוך את תולעת פיפטה. בדוק את המחט לזרימה ולאחר מכן להעבירלתולעת הבאה וצעדי הזרקה חוזרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את התולעים: הוסף טיפה (~ 10 μl) של חיץ התאוששות בתולעים ודגירה עד התולעים להתחיל לשחות. הוסף נפח שווה של M9, לחכות עד שתולעים לחדש את החייה ולחזור כמה פעמים עד שהפתרון הוא בעיקר M9. בנפרד להעביר תולעים לצלחות זרע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אינטגרציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 40 בריאים, מדושנת, L4 תולעים לתוך צלחת טרי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקרין עם γ-ray עם 4,000 ראד עבור 40 דקות. העבר את התולעים מוקרנים (P0) בזרע טרי, צלחות OP50 (4 תולעים / צלחת). לחלופין ניתן מוקרנים תולעים עם מינון של 300 יובס J / 2 מ &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 10-20 transformants F1 מכל צלחת לצלחות אישיות, לתייג את הצלחות עם P0 המקור המקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחד מתוך 2-4 transformants F2 לכל F1 כדי צלחות נפרדות. בדקו את צאצאי F3 להעברת 100% משינוי הסמן. בדרך כלל, 1-3% של צאצאים מwil תולעת מוקרןיש לי אירוע אינטגרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מניות של שלושה או יותר קווי transformant עצמאיים. </li></ol></li></ol> 2. מבחני התנהגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גיל סנכרון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תולעים ב+ 10 ס&quot;מ צלחות NGM הסטנדרטי OP50 E. coli עד אוכלוסייה גדולה של מבוגרים הרה להולדת הוא הגיע (3-5 ימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התולעים ב50 צינורות מ&quot;ל פלקון על ידי השעיית אותם במאגר 1 מיליליטר M9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ M9 5 מ&quot;ל ו צנטריפוגות ב XG 450 במשך 3 דקות. בטל supernatant. חזור על 3-4x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של צנטריפוגה שעברה, להסיר את supernatant ולהוסיף 10 כרכים של פתרון hypochlorite הבסיסי (0.5 M NaOH, hypochlorite 1% טריים המעורב) לתולעי pelleted. לדגור על RT במשך ~ 10 דקות. תגובת תמוגה יכולה להיות פיקוח על ידי הצבת ירידה של תגובת תמוגה על coverslip ולבחון את התולעים מתחת למיקרוסקופ. כאשר כ -80% מתולעים שבורים יש להפסיק את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את תגובת תמוגה ידי AddinG אותו הנפח של ביצת חיץ סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הביצים (ופגרים) על ידי צנטריפוגה XG ב 450 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הביצים עם חיץ סטרילי ביצה 2-3x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הביצים O / N במאגר וזרעם על צלחות NGM סטנדרטיות M9. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> assay chemotaxis. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין כמה חתיכות של אגר כ 0.5x0.5x0.5 ס&quot;מ. אנחנו נפקיד את אגר בצלחת של 10 ס&quot;מ וחתכנו את נתחים אגר משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את הנתח אגר בתמיסה המכילה attractant הרצוי (בלהרוות, ריכוזים קרובים להרוות) במשך שעה 2. משיכה אופיינית הן ליזין (0.5 מ &#39;), ביוטין (0.2 מ&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקיד נתח אגר בצלחת מבחן 10 ס&quot;מ שבו המיקום של נקודת מבחן ונקודת שליטה סומנו (איור 1 א). לאפשר איזון והיווצרות O שיפוע / N (איור 1). הכן 5 צלחות עבור ניסוי בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הניסוי להוסיף 10 μl של 20 מ&quot;מ NaN 3 (anesthetic) לכל מקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 20 תולעי גיל מסונכרנים במרכז הצלחת. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שעה 1, לספור את בעלי החיים על כתמי בדיקה / בקרה ולחשב את מדד chemotaxis, (CI) כדלקמן: <img alt="משוואת 1" fo:content-width=".863in" fo:src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1.jpg" /> כאשר N, N ו-N בדיקת CNT., מציינים את המספר הכולל של בעלי חיים, מספר בעלי החיים במקום המבחן ומספר בעלי החיים במקום השליטה. </li></ol></li></ol> 3. תרבית תאים העוברית ראשונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תולעים, כמתואר בגיל סנכרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את תגובת תמוגה על ידי הוספת הנפח הזהה של חיץ ביצה וסטרילית צנטריפוגות ב XG 450 במשך 5 דקות. בעדינות להשליך supernatant נזהר שלא לאבד את ביצי pelleted. חזור על 2-3x או עד supernatant הוא ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ביצי pelleted (ופגרים) במאגר ביצת סטרילי 2 מ&quot;ל ולהוסיף 2 מ&quot;ל של סוכרוז 60% סטרילי במאגר הביצה. מערבבים את הפתרון הזה עד ביצים resuspended לחלוטין (כפי שהם נוטים ליצור גושים בצנטריפוגה) ביד או באמצעות vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 450 במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant (המכיל את הביצים) בזהירות לצינור סטרילי. בטל גלולה המכיל פגרים ואחרים תוצרי לוואי של תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר סוכרוז שיורית על ידי resuspending את הביצים בחיץ הביצה וcentrifuging ב 450 XG במשך 5 דקות. בעדינות לאסוף וזורקים supernatant. חזור על 3x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסת מנוע מינרית resuspend ביצי pelleted במאגר ביצת סטרילית המכיל U 1 / מיליליטר chitinase ב RT לעכל את קליפות ביצים. לאחר 30 דקות להתחיל לעקוב אחר התגובה (תחת מיקרוסקופ תרבות תא הפוך). כל אצווה של chitinase יש פעילות שונה במקצת. בדרך כלל עיכול יושלם בשעת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר בערך 70-80% קליפות ביצים מתעכלות על ידי chitinase תוספת CM-15 (L-15 תא התרבות Medium המכיל 10% בסרום שור עוברי, 50 U / ml פניצילין, ו50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין). לנתק את התאים באמצעות מזרק עם מד 27. סנן את ההשעיה התא עם 5.0 מיקרומטר לסנן להסיר עוברים שלמים, גושים של תאים וזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה ההשעיה התא ניתק על ידי צנטריפוגה XG ב 450 במשך 15 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הכדור בתרבית תאים בינונית-15 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים ניתק צלחת על כיסוי זכוכית מצופה בעבר עם תלושים לקטינים בוטנים (0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) מומסים במים. הערה: תאים חייבים לדבוק במצע על מנת לבדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכולים להישמר תאים ב RT (16-20 ° C) באוויר במשך יותר מ 2 שבועות. </li></ol>

<ol>
	<li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li><li>Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lewy+body+pathology+in+Alzheimer's+disease.">Lewy body pathology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).</li><li>Greenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myositis:+review+of+recent+literature.">Inclusion body myositis: review of recent literature.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).</li><li>Revesz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporadic+and+familial+cerebral+amyloid+angiopathies.">Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies.</a> Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).</li><li>Hartmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sites+of+intracellular+production+for+Alzheimer's+disease+A+beta40/42+amyloid+peptides.">Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides.</a> Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).</li><li>Ohnishi, S., Takano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibrils+from+the+viewpoint+of+protein+folding.">Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding.</a> Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).</li><li>DL, R. i. d. d. l. e., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+II.">C. elegans II.</a> Cold Spring Harbor Monograph. 1, 1222 (1997).</li><li>Cotella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+role+of+k++channel+oxidation+in+Mammalian+brain.">Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).</li><li>Cai, S. Q., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+a+potassium+channel+causes+progressive+sensory+function+loss+during+aging.">Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).</li><li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons:+a+new+family+of+chemosensory+receptors.">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li><li>Caserta, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q-VD-OPh,+a+broad+spectrum+caspase+inhibitor+with+potent+antiapoptotic+properties.">Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties.</a> Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).</li><li>Christensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells.">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנו מתארים גישה משולבת, ללמוד היבטים תאיים ומולקולריים של amylopathies באמצעות ג elegans. היתרונות של גישה זו כוללים: 1.) בעלות הנמוכה C.elegans נשמר בצלחת פטרי עם חיידקים נורמלי זורעים, בטמפרטורת חדר. 2) גנטיקה עוצמה. ניתן להשיג בבעלי חיים מהונדסים בכמה חודשים, ומגוון רחב של רצפי האמרגן זמין לנהוג ביטוי של הגן הרצוי בתאי עצב מסוימים. 3) פשוט, מאופיין היטב, מערכת עצבים. ג elegans בעל מערכת עצבים פשוטה להפליא (302 נוירונים). פשטות זו העניקה אפיון נרחב של מערכת העצבים של התולעת כולל משפחה של תאים, פונקציה / תפקיד ספציפי של כל נוירון והקשרים סינפטיים שלה. המגבלות של ג elegans כולל את גודלו הקטן של התאים, אשר מעכב את היישום של טכניקות סטנדרטיות ביוכימיות כגון אימונוהיסטוכימיה ועור עבה (ציפורן) שמבודד Neurons ליצור הסביבה החיצונית. לכן, גישות תרופתיות עשויות להיות של יעילות מוגבלת בג elegans. תרבויות של תאים ראשוניים מייצגות אסטרטגית תוקף באופן חלקי כדי לשפר את הבעיה הזו. את השלבים הקריטיים בפרוטוקולי ניסוי אלו כוללים החל מכמויות גדולות של תולעים ומעקב אחר ההכנות כדי שלא תאבד את הביצים, וכו &#39;עוברים. היא גם חיונית כדי ללמוד כיצד להתמודד עם בעלי החיים במהלך הזרקה. שמירה על תולעים בכרית agarose ארוך מדי, ניקובם עם טפטפת או הזרקה גדולה מדי תמהיל DNA יכולה באופן בלתי הפיך לפגוע בהם. יעילות שינוי, שחזור וtransgene ביטוי עשוי להשתנות. יעילות קשורה לטוהר של תמהיל ההזרקה והרכבו (נוכחות ללא קידוד ה-DNA). מערכי extrachromosomal משתנים מחיה לחיה ולכן זה קריטי להקים לפחות 2-3 קווים, עצמאיים לtransgene. מצד השני, התוספת של מתעכלתהדנ&quot;א הגנומי לתערובת מייצג אסטרטגיה חוקית כדי להפחית מהונדס יתר ביטוי. מבחני chemotaxis יחסית ללא בעיות. עם זאת, הוא חיוני כדי לשמור על עקביות במפל הריכוזים כדי להימנע מתוצאות שגויות. השתמש בפיסות אגר באותו הגודל, למשל לחתוך אותם עם פיפטה פסטר ולשמור על האיזון קבוע בזמן. אם בכלל, להסיר את הפתרון עודף עם מקלון צמר גפן. לסיכום, אנו מספקים כאן דוגמה כיצד ניתן לנצל האורגניזם פשוט, צייתן גנטי כדי לחקור היבטים מולקולריים של amylopathies. את אותן טכניקות ניסיוניות יכולה להיות מיושמות על המחקר של חלבונים עצביים אחרים והדור של מודלים של בעלי החיים חדשים של מחלה.

בטא עמילואיד (Aβ) הוא פפטיד של 36-43 חומצות אמינו שתקום לאחר מחשוף רציף של החלבון המקדים עמילואיד (APP) ועל ידי β secretases 1 γ. Secretase γ מעבד סוף C-המסוף של הפפטיד Aβ והוא אחראי עליה אורכים משתנים 5. הצורות הנפוצות ביותר של Aβ הן 40 Aβ וAβ 42, האחרון להיות קשור יותר בכינוי לתנאים פתולוגיים כגון 5 לספירה. בריכוזי Aβ טופס β גיליונות גבוהים שמצרף ליצירת סיבי עמילואיד 6. פיקדונות סיבים הם המרכיב העיקרי של פלאק סנילי סביב הנוירונים. שני לוחות ו oligomers Aβ diffusible, לא פלאק, הם חשבו מהווים צורות פתוגניים הבסיסיות של Aβ. מעבדת מחקר של amylopathies העצבי הוא מסובך בשל העובדה כי תנאים אלה התקדמות עם זמן. לכן, זה importanלא לפתח חיה צייתנית גנטי דגמים-משלים לעכברים עם תוחלת חיים קצרה. מודלים אלה יכולים לשמש כדי להבהיר היבטים ספציפיים של amylopathies-בדרך כלל סלולרי ו, מולקולרי ומכוח הפשטות שלהם לעזור כדי ללכוד את המהות של הבעיה. תולעת Caenorhabditis elegans הנפילות היא קטגוריה זו. יש לו תוחלת חיים קצרה, ~ 20 ימים ובנוסף תהליכים תאיים בסיסיים, כולל רגולציה של ביטוי גנים, סחר בחלבון, קישוריות עצבית, synaptogenesis, איתות תא, ומותו הם דומים ל7 יונקים. תכונות ייחודיות של התולעת כוללות גנטיקה וחוסר מערכת כלי, המאפשר ללמוד באופן עצמאי נזק עצבי של נזק בכלי הדם רבי עוצמה. מצד השני, חוסר מוח מגביל את השימוש בג elegans ללימוד היבטים רבים של ניוון מוחיים. בנוסף, לא ניתן לבצע העתקה וזיהוי של הפצות אנטומיים של נגעים באורגניזם זה. מגבלה אחרתations כולל קושי להעריך את שני ההבדלים בביטוי גן פרופילים וירידת הערך של התנהגות מורכבת ותפקוד זיכרון. כאן אנו מתארים שיטות להפקת ג מודלים של amylopathies elegans.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>1. NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J637</td>
			<td>17 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-peptone</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J636</td>
			<td>2.5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 975 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>1 ml of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>1 ml of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3045</td>
			<td>1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>25 ml of 1M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>2. Potassium phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>108.3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td>35.6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>3. M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>1 ml of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>118 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td>48 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4880</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>5. CM-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 culture medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11415</td>
			<td>450 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>50 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>50 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>6. Other Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon 700 oil</td>
			<td>Halocarbon Products</td>
			<td>9002-83-9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &mu;m Acrodisc Syringe Filter</td>
			<td>PALL Co.</td>
			<td>4199</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6137-5UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S320</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a caenorhabditis elegans model system for amylopathy study

Amylopathy הוא מונח המתאר את הסינתזה חריגה והצטברות של בטא עמילואיד (Aβ) ברקמות עם זמן. Aβ הוא סימן היכר של מחלת אלצהיימר (AD), והוא נמצא בדמנציה לוי גוף, שררת גוף הכללה וangiopathy עמילואיד המוחי 1-4. Amylopathies לפתח בהדרגה עם זמן. מסיבה זו אורגניזמים פשוטים עם תוחלת חיים קצרות עשויים לעזור להבהיר היבטים מולקולריים של תנאים אלו. כאן, אנו מתארים פרוטוקולי ניסוי ללמוד ניוון מוחיים Aβ בתיווך באמצעות elegans Caenorhabditis התולעת. לפיכך, אנו בונים תולעים מהונדסים על ידי הזרקת Aβ אנושי קידוד ה-DNA 42 לבלוטות מין סינסיציאלי של הרמפרודיטים בוגרים. קווי Transformant הם התייצבו על ידי שילוב מושרה mutagenesis. נמטודות הם גיל מסונכרן על ידי איסוף וזריעת הביצים שלהם. התפקוד של נוירונים המבטאים Aβ 42 נבדק במבחני התנהגות מתאימים (assay chemotaxisים). תרבויות עצביות העיקריות שמקורם בעוברים משמשות כדי להשלים נתונים התנהגותיים וכדי לבדוק את ההשפעות של neuroprotective תרכובות אנטי אפופטוטיים.

עם הפרוטוקולים שלנו אנחנו לומדים את ההשפעות של 42 oligomer Aβ האנושי על תפקוד עצבי 8. Aβ בר הקידוד אנושי 42 ואת רצף הפפטיד האות המלאכותי הקידוד של אש וקטור pPD50.52 היה מוגבר ממבנה PCL12 9 באמצעות פריימרים שהציגו אתר endonuclease הגבלת 1 Sma בקצוות. הבר היה אז מוכנס לתוך מבנה המכיל רצף אמרגן 2,481 FLP-BP-6 בוקטור אש pPD95.75 בין Sma האתר הייחודי 1 10. תוך שימוש בטכניקות השינוי המתוארת בפרוטוקול 1 אנו נבנו תולעת מהונדסת מבטא Aβ 42 בתאי העצב (ASE זן FDX (ses25)) 8. כדי לסמן transformants חיובי השתמשנו בכתב GFP P gcy-5 :: שדווקא מניע את הביטוי של GFP בASE ימין (aser) 11 נוירון. תולעים להיצמד למשטח בגלל agarose היבשה סופגת את המים שלהם. לכן זה CRUחברתי שבעלי החיים מונחים על הכרית והזריקו הזריקה במהירות יחסית, משום שאחרת הם לייבש ולמות. אחוז צאצאי F1 שנושא מערך extrachromosomal transmissible עשוי להשתנות. ערכים אופייניים הם בטווח 3-7%. חשוב שתערובת ההזרקה (1.1.3) מכילה הומולוגיה ברצף ה-DNA הלא שיתוף עם קידוד ה-DNA המהונדס (בדרך כלל וקטור ריק) כי DNAs לעבור הומולוגי רקומבינציה אחד עם השני. עם זאת, אם ביטוי יתר של transgene הוא בעיה צריכה להיות בתוספת תערובת ההזרקה עם 50-100 ng / μl של הדנ&quot;א הגנומי מתעכל עם 1 SCA. נוירונים ASE לזהות מים משיכה מסיס כגון ביוטין ולכן תפקידם ניתן להעריך במבחני התנהגות (assay chemotaxis, פרוטוקול 2 ו1A ו-1B דמויות) 12. בניסוי טיפוסי, בדקנו תולעי שבע יממה מבטאים P gcy-5 :: GFP לבד (DA1262 זן) או עם Aβ 42 (FDX (ses25)) עבורchemotaxis לביוטין. בתולעים צעירים (יום 3-4 ישן) את ההשפעות של 42 ביטוי Aβ הן צנועות אבל כבר להבחין (~ ירידה של 10% במדד chemotaxis, ראה נ&quot;צ. 8). נציג תוצאות של ניסוי זה מוצגות ב1C 1D ודמויות. רוב DA1262 תולעים נמצאו ב, או בקרבת מקום, מקום attractant (איור 1 ג). בניגוד לכך רק כמה תולעים מבטאים Aβ 42 יכולים למצוא את מקום attractant (1D איור). בדקנו שהופצו ב5 צלחות / גנוטיפ מבחן קבלת למדד chemotaxis ביוטין 0.68 ± 0.09 ו0.12 ​​100 גנוטיפ חיות / ± 0.04 לDA1262 וFDX (ses25), בהתאמה. תולעים פעילים נאספו בנפרד והועברו למרכז צלחת הבדיקה. זה חשוב לא רק למהירות, אלא גם בעדינות להעביר את התולעים כי אחר הם עלולים להישאר פעילים במשך כמה דקות ולא מצליח לעקוב אחר attractant. בסופו של הניסוי אנו ממליצים לפקח תולעיםctivity ע&quot;י הסתכלות בדרכיהם. אם רק כמה מסלולים נראים שאנחנו בדרך כלל זורקים את הצלחת. GFP הקרינה בתאי עצב aser של FDX (ses25) תולעים נעלמת בתוך האחד עשרה הימים הראשונים לחייו (לא מוצג). הדבר מצביע על כך תאים אלה עוברים אפופטוזיס בשל נוכחותם של 42 Aβ. לכן אנו קובעים אם מעכב ספקטרום רחב של אפופטוזיס כגון caspase המעכב N-(2-Quinolyl) valyl-aspartyl-(2,6-difluorophenoxy) קטון תיל (Q-VD-Oph) 13 יכולים לעצור את האובדן של תאי aser . לשם כך אנחנו עובדים נוירונים בתרבית aser עיקריים מ -14 עוברים, אשר הוכנו כמתואר בפרוטוקול 3. נציג תמונות של נוירון aser בFDX (4 יום ישן) צעיר (ses25) תולעת יחד עם תמונות של נוירונים בתרבית מוצגות איורים 2A-C. תאים בתרבית aser היו קצרים ימים (איור 2 ד). כדגירה צפויה עם 0.3 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​Q-VD-Oph טרי בתוספת יומית, ג<html> ompletely עצר את האובדן של תאי עצב aser ניאון. כאשר עובד עם תאי עצב עיקריים בתרבות זה חשוב לשמור על צפיפות תאים מתאים. פרמטר זה בעיקר תלוי במספר התולעים המשמשים כדי לחלץ את הביצים. אנו מודדים את צפיפות תאים עם hemocytometer סטנדרטי ולטפל מסוימים כדי לשמור על תא צפיפות קבועה מתרבית תאים לתרבית תאים. בניסויים תרופתיים, כגון אלה שתוארו כאן עבדנו עם ~ 200,000 תאים / 2 ס&quot;מ שהיה מתקבל על ידי קצירת ארבע צלחות ס&quot;מ 10 מחוברות. תאים היו מצופה ב12 בארות של צלחת 24 באר. לקבלת תוצאות אופטימליות חשוב גם לנתק את התאים העובריים לפני הזריעה כפי שהם נוטים ליצור גושים. אנו משתמשים במזרק עם מחט מד 27 ואצולה לשאוב את ההשעיה הלוך ושוב כמה פעמים. זה בדרך כלל מספיק כדי לנתק את רוב התאים (במיוחד בהתחלה אנו ממליצים לבדוק את ההשעיה תחת מיקרוסקופ). <html> t &quot;עבור: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50435/50435fig1.jpg" /> איור 1. assay chemotaxis. א צלחת chemotaxis נציג. כתמי attractant (ביוטין) ובקרה מסומנים בעיגול חלול ומלא. ב צלחת chemotaxis עמוסת חתיכת קוטר 0.5 סנטימטר של אגר תשמש להקמה הדרגתית של ביוטין. חתיכה אגר נחתכה מצלחת של 10 ס&quot;מ באמצעות הצד העליון של התפלגות זכוכית פיפטה פסטר. ג נציג של תולעים סביב נקודת attractant. בדוגמה זו רוב DA1262 התולעים היו מסוגלים למקם את מקור attractant (ביוטין). ד כמו בג לFDX (ses25) תולעים. תולעים ביוטין, רגישים אלה הציגו הפצה פזורה ברחבי הצלחת ורק מעטים נמצאו בסמוך למקום attractant. tp_upload/50435/50435fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. תרבות של ג תאים עובריים elegans. תמונת א פלואורסצנטי מיקרוסקופיה (תמונה משמאל) ואור בהיר (בתמונה מימין) שנלקחו מFDX (ses25) ראש תולעת מהונדס. תולעת זו מבטאת GFP בנוירון aser מונע על ידי-5 gcy האמרגן. תמונת האור בהירה ב &#39;של תרבות של FDX (ses25) תאים עובריים. בר סולם הוא 5 מיקרומטר. תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ג FDX תרבותי (ses25) aser נוירון. תמונות צולמו עם מיקרוסקופ אולימפוס BX61 מצוידים במצלמה דיגיטלית. ניסוי נציג ד בודק את הכדאיות של גיל מסונכרן, נוירונים בתרבית, aser. תאים נלקחו מעוברי DA1262 (עיגולים חלולים) או (FDX ses25) עובר מתוחזק בהעדר / נוכחות של 300 ng / ml Q-VD-Oph (ריבועים חלולים ומלאים, בהתאמה). היעלמותו של ה-GFP הקרינה שימש כמדד לכדאיותו של תא עצב. לשעברperiment התחיל עם ~ 300 נוירונים aser ניאון. כדאיות מחושבת כ100 * (מספר תאי ניאון ביום X מחולק במספר תאי ניאון ביום 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50435/50435fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study at JoVE.com

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

אנו מתארים שיטות ללמוד היבטים של amylopathies בתולעת<em&gt; ג elegans</em&gt;. אנחנו מראים כיצד לבנות תולעים מבטאים Aβ האנושי<sub&gt; 42</sub&gt; בתאי עצב וכיצד לבדוק את תפקודם במבחני התנהגות. בנוסף, אנו מראים כיצד להשיג תרבויות עצביות עיקריות שיכול לשמש לבדיקה תרופתית.

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

a-caenorhabditis-elegans-model-system-for-amylopathy-study

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

10.4K Views.  University of Medicine and Dentistry of New Jersey. אנו מתארים שיטות ללמוד היבטים של amylopathies בתולעת ג elegans. אנחנו מראים כיצד לבנות תולעים מבטאים Aβ האנושי 42 בתאי עצב וכיצד לבדוק את תפקודם במבחני התנהגות. בנוסף, אנו מראים כיצד להשיג תרבויות עצביות עיקריות שיכול לשמש לבדיקה תרופתית.

Video: A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &amp;#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

Assaying β עמילואיד רעילות באמצעות טראנסגנטי ג elegans דגם

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

שיטות לחקר מנגנוני פעולה של אנטי פסיכוטיות סמים ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

א<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; מצב תזונתיים מבוססי Assay Assersion

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

הדמיה של קוצים דנדריטיים בקאנורהבדיטיס אלגנס

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor impairment that worsens with time. While considerable advances have been made in determining genetic drivers of ALS for a subset of patients, the majority of cases have an unknown etiology. Further, the mechanisms underlying motor neuron dysfunction and degeneration are not well understood; therefore, there is an ongoing need to develop and characterize representative models to study these processes. Caenorhabditis elegans can adapt their movement to the physical constraints of their surroundings, with two primary movement paradigms studied in a laboratory environment- crawling on a solid surface and swimming in liquid. These represent a complex interplay between sensation, motor neurons, and muscles. C. elegans models of ALS can exhibit impairment in one or both of these movement paradigms. This protocol describes two sensitive assays for evaluating motility in C. elegans: an optimized radial locomotion assay measuring crawling on a solid surface and an automated method for tracking and analyzing swimming in liquid (thrashing). In addition to the characterization of baseline motor impairment of ALS models, these assays can detect suppression or enhancement of the phenotypes from genetic or small molecule interventions. Thus, these methods have utility for studying ALS&#160;models and any C. elegans strain that exhibits altered motility.

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol describes two sensitive assays for discriminating among mild, moderate, and severe motor impairment in C. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis, with general utility for C. elegans strains, with altered motility.

הערכה של ליקוי מוטורי בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...