עבודה זו נתמכה על ידי מענק G12-RR003060 מ-NIH / NCRR / RCMI, להעניק SC1HD068129 מהמכון הלאומי יוניס שרייבר של בריאות ופיתוח אנושי לילדים, הקרן הלאומית למדע CBET 0,754,158 וPSC-CUNY 62,337-00 40 מאוניברסיטת העיר ניו יורק.

הפרוטוקול הבא עוקב אחר הנחיות טיפול בבעלי החיים שהוקמו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) בסיטי קולג&#39; של ניו יורק. 1. בעלי החיים אינטובציה (דקות 10-20) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הניתוח, להכין פתרון Ringer של יונקים. להרכיב את הכלים כירורגיים, כרית חימום, והנשמת חיה קטנה על הספסל (איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדידות של חדירות מחסום דם המוח להפוך 10 מיליליטר של 1% אלבומין בסרום שור פתרון (BSA) ברינגר ולפזר TRITC-dextran 155 KD ב8 מ&quot;ג / מיליליטר בפתרון BSA 1%, פתרון סינון עם מסנן מזרק 25 מ&quot;מ (0.2 מיקרומטר גודל הנקבובית) ולאחסן במזרק מכוסה בנייר כסף בחושך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה באמצעות isoflurane. השתמש .5.0% לזירוז ו1.5-3.0% לצורך התחזוקה. לחלופין תערובת של קטמין (41.7 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (2.5 מ&quot;ג / קילוגרם גוף) יכולה לשמש. עומק ההרדמה ניתן לבדוק על ידי רפלקס קמצוץ הבוהן שלגפיים העליונים ותחתונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המנות הבאות של קטמין (41.7 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף) ו xylazine (2.3 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף) צריכה להינתן במרווחים של ⅓ מהמינון המקסימאלי, כדי למנוע מינון יתר. שימוש בהנשמת מכרסמים מומלץ לנטרל דיכאון בדרכי הנשימה הנגרם xylazine. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הגור הרדים שוכב על צד הגב שלו ולאבטח את ראשה עם קונוס הפלסטיק המשמש כדי לספק את חומר ההרדמה (איור 3 א). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את החיה עם דבק על הגפיים הקדמי וזנב (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלופי כדי לאבטח את ראשו של הגור הוא להשתמש בצלחת את הראש המחובר לסרגל מתכת. הערה: ודא שכרית החימום מוגדרת 37 ° C כדי למנוע היפותרמיה (איור 3 א). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים (איור 2b) לעשות אחד אורכי וארבעה חתכים לרוחב על העור שמעל הצוואר (איור 3 ב). באמצעות טכניקה בוטה, לנתח את העור ומניח אותו בצד באמצעות מלקחיים (2c דמויות וג 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את העור כלפי מטה באמצעות נייר דבק. לייצב את הראש במצב אופקי (איור 3c). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים באביב (איור 2) וטכניקה בוטה, בלוטות דחיפה ושכבות שומן הצידה כדי לחשוף את קנה הנשימה (איור 3c). לזהות את המיקום של עורקי הראש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את עורקי הראש מקנה הנשימה. הערה: ניקוב עורקי הצוואר יכול לגרום לאובדן מסיבי דם ומותו של הגור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים באביב (איור 2) לנתח את שרירי אורך המכסים את קנה הנשימה. חותכים את שרירי האורך ממוקמים מתחת ל( 3d איור) קנה הנשימה. הערה: טבעות קנה הנשימה צריכה להיות לעין (3E איור). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעותמלקחיים (איור 2 ג), לקשור את שתי חתיכות של תפר סביב קנה הנשימה. פיסת תפר אחד לא לאבטח את צינור אוורור ואת החוט השני יהיה בשימוש כדי לסגור את קנה הנשימה מקורי עד לנקודת שצינור אוורור ההכנסה (איור 4 א). הערה: ללחלח נחשף רקמות באופן קבוע עם פתרון Ringer כדי למנוע התייבשות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים באביב (איור 2) עושה חתך באחת הטבעות קנה הנשימה ממוקמות בין שני הנושאים שהציבו בשלב 1.6.1 (איור 4C). הערה: יש לוודא שאין נוזל נכנס לקנה הנשימה הפתוח. נוזלים בקנה הנשימה יגרמו לחנק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צינור אינטובציה (איור 4) לתוך קנה הנשימה ולהדק את החוט התחתון כדי לאבטח אותו. בעזרת מלקחיים (איור 2 ג), להדק את החוט העליון כדי לסגור אחורי קנה הנשימה עד לנקודה של צינור אינטובציה הכניסה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tighten ולקצץ את הקצוות של שני החוטים (4d-f איור). הערה: החמקן בתוך צינור אינטובציה זה סימן טוב של שליטת זרימת אוויר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להחליף את אספקת isoflurane למכונת ההנשמה. התאם את שבץ קצב תחלופת אוויר נפח ובהתאם למשקלו של בעל החיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הרקמה שמסביב החשוף עם אלסטומר (איור 5 א). שמור על המשטח טבול ונקי. </li></ol></li></ol> 2. קנו נשימה והסרת שריר כדי לחשוף את הגולגולת (5-10 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים באביב (איור 2) לחתוך את קנה הנשימה בסמוך לצינור האוורור. מבצע שני חתכים לאורך קיר השרירים של חלל buccal לחשוף את קצה הזנב של החיך (איור 5). הערה: במידת צורך, השתמש cauterizer כדי לעצור את הדימום. דימום בלתי מבוקר יגרום למותם של בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה אתאזור באמצעות כמויות עצומות של תמיסת רינגר (איור 5 ג). לזהות את הפער בין החוליות האחרונות והעצם בשיא-העורפי (5D איור). הערה: הפער בין עצמות גולגולת הוא ציון דרך שימושית לאיתור מבני גזע המוח. הזית הנחותה נמצאת מתחת הפער הזה. מורכב olivary מעולה השמיעתית ממוקם מתחת לעצם בשיא-עורפי בכיוון מקורי מפער זה (ראה גם איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את האזור באמצעות מלקחיים (איור 2 ג) ומספריים באביב (איור 2). אין לנקב כלי דם. הערה: במידת צורך, לצרוב כדי לעצור את הדימום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהאיזור החשוף נקי של שומן ורקמת שריר, החלל המפריד בין העצם בשיא-עורפי והחוליה האחרונה צריך להיות (5D איור) נראה לעין. </li></ol></li></ol> 3. Craniotomy (15-30 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש microdrill או אולטרהניקוי קולי. אתר את הקיר המדיאלי של הבולה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דקה הגולגולת על ידי ביצוע צורת D הפוך עד לעורקים שבבסיס נראים לעין (5e איור). הערה: עורק basilar (BAS) פועל על גבי קו האמצע גזע המוח. העורק הקדמי cerebellar הנחות סניפים (aica) בילטרלי וניתן להשתמש בם באופן אמין כנקודת ציון שכן יש עמדה קבועה בבעלי חיים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הגולגולת היא דלילה, בעדינות לשבור אותו בעזרת אזמל ניתוחים (2E איור). הסר את פיסת העצם עם מלקחיים (איור 2 ג). לחלופין, להרים ולשבור את הגולגולת באמצעות מחט עקומה. הערה: חזור על הליך זה עד לגודל והצורה של פתיחת הגולגולת היא מתאים לניסוי המתוכנן. Bas וaica צריך להיות גלויים דרך קרום הדורה (5F איור). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את האזור מספר פעמים עם פתרון Ringer טרי. באמצעות הרשות סופגתds לייבש את פני השטח של קרום הדורה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, להשתמש במחט תפר כדי להסיר את קרום הדורה ללא עקירתם או לשבור את bas עורקי הציון וaica. שים לב: עם הדורה ניקוב נוזל השדרתי תזרום החוצה. נקה את האזור עם פתרון Ringer ולשמור לחים לאורך כל הניסוי. </li></ol></li></ol> 4. ניסוי אלקטרופיזיולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר polytrode על פי עיצוב ניסוי (איור 7 א). השתמש במכחול דק למעייל polytrode עם DiI. מעביר את פתרון DiI לתוך צינור microcentrifuge 1 מיליליטר, לטבול את המכחול בפתרון ובעדינות להכות polytrode תחת הדרכה חזותית (כלומר באמצעות stereoscope). התחל בקצה של החללית ולהמשיך בזהירות עד שכל אלקטרודות מצופות באופן אחיד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה הקרקע בתוך חלל הפה. טען את polytrode ל7b בעל אלקטרודה (איור </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המגבר ולבדוק שכל החיבורים פועלים היטב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את האלקטרודה מעל bas בנקודת aica (עמדה אפס) הסניף. הזז את האלקטרודה לנקודת היעד הרצויה על ידי שימוש ב( 7 ג איור) מקורי, לרוחב לתאם המתאימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה על פני המוח ולהעביר אותה לעומק הרצוי בקפיצות של 5-10 מיקרומטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הקלטה על פי תכנון ניסוי. שמור את הנתונים לניתוח נוסף. </li></ol> 5. ניסוי ההדמיה שני פוטונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המיקרוסקופ. קבע את אורך גל העירור ולהשתמש במסנן פליטה מתאים. עירור ב 800 ננומטר ועבודת ± מסנן פליטת להקה עוברת 45 ננומטר 607 גם הדמיה TRITC-dextran. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את העורק הראשי ימינה או שמאלה. באמצעות טכניקה בוטה לנתח את העורק הראשי מרקמות חיבור הסמוכות או עצבים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק ולהחזיק את הצווארעורק עם hemostat. לקשור את שלוש חתיכות של תפר סביב העורק הראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדק את החוט קרוב יותר לצד הלב כדי לעצור את זרימת הדם ולהשאיר את שני אשכולות האחרים רופפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים בסדר לעשות חתך קטן בזווית של ° 45 על העורק הראשי בין החוט קשור והחוט הרופף הבא. הערה: נקה את הדם עם נייר סופג. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate העורק הראשי. הכנס את צינורות התמלאו פתרון TRITC-dextran לחתך בעורק הראשי כ -5 מ&quot;מ אוריינטציה עמוק כלפי ראשו של הגור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדק את שני נושאים האחרים סביב העורק להחזיק את צינורות ואת העורק יחד. הדק את החוטים, קיצוץ ולהוסיף אלסטומר לייצב עוד יותר. הערה: הצד השני של הצינור מחובר עם המזרק המכיל פתרון TRITC-dextran (מוכן בשלב 1.1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את המזרק במשאבת המזרק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערכהמהירות זרימת דם בעורקי התרדמה השיעור של הגור. הפעל את משאבת המזרק לכמה שניות ולבדוק באופן ידני שפתרון הצבע יהיה ניתן להזריק לתוך העורק הראשי. הערה: בהנחת שקצב זרימת דם בעורק הראשי של חולדות בוגרות (240-280 ז) היא כ 3 מיליליטר / דקה 14, את קצב זרימת הדם לגור חולדה (גור למשל P10 במשקל 15-25 גר &#39;) ניתן לחשב כדי מגוון 0.16-0.3 מיליליטר / דקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה תחת מטרת מיקרוסקופ. הזרק dextran הניאון למחזור הדם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי תחומי העניין בגזע מוח הגחון עם מטרת מיזוג 5X. לעבור לאובייקטיבי 20X או 40X (טבילה במים, NA = 0.5 או 0.8, בהתאמה) להתמקד באזור של עניין (ROI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל הדמיה ולהתאים את הפרמטרים רכישת תמונה (למשל זמן חשיפה, כוח הלייזר, רווח גלאי) עד שעוצמת הקרינה בכלי הדם של ההחזר על ההשקעה הוא מותאם (כלומרלא נמוך מדי אבל לא רווי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת המזרק כדי להזריק את פתרון הצבע לתוך העורק הראשי ולרכוש סדרת זמן במישור מוקד קבוע. </li></ol></li></ol> 6. ההליך הבא טיפול בבעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהו הליך מסוף. בסופו של חיות ניסוי חייב להיות מורדמים עם מנת יתר של Pentobarbital (100 מ&quot;ג / קילוגרם, זריקת intraperitoneal) או כל שיטה אחרת של המתת חסד שאושר על ידי הנחיות המתת חסד אמריקנית לרפואת וטרינרית. הערה: זלוף דרך הלב עם פתרון Ringer אחריו עם פתרון מקבע מומלצת לניתוח היסטולוגית נוסף. </li></ol>

<ol>
	<li>Kerr, J. N. D., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo:+watching+the+brain+in+action.">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).</li><li>Sigler, A., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+2-photon+imaging+of+fine+structure+in+the+rodent+brain:+before,+during,+and+after+stroke.">In vivo 2-photon imaging of fine structure in the rodent brain: before, during, and after stroke.</a> Stroke. 41 (10), 117-123 (2010).</li><li>Shi, L., Zeng, M., Sun, Y., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+blood-brain+barrier+solute+permeability+and+brain+transport+by+multiphoton+microscopy.">Quantification of blood-brain barrier solute permeability and brain transport by multiphoton microscopy.</a> ASME J. of Biomech. Eng. 136 (3), 031005-031005 (2014).</li><li>Galambos, R., Schwartzkopff, J., Rupert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+study+of+superior+olivary+nuclei.">Microelectrode study of superior olivary nuclei.</a> Am. J. Physiol. 197, 527-536 (1959).</li><li>Goldberg, J., Brown, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+binaural+neurons+of+dog+superior+olivary+complex+to+dichotic+tonal+stimuli:+some+physiological+mechanisms+of+sound+localization.">Response of binaural neurons of dog superior olivary complex to dichotic tonal stimuli: some physiological mechanisms of sound localization.</a> J. Neurophysiol. 32 (4), 613-636 (1969).</li><li>Guinan, J. J., Guinan, S. S., Norris, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+auditory+units+in+the+superior+olivary+complex+I:+responses+to+sounds+and+classifications+based+on+physiological+properties.">Single auditory units in the superior olivary complex I: responses to sounds and classifications based on physiological properties.</a> Intern. J. Neurosci. 4, 101-120 (1972).</li><li>Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recordings+from+cat+trapezoid+body+and+HRP+labeling+of+globular+bushy+cell+axons.">Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons.</a> J. Neurophysiol. 63 (5), 1169-1190 (1990).</li><li>Khosrovani, S., Der Giessen, R. S. V. a. n., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mouse+inferior+olive+neurons+exhibit+heterogeneous+subthreshold+oscillations+and+spiking+patterns.">In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (40), 15911-15916 (2007).</li><li>Rodr&#237;guez-Contreras, A., Van Hoeve, J. S., Habets, R. L., Locher, H., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+development+of+the+calyx+of+Held+synapse.">Dynamic development of the calyx of Held synapse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (14), 5603-5608 (2008).</li><li>Lorteije, J. A., Rusu, S. I., Kushmerick, C., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+precision+of+the+mouse+calyx+of+Held+synapse.">Reliability and precision of the mouse calyx of Held synapse.</a> J. Neurosci. 29 (44), 13770-13784 (2009).</li><li>Tritsch, N. X., Rodr&#237;guez-Contreras, A., Crins, T. T., Wang, H. C., Borst, J. G. G., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+action+potentials+in+hair+cells+pattern+auditory+neuron+activity+before+hearing+onset.">Calcium action potentials in hair cells pattern auditory neuron activity before hearing onset.</a> Nat. Neurosci. 13 (9), 1050-1052 (2010).</li><li>Tong, H., Steinert, J. R., Robinson, S. W., Chernova, T., Read, D. J., Oliver, D. L., Forsythe, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Kv+channel+expression+and+neuronal+excitability+in+rat+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body+maintained+in+organotypic+culture.">Regulation of Kv channel expression and neuronal excitability in rat medial nucleus of the trapezoid body maintained in organotypic culture.</a> J. Physiol. 588 (9), 1451-1468 (2010).</li><li>Sonntag, M., Englitz, B., Kopp-Scheinpflug, C., R&#252;bsamen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+postnatal+development+of+spontaneous+and+acoustically+evoked+discharge+activity+of+principal+cells+of+the+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body:+an+in+vivo+study+in+mice).">Early postnatal development of spontaneous and acoustically evoked discharge activity of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body: an in vivo study in mice).</a> J. Neurosci. 29 (30), 9510-9520 (2008).</li><li>Garc&#237;a-Villal&#243;n, A. L., Roda, J. M., Alvarez, F., G&#243;mez, B., Di&#233;guez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+blood+flow+in+anesthetized+rats:+effects+of+carotid+ligation+and+anastomosis.">Carotid blood flow in anesthetized rats: effects of carotid ligation and anastomosis.</a> Microsurgery. 13 (5), 258-261 (1992).</li><li>Yuan, W., Lv, Y., Zeng, M., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+the+measurement+of+solute+permeability+of+rat+pial+microvessels.">Non-invasive method for the measurement of solute permeability of rat pial microvessels.</a> Microvasc. Res. 77 (2), 166-173 (2009).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Ha&#252;sser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo.">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window.">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

זמן הוא קריטי. חוקר מנוסה צריך להיות מסוגל להשלים את הפרוטוקול זה בשעה 1 (שלבים 1-3). הפעמים נאמרו לצעדים השונים מניחות בינוניות לרמה הגבוהה של מומחיות. הנשמה ואינטובציה נכונה בזמן נכון הן קריטיים, שכן שליטת אוורור הלקויה יכולה להוביל לחנק ומוות של בעלי החיים. פינוי זהיר של רקמות שריר ושומן הוא גם מאוד חשוב, כי טעויות יכולות להוביל לדימום ולמוות בלתי מבוקרים של בעלי החיים. בדומה לכך, בעת הכנת העורק הראשי להכנסה canula, צריך להדק ולחתוך את העורק בזהירות, אם קשר החוט הופך רפוי דימום בלתי נשלט יתקיים. לבסוף, פתיחת הגולגולת צריכה להיעשות בזהירות, מבלי לשבש את ציוני הדרך בכלי הדם. ההסרה רשלנית של השכבה החיצונית קרום המוח (דורה) יכולה להוביל לדימום ונזק של אספקת העורקים חמורים. הגדרות אוורור נבחרות בהתאם לגילו של בעל החיים.רוב הספקים המסחריים מספקים מידע שימושי אודות הגדרות כאלה. ניסויים בחולדות מבוגרות יותר P15 ידרשו שימוש במכונת הנשמה של בעלי חיים גדולה. בעלי חיים מבוגרים ייתכן שלא צריכים אוורור אם מורדם עם קטמין / xylazine, אבל אינטובציה מומלצת להימנע מנוזל שנכנס לקנה הנשימה. מגבלה העיקרית אחת של פרוטוקול זה היא שניתן לבצע רק ניסויים בחריפות. במעבדה שלנו יש לנו לבצע ניסויים שנמשכו בין שניים לעד עשר שעות. מגבלה שנייה היא שניסויים צריכים להתבצע תחת הרדמה. לכן, הבחירה של חומר הרדמה היא משתנה חשוב להביא בחשבון בתכנון ובעיצוב של ניסויים. סוגיה קרובה היא כי בעלי חיים ילוד יכולים להיות רגישים במיוחד למינון יתר. לדוגמא, אם בוחר קטמין / תמהיל xylazine, לחשב את המינון המבוסס על המשקל של הגור ולנהל תרופות ב⅓ מהנפח המקסימאלי. בדוק את מצבו של בעל החיים בכל 5-10 דקות על ידי r קמצוץ הבוהןesponse. אם באמצעות isoflurane, אמצעי זהירות נחוץ גם כדי לשמור על סביבה בטוחה לחוקר (אוורור נאות, ומאדה מכויל כראוי). סטראו יכול להיות מותקן על בעל גמיש כדי להתאים את זווית צפייה ולהקל על פינוי מקום למקום אלקטרודות והעברה של בעלי החיים למיקרוסקופ שני פוטונים. שימוש בסוללה לשלטון ההנשמה יכול להקל על העברת בעלי החיים ולצמצם את החפצים חשמליים במהלך ניסויי אלקטרופיזיולוגיה. לשם כך, קרש חיתוך קטן (7.5 x 12 סנטימטר) יכול לשמש כדי להרכיב יחד את מכונת ההנשמה, כרית חימום ו( איור 2 א) חיה הרדים. שינוי שימושי וחשוב להגדרה זו הוא התוספת של מכשיר לניטור סימנים חיוניים במהלך ניתוח. Oxymeter או התקנים אנלוגיים אחרים ניתן להשתמש בהתאם לתקציב המעבדה. פרוטוקול זה כבר נעשה שימוש באלקטרופיזיולוגיה והדמיה נפגשהמגשי בנאים, כולל הקלטות צמד תיקון 8,10,11, הקלטות polytrode (איור 7), ושני פוטונים הדמיה 9 (איורים 6 ו -8). יישום עתידי אפשרי אחת יהיה לשלב שיטות אלה למיקוד תאים שכותרתו fluorescently להקלטת אלקטרו 16. יישומי הדמיה חדשים עשויים לכלול גם 2-D או סדרת זמן 3-D באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים. לדוגמא, באמצעות טעינת בולוס של מדדי סידן כדי ללמוד את הפעילות עצבית בגזע המוח ואוכלוסיות תאי גליה. כפי שניתן לראות באיור 8, פתרון צבע מוזרק לתוך מחזור הדם דרך העורק הראשי יכול לשמש כדי ליצור תמונות עם ניגודיות גבוהות של כלי הדם במוח. כצבע פלואורסצנטי ממלא את לומן הדם הקטן ומתפשט לרקמות שמסביב, זה יכול לשמש לא רק לחישוב החדירות מומסות, לכאורה, של מחסום דם המוח, אלא גם COEF דיפוזיה המומסficient ברקמת המוח 3. אחת סיבות עיקריות להזרקת המומסים שכותרתו fluorescently דרך עורק התרדמה היא שהפתרון לצבוע ישירות יכול ללכת לmicrovessels במוח מבלי להיכנס ללב הראשון כמו בהזרקה לוריד זנב. זה מביא לפחות שני יתרונות. אחת הוא שריכוז צבע פלואורסצנטי בלומן הדם הקטן יכול להיות קבוע כמעט, אם קצב טפטוף קבוע באתר cannulation. זה מבטיח קביעה מדויקת של חדירות מחסום דם המוח. נוסף הוא שאם סוכן בדיקה כלול בperfusate, זה יהיה ללכת ישירות למחסום דם המוח מבלי להיות מדולל או בשילוב עם גורמים אחרים ממחזור הגוף. ניסויים חדשים יכולים גם לקחת את יתרון של בעלי חיים מהונדסים עם כתבי ניאון מקודדים גנטי. זה יספק את היתרון שבדיקות ניאון לא צריכה להיות טעונות באתרו (אלא אם כן את העיצוב של הניסויקובע אחר), תוך חיסכון בזמן ואולי גם מאפשר ליותר הכנות שלמות (לדוגמא חלון גולגולתי 17). לבסוף, ניתן לעשות ניסויים באזורי גזע המוח אחרים כגון זית הנחות או בגרעין המוטורי פנים. ידע על neuroanatomy ופיתוח של אוכלוסיות תאיות ספציפיות במין נתון יהיה חשוב לקראת מטרה זו, במיוחד כציוני דרך אנטומיים עשויות להשתנות כחיות לגדול (איור 1). אנו מקווים פרוטוקול זה מעודד אחר ללמוד מבני גזע המוח הגחון באמצעות באלקטרו vivo ושיטות הדמיה.

השימוש בפתיחת גולגולת בשילוב עם דימות פלואורסצנטי וטכניקות אלקטרופיזיולוגיה מאפשרת זרימת דם ניטור, חדירות מחסום דם המוח ומדידת פעילותם של תאי עצב ותאי גליה בבעלי החיים 1-3. מספר מעבדות השתמשו בגישה זו כדי לספק תובנות לגבי הפיסיולוגיה של מוח בתנאים בריאים ומחלה, אך נותרו פערים בהבנה של איך תהליכים אלה להתעורר במהלך פיתוח שלנו. יתר על כן, רוב המחקרים התמקדו באזורים במוח שהם נגישים מהשטח הגבי של הגולגולת, כך שמבני גזע המוח הגחון עם תפקידים פיסיולוגיים מגוונים נחקרו בעיקר באמצעות vivo לשעבר גישות. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לספק שיטה לפתיחת craniotomy בגולגולת הגחון של מכרסמים. גישה זו הותאמה ממחקרים קלאסיים שבוצעו ביונקים גדולים יותר כגון כלבים וחתולים לreco נוירופיזיולוגיה חושיrdings של גזע המוח השמיעתי 4-7. בפרוטוקול זה לעומת זאת, יש את אתגר הרומן של ביצוע ההליך בבעלי חיים ילוד. באמצעות ציוני דרך בכלי דם, פרוטוקול מותאם זה כבר נעשה שימוש בעבר כדי ללמוד גזע המוח השמיעתי של חולדות ילודות, עכברים בוגרים ואזורי גזע המוח אחרים כמו הזית הנחותה 8-11 (איור 1). יתרון עיקרי של פתיחת גולגולת הגחון על פני שיטות קיימות ללמוד גרעיני גזע המוח הגחון הוא שהיא מספקת גישה ישירה למבני עניין בחי חיות. לדוגמא, התאים הקוליים של מתחם olivary מעולה הם נקודתיים כמה עשרות מיקרומטרים ממשטח המוח, וזה חשוב עבור מיקום ממוקד של בדיקות ולשימוש בגישות הדמיה שני פוטונים שבעומק ההדמיה יכול להיות מוגבלת ל0.5 מ&quot;מ על ידי פיזור אור רקמות וקליטה. פתיחת גולגולת הגחון מספקת גם הכנה עם קשרים עצביים יחסית ללא פגע, WHich הם שיבשו בהכנות פרוסה חריפות וorganotypic 12. בניגוד לפרוטוקולים אחרים לניסויי in vivo נוירופיזיולוגיה 13, גישת הגחון יכולה להיות משולבת במכשירי הקלטה רבת האלקטרודה ושיטות הדמיה המספקות מידע על הרכבים סלולריים (איורים 6 ו -7). לבסוף, בשילוב עם פרוטוקול זה מומס שכותרתו fluorescently ניתן להזריק בכלי הדם כדי למדוד שינויים בחדירות מחסום דם מוח למומס (איור 8).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Absorbant pads</td>
			<td style="width:71px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:119px;">Sugi 31603</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:216px;">Cautery</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">GEM&#160;5917</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1287-500MG</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dissecting Chisel</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">10095-12</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DiI</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">V-22885</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Elastomer</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">KWIK-SIL</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fine Scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14060-09</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11027-12,11617-12, 11616-16</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Spring Scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15009-08</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Heating pad</td>
			<td style="width:71px;">FHC</td>
			<td style="width:119px;">40-90-2</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Intubation tubing</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">BIO CO-KIT</td>
			<td style="width:167px;">Choose age appropriate size</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Light source</td>
			<td style="width:71px;">Spach Optics</td>
			<td style="width:119px;">Schott Ace illuminator&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Micro drill</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">MD-1200&#160;120V</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Paper tape</td>
			<td style="width:71px;">Walgreens</td>
			<td style="width:119px;">Generic brand</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:216px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">28145-483</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">52459-008</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">SZ61</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture</td>
			<td style="width:71px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">Prolene 86979</td>
			<td style="width:167px;">6-0 size</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120</td>
			<td style="width:167px;">Other options depending on pup&#8217;s age</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vaporizer (isoflurane)</td>
			<td style="width:71px;">Vetequip Incorporated</td>
			<td align="right" style="width:119px;">911103</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ventilator (minivent)</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">730043</td>
			<td style="width:167px;">Use for P0-P12 rats</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to make a craniotomy on the ventral skull of neonate rodents

השימוש בפתיחת גולגולת לin vivo ניסויים מספקת הזדמנות לחקור את הדינמיקה של תהליכים תאיים שונים במוח של היונקים בבגרות ובפיתוח. למרות שרוב in vivo גישות להשתמש craniotomy ללמוד אזורים במוח הממוקמים בצד הגב, אזורי גזע המוח כגון גשר המוח, הממוקם בצד הגחון יישארו יחסית understudied. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא כדי להקל על גישה למבני גזע המוח הגחון, כך שהם יכולים להיות למדו בvivo באמצעות אלקטרו ושיטות הדמיה. גישה זו מאפשרת למחקר של שינויים מבניים באקסונים ארוך טווח, דפוסים של פעילות חשמלית באחת והרכבים של תאים, ושינויים בחדירות מחסום דם מוח בבעלי חיים ילוד. למרות שפרוטוקול זה נעשה שימוש בעיקר כדי ללמוד את גזע המוח השמיעתי אצל חולדות ילודות, זה יכול בקלות להיות מותאם ללימודים במינים מכרסמים אחרים כגון עכברים ילודים, רודן מבוגרts ואזורי גזע המוח אחרים.

Electroporation של קליעים נותבים עצביים הגרעין המדיאלי של הגוף בצורת הטרפז (MNTB) הוא קבוצה של תאים במתחם olivary מעולה שנחקר בעבר שימוש בפרוטוקול זה. לדוגמא, ניתן להשתמש בטפטפות מהדק התיקון לelectroporate קליעים נותבים עצביים (איור 6) 9. כאשר טפטפות ממוקמות ליד קו האמצע, כפי שמוצגת באיור 6 א, התוצאה היא שהאקסונים מביא decussating מסומנים. מיקרוסקופ שני פוטונים מצויד מטרת טבילה במים גבוהה מספרית צמצם יכול לשמש לתמונת הסיבים להגיע MNTB, כולל סניפים בטחונות דקים מאוד (חיצים באיור 6). קליעים נותבים עצביים יכולים גם להיות מועברים לMNTB ישירות, כפי שמוצגים באיור 6 ג. התוצאה היא תיוג של תאי MNTB ואקסונים מביא, כפי שיכול להיות מוערך על ידי הדמיה עם מטרה נמוכה יותר צמצם מספרי טבילה במים (6 ד &#39;איור). מ &#39;יתרון של שימוש בעין אובייקטיבי ההגדלה הנמוכה הוא ששדה רחב יותר של ראייה ניתן לבחון, ולמרות שזה גורם לירידה ברזולוציה מרחבית בשל הצמצם המספרי האובייקטיבי נמוך יותר, ניתן להבחין בתאי MNTB בודדים היטב (חיצים באיור 6 ד) . משך הניסויים אלה הממוצע לגילים P1-P5 הוא 3.1 ± 1.4 שעה (n = 22 גורים). הקלטות אלקטרופיזיולוגיה ירי פרץ ספונטני הוא סוג של פעילות חשמלית התפתחותיות נצפה בתאי MNTB בודדים לפני תחילת שמיעת 11,13. באמצעות פרוטוקול זה כירורגית אפשר גם למקד מערכי multielectrode (polytrodes) לMNTB (איור 7 א-B). התוצאה היא הקלטה של פעילות ספונטנית בהרכב של תאי MNTB. 7e איור מראה הקלטת polytrode נציג מעכברוש P6. בניסוי זה, polytrode היה מצופה DiI צבע lipophylic באמצעותבמכחול דק (ראה שלב 4.1). לאחר ביצוע הקלטת המוח היה מעובד לניתוח היסטולוגית ומיקומו של מסלול polytrode כותרת DiI שימש כדי לאשר נכון מיקוד לMNTB (7d איור). משך הניסויים הממוצע לגילים P1-P6 הוא 2.0 ± 0.7 שעה (n = 33 גורים). מדידת חדירות microvessel גם פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע ניסויי הדמיה שני פוטונים של חדירות כלי דם. מומס ניאון (TRITC-dextran, MW 155 KD, סטוקס רדיוס ~ 8.5 ננומטר) פורקה ב 1% פתרון BSA רינגר ומוזרק למחזור הדם המוחי באמצעות canula הוכנס לעורק הראשי 14. בניגוד לזריקות לוריד זנב, הליך זה עוקף את הלב ומציג את מומס הניאון ישירות לזרימת הדם במוח. איור 8 א ממחיש את האיכות של תיוג של כלי דם בדם, הנובע משימוש בהליך זה. לאחר רציףזלוף של מומסים שכותרתו לתוך זרם הדם זה אפשרי להשיג רצף הזמן לשגות של אזור של עניין, כפי שמוצג באיור 8 ב. עוצמת הקרינה הכוללת באזור של העניין נמדדה במצב לא מקוון ומודל מתמטי המשמש לקביעת חדירות מחסום דם במוח לכותרתו fluorescently מומסים (8C איור) 15. משך הניסויים הממוצע לגילאי P9-P10 הוא 2.3 ± 0.8 שעה (n = 3 גורים). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. מיקום יחסי של מבנים עצביים בגזע מוח הגחון ביחס לציוני דרך בכלי דם בעכברים הילודים., נוף לצד של המוח. ב, נוף הגחון של המוח. כלי דם גדולים מוצגים במבנים אדומים ועצביים של עניין הם indicated ידי ריבועי צבע. לא נמשך לקנה מידה. aica = קדמי עורק המוח הקטן נחות; bas = עורק basilar; ICV = וריד מוחין נחותים; MCA = עורק המוח אמצעי; vert = עורק השדרה; VSP = עורק השדרה הגחון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. התקנת כירורגי., ניתוח יכול להיעשות על לוח לחם קטן (1) מונח על החלק העליון של ראש טבלה יציב. כרית חימום (2) והנשמת חיה קטנה (3) ניתן לחבר ללוח הלחם כדי להקל על העברת כל ההכנה בעת צורך. הנשמה של בעלי החיים הקטנים יכולה להיות מופעל על ידי סוללה (4). בעל מגנטי (5) ניתן להשתמש בו כדי לאבטח את חרטומו משמש כדי לספק את חומר ההרדמה. חרטומו יכולגם לעזור לאבטח את הראש במצב יציב. אם בעל החיים לא צריך להיות עקרים, micromanipulator (6) יכול לשמש לבדיקות עמדה לאלקטרופיזיולוגיה או ניסויי מעקב עצביים. מקור אור (7) וstereoscope (לא בתמונה) יש צורך לדמיין מבני ציון דרך במייקרו. ב, מספריים קטנים המשמשים בשלב 1.4. ג, מלקחיים המשמשים בצעדי 1.4, 1.6.1, 1.8.1 ו1.8 . ד, מספריים באביב נמצאים בשימוש בצעדים 1.5, 1.6 ו1.7. דואר, אזמל מנתחים משמש בשלב 3.1.2. סרגל קנה מידה במ&quot;מ e = 1, חל על BD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. חשיפת קנה הנשימה לאינטובציה., בעל החיים הוא מורדם, להציב בעמדה המועדת ומאובטח עם חרטומו וקלטת (קווים מקווקווים). ב, העור נחתך והניח הצידה כדי לחשוף את שכבת שומן שבבסיס. ג, השומן שמעליה ובלוטות (המוצג באפור) נדחקים הצידה כדי לחשוף את קנה הנשימה. קלטת משמשת כדי לאבטח את העור שמעליה (קווים מקווקווים). ד, קנה הנשימה היא גזור מהשרירים. דואר, ויזואליזציה של טבעות קנה הנשימה מצביעה על ההסרה מוצלחת של שרירים שמעליה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. Intubating בעלי החיים., שני נושאים שתפר (חצים לבנים) נקשרים סביב קנה הנשימה(T). ב, צינור אינטובציה (זה) חייב להיות קשור באופן הדוק לצינור y של החיה הנשמה. ג, ההנשמה מורכבת בין חוטי שני תפר (חץ שחור). ד, צינור האוורור מוכנס ו שני נושאים שתפרם התהדקו. קצות החוטים הם הידקו שוב באופנה חצתה (מסומן על ידי ראשי חץ לבנים ושחורים). דואר, קצות תפר כבולות. F, קצות התפר הם גזומים ואינטובציה הושלמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig4highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. הסרת קנה הנשימה ומה שהופך את פתיחת הגולגולת., ההכנה הוא התייצב עם insi אלסטומר (האזור<html> ירוק דה קווים מקווקווים). ב, קנה הנשימה מזוהה ולאחר מכן קיצוצים נעשים ראשון להפריד את קנה הנשימה מצינור אינטובציה, ולאחר מכן לחתוך את שרירי לסת התחתונים (קווים מקווקווים). ג, נקה את פני השטח של הגולגולת באמצעות בוטה טכניקה להסרת שריר ולהשתמש בנייר סופג כדי להסיר. ד שומן ודם, דוגמא לאזור נקי מציגה את החוליות שעברה (v) ועצם בשיא-עורפי (בו). יש פער טבעי בין שתי העצמות (חיצים שחורים). דואר, באמצעות microdrill או ניקוי קולי דקה הגולגולת בצורה הפוכה D (חיצים שחורים). בעדינות לשבור את הגולגולת דליל ולהסיר את פיסת העצם. כלי דם לנדמרק צריך להיות גלויה. f, נוף הגדלה גבוהה מציוני הדרך של כלי דם על פני השטח גזע המוח החשופים. &quot;ס = עורק basilar; עורק המוח הקטן נחות aica = קדמי. סרגל קנה מידה במ&quot;מ b = 1, חל על הספירה.highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6. Electroporation של קליעים נותבים עצביים., אלקטרודת זכוכית המכילה מיקרו האודם נותב העצבי הוצבה ליד קו האמצע (העיגול אדום). נותב היה electroporated באמצעות 7 פולסים ארוך -5 μA שני נמסרו כל 14 שניות ל15 דקות. אחרי השעה 1 של זמן החלמה האזור התאגרף היה צילם עם מיקרוסקופ שני פוטונים. עכברוש P1 גור. ב, תמונת Z-מחסנית דוגמה מובהקת של תיוג האקסון מביא בMNTB. חיצים מצביעים על סניפים בטחונות אישיים. ג, אלקטרודת זכוכית מלאה במייקרו אודם הוצב על גבי MNTB (העיגול האדום). נותב היה electroporated עם אותן ההגדרות שתוארו ב. אחרי השעה 1 של זמן החלמה האזור בארגזים היהצילם עם מיקרוסקופ שני פוטונים. גור עכברוש P5. ד, תמונת Z-מחסנית דוגמה מובהקת של תאים שכותרתו ואקסונים בMNTB. חצים מצביעים על תאי MNTB אחת. תוויות בB ו-C מצביעות ההגדלה אובייקטיבית וצמצם מספרי, בהתאמה. סרגל קנה מידה ובc = 300 מיקרומטר; סרגל קנה מידה בb = 45 מיקרומטר; סרגל קנה מידה בד = 90 מיקרומטר. aica = קדמי עורק המוח הקטן נחות; bas = עורק basilar; r = מקורי; l = רוחב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig6highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7. ממוקד הקלטת polytrode., Polytrode כולל 4 אנקס עם 4 אלקטרודות לשוק (עיגולים שחורים). מרחקי התוך ובין שוק ​​בין האלקטרודות מצוינים. ב, </strong&gt; תמונת דוגמה מובהקת של ניסוי אלקטרופיזיולוגיה. אלקטרודה השוואתית מוכנסת בחלל bucal וploytrode מחוברת לheadstage. גור החולדה P6. ג, נוף לגדלה גבוהה של ציוני דרך בכלי דם המשמשים לpolytrode מיקוד. Polytrode ממוקם באמצעות קואורדינטות מקורי, לרוחב למקד את הגרעין המדיאלי של הגוף בצורת הטרפז (תיבה אדומה). ד, ניתוח היסטולוגית Posthoc מדגים מיקוד נכון של polytrode מצופה DiI (מסלול polytrode מוצג באדום). דואר, רב דוגמה מובהקת יחידת הקלטה. כדי מעקב הוא זהה כדי האלקטרודה בפנל. בתוך הקלטות שוק יש את אותו צבע. סרגל קנה מידה בe = 5 שניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig7highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig8highres.jpg"width = &quot;600&quot; /&gt; איור 8. בשני פוטונים ההדמיה vivo של microvessels המוח. , תמונת 2-D (Z-ערימה התמוטטה) של כלי דם במוח לאחר טפטוף של TRITC-dextran 155 KD לתוך העורק הראשי. האזור צילם דומה לזה שמוצג באיור 7 ג. 20x/0.5 מטרת טבילה במים. גור החולדה P10. ב, אזור של העניין (ROI) המשמש למדידת עוצמת הקרינה (אזור מוקף מסגרת אדומה). היה הדם הקטן בקוטר של ~ 14.2 מיקרומטר והיה ממוקם 182 מיקרומטר מתחת לפני השטח גזע המוח. ג, עקומה אופיינית של עוצמת הקרינה (ערך מנורמל) כפונקציה של זמן. אני 0 הוא עליית המדרגה בעוצמת הקרינה בהחזר על ההשקעה, כאשר פתרון fluoresence רק ממלא את חלל כלי הדם. (Di / dt) 0 0 ואני משמשים כדי לקבוע את חדירות microvessel למומס. החדירות לTRITC-dextran 155 KD הייתה מחושבת להיות 1.5 x 10 -7 סנטימטר / שנייה.סרגל קנה מידה בb = 100 מיקרומטר, חל על. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig8highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents at JoVE.com

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

שיטה כירורגית מתוארת לחשוף את גולגולת הגחון בחולדות ילוד. שימוש בגישה זו ניתן לפתוח craniotomy לבצע אלקטרופיזיולוגיה חריפה וניסויים במיקרוסקופ שני פוטונים בגזע המוח של גורים מורדמים.

שיטה להרוויח Craniotomy על גולגולת הגחון של מכרסמים ילוד

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

a-method-to-make-a-craniotomy-on-the-ventral-skull-of-neonate-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Views.  The City University of New York, City College.  שיטה כירורגית מתוארת לחשוף את גולגולת הגחון בחולדות ילוד. שימוש בגישה זו ניתן לפתוח craniotomy לבצע אלקטרופיזיולוגיה חריפה וניסויים במיקרוסקופ שני פוטונים בגזע המוח של גורים מורדמים. 

Video: A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

הר הכנה שלמים של המבוגר תסיסנית עצבי חוט הגחון עבור הזרקת סיבים ענק דיי

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be investigated in a single task sequence. The unique feature of this system is a custom-made, acoustically transparent chamber that eliminates many of the issues associated with auditory cue control in most commercially available chambers. The ease with which operant devices can be added or replaced makes this system quite versatile, allowing for the implementation of a variety of auditory, visual, and olfactory behavioral tasks. Automation of the system allows fine temporal (10 ms) control and precise time-stamping of each event in a predesigned behavioral sequence. When combined with a multi-channel electrophysiology recording system, multiple cognitive brain functions, such as motivation, attention, decision-making, patience, and rewards, can be examined sequentially or independently.

In this report, we present a fully automated and highly versatile system capable of simultaneously testing multi-cognitive behaviors and recording neuronal activities for rodents.

מערכת אוטומטי לחלוטין תכליתי מאוד עבור בדיקת ריבוי פונקציות קוגניטיביות ורישום פעילות עצבית במכרסמים

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

בביטוי אוב של microRNA בגחון צ&#39;יק מוח התיכון

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

הדמיה חיה של איתות הניקוטין מושרה סידן והשחרור הנוירוטרנסמיטר לאורך האקסונים בהיפוקמפוס הגחון

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.

הכוח של מרווח Interstimulus להערכה של זמני עיבוד בחולדות

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

ב Vivo הדמיה של התחבורה נוזל שדרתי דרך הגולגולת העכבר ללא שינוי באמצעות זריחה מאקרוסקופיה

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement learning. Understanding how the diverse neuronal inputs into the VTA control phasic DA release can provide a better picture of the circuitry that controls reward processing and reinforcement learning. Here, we describe a method that combines intra-VTA cannula infusions of pharmacological agonists and antagonists with stimulation-evoked phasic DA release (combined infusion and stimulation, or CIS) as measured by in vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV). Using CIS-FSCV in anesthetized rats, a phasic DA response can be evoked by electrically stimulating the VTA with a bipolar electrode fitted with a cannula while recording in the nucleus accumbens core. Pharmacological agonists or antagonists can be infused directly at the stimulation site to investigate specific VTA receptors&#39; roles in driving phasic DA release. A major benefit of CIS-FSCV is that VTA receptor function can be studied in vivo, building on in vitro studies.

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry CIS-FSCV to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

The goal of this protocol is to directly manipulate ventral tegmental area receptors to study their contribution to subsecond dopamine release.

עירוי וגירוי משולבים עם וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (CIS-FSCV) כדי להעריך ויסות קולטן אזור טגמנטלי גחוני של דופמין פאזי

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement ...