אני רוצה להודות ביאנקה Mothé, קרלה Oseroff, ומארי צרפת DelGuercio מציגה לי מבחני החיסוני וטיפול העכבר. העבודה במעבדה של ספליטר GA ממומנת על ידי מענק 1-NIH RO1-AI-073558, GLRCE מענק 1-U54-AI-057153, ובארד ארה&quot;ב 3829-06.

1. לעורר יעד ספציפיות ההרג מפעיל על ידי חיסון (יום 0) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים, להחליט על מבצע ספציפי: מערכת היעד. בדוגמה זו של קלאסית assay CTL vivo, נשתמש חיסון פפטיד מטוהרים לעורר ספציפי CD8 + T לתאים. הפפטיד זהה ישמש הדופק התאים היעד syngeneic, יצירת מפעיל מסוים: מערכת היעד. לחלופין, אתה יכול לבחור להשתמש הפתוגן חלבון שלם או להשיג effectors הספציפי שלך ויעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את פני השטח של העבודה בתוך ברדס biosafety כדי להבטיח סטריליות של זריקות. הכן את חיסון הפפטיד הראשון על ידי הצבת 50 מיקרוגרם של הפפטיד מטוהרים לתוך DMSO 100 10% μL ב PBS / עכבר הכלול צינור 2 מ&quot;ל. לאחר מכן, להוסיף כמות זהה של adjuvant קר מאוד Incomplete של פרוינד ועד לציון 0.2 מ&quot;ל עם חרוזים 1 מ&quot;מ עבור ערבוב. מנקודה זו, לשמור immunogen על הקרח עד ההזרקה. מכסה מאובטח עם Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מקצף חרוז מוגדר RPMs המרבי לערבב את תחליב במשך 3 דקות, מיד הצבת אמולסיה חזרה על הקרח לאחר ערבוב. אמולסיה וכתוצאה מכך צריכה להיות דומה עקביות מיונז. אפשר לשבת ליד אמולסיה 4 ° C במשך הלילה אם היתרי זמן (עד שבוע), ערבוב נוסף, אם בכלל הפרדה הוא ציין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מזרק 1 מ&quot;ל ו - 20 או 20.5 מחט מד להרים את תחליב נזהר שלא להרים את כל חרוזים (חרוזים צריך להיות גדול יותר מאשר מד של מחט, אבל עדיין להיות מודעים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר Secure להזרקה תת עורית בבסיס הזנב. אנו משתמשים שונה צינור פלסטיק 50 מ&quot;ל חרוטי בבטחה ובעדינות לשתק את העכבר להזרקה. הזרק את העכבר עם 0.2 מ&quot;ל של תחליב. </li></ol> 2. יעד תאים קציר (יום 8) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יהיה עליך עכברים syngeneic נאיבי עבור תאים היעד שלך. להרדים עכברים נאיבי על פי סטנדרטים AAALAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את העכבר על ידי ריסוס אתנול 70% כדי לצמצם את הסיכוי לזיהום מהשיער העכבר או מזהמים חיצוניים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים לנתיחה לעשות חיתוך קטן דרך העור בצד שמאל של העכבר. משוך דש העור מעל לחשוף שק הצפק ואת האיברים הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Snip דרך הצפק, נזהרים שלא כל פשרה של אברי הבסיס. הטחול הוא קרוב לפני השטח, והוא דומה בצבע אל הכבד (אדום כהה) אך קטן יותר שעועית כליות במצב. עכברים נגועים בדרך כלל להראות spleens בעיקר גדולים יותר שולטת נגוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוציא את הטחול, מקפיד להיות עדין כדי לא לשבור את הטחול לחתיכות רבות על מנת לשחזר את המספרים תא מקסימלית. מיד למקום הטחול לתוך 15 מ&quot;ל חרוטי המכיל 10 MLS התקשורת מוכן על הקרח. המשך עם עכברים הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים תוכן של צינור חרוטי 15 מ&quot;ל (מדיה והטחול) לתוך מטחנת רקמת זכוכית. טוחנים את הטחול באמצעות שפע של כוח הזרוע. כאשר רקמה כל איבד את צבעו ניתן להניח כי יש לך התאושש כל התאים מתוך רקמת החיבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים תוכן של מטחנת דרך מסנן 70 מיקרומטר התא לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. יש לשטוף את מטחנת עם התקשורת טריים ושופכים דרך מסננת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 4 ° C, 1300 סל&quot;ד במשך 7 דקות. יוצקים את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 10 MLS של מגיב lysing דגירה מוכן ב ° 37 במשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף עד 50 MLS עם התקשורת טריים צנטריפוגות, כנ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 50 מדיה MLS טריים צנטריפוגות, כנ&quot;ל (שלב לשטוף). * הערה: בשלב זה ניתן לבצע הפרדה תא מגנטי עבור סוג תאים מסוים (מקרופאגים למשל), אם אוכלוסיה טהור תא היעד הרצוי להעברת לעכברים הנמען. כמו כן, בזמן הזה אתה יכול להציג טיפול ניסיוני לתוך התרבות על מנת לחקור את ההשפעות של טיפול מסוים על הרג התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים ו צלחת 1 x 10 7 לכל היטב 100μL בצלחת 96 עגול גם רקמת תרבות תחתית טיפול. * זהו ריכוז גבוה של תאים / טוב, אלא בגלל assay הוא אחד מהיר, ראינו לא אובדן יכולת הקיום של תאים בריכוז הזה. </li></ol> 3. טיפול תיוג של תאים היעד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים דופק המתאים משכפל עם פפטיד ספציפי פתוגן או שליטה פפטיד רלוונטי: הוסף 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פפטיד. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 1.5 שעות. העבר 37 ° C החממה במשך 30 דקות האחרונות. במהלך תקופה זו להכין ריאגנט CFSE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן CFSE על פי מפרט היצרן לדלל את ריכוז העבודה בין 0.5 לבין 25 מיקרומטר. הפוך את הריכוז &quot;נמוך&quot; 10x CFSE נמוך יותר &quot;גבוה&quot; ריכוז. לדוגמה, [נמוך] להוסיף 0.5 CFSE μL עד 10 MLS PBS עבור [גבוהים], מוסיפים 5 CFSE μL עד 10 MLS PBS. CFSE מוכן חם 37 ° C לפני תיוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת של תאים מן החממה pellet בצנטריפוגה במהירות גבוהה בטמפרטורת החדר, 1300 סל&quot;ד במשך 7 דקות. פליק להסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend באחת [נמוך] או CFSE [גבוה] על ידי הוספת 200 μL של מגיב המתאים בארות המתאים דגירה במשך 15 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת של תאים מן החממה ושוב גלולה בטמפרטורת החדר, 1300 סל&quot;ד במשך 7 דקות. פליק להסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 200 μL / גם של התקשורת טרי התחמם דגירה במשך 30 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת של תאים מן החממה גלולה בטמפרטורת החדר, 1300 סל&quot;ד במשך 7 דקות. פליק להסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 100 μL / גם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור העברת המאמצת, להוסיף גם [נמוך] תאים שכותרתו לטיפוס אחד מוכר היטב [גבוה] שכותרתו תאים לכל עכבר. כתוצאה הזרקה יש מטרות ספציפיות 50% תאים לא רלוונטי 50% 0.2-MLS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תשכח להפריש כמה תאים שכותרתו לשמש שולטת שאינם מועברים במהלך ניתוח נתונים עבור פועל על cytometer את הזרימה (ראו איור 1). </li></ol> 4. המאמצת העברת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי הפפטיד לעכברים שחוסנו בעבר (מתוך חלק # 1 של פרוטוקול זה) על פי סטנדרטים AAALAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 0.2 MLS של תאים היעד שכותרתו דרך המסלול רטרו מסלולית לעכברים הנמען. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 6 שעות או אחר זמן אופטימלי מראש לפני והרדמת חסד העכברים הנמען. </li></ol> 5. תאים תווית קציר * הערה: שלבים 5.1 עד 5.11 זהים צעדים 2.1 דרך 2.11 <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים ו צלחת החוצה 1 x 10 6 ל 100 μL היטב לתוך 96 תרבות עגול היטב לתחתית רקמות הצלחת הטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים התאושש ולא הועברו על ידי הוספת 100 paraformaldehyde 2% μL לריכוז סופי של paraformaldehyde 1% לכל הבארות. </li></ol> 6. תזרים cytometry וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל דגימות על cytometer זרימה ולנתח את הנתונים. </li></ol> 7. נציג תוצאות שיא epitope צמצום מסוים על ההיסטוגרמה וכתוצאה מכך הוא אינדיקטור של הרג ספציפי תא (איור 1). השתמש המשוואות הבאות (מיושם טבלה 1) כדי לקבוע את הערך האמיתי של תמוגה תא ספציפי: לא רלוונטי = יחס אחוז: אחוז מסוים epitope ([נמוך] שיא: [גבוה] שיא), אחוז תמוגה ספציפיים = [1 - (Non-הועבר יחס מלאה / יחס ניסויית)] 100 x <img src="/files/ftp_upload/2250/2250fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. פרופיל CFSE במדבר התאושש BALB / c splenocytes העכבר. מציינים את אחוז התאים של הפנוטיפ CFSE גבוה או נמוך. א) Non-העבירה את השליטה. כל [גבוה] CFSE פסגות מייצגים epitope תאים יעד ספציפי, בעוד [נמוך] פסגות CFSE לייצג מטרות פעמו עם פפטיד רלוונטי. ב) תאים CFSE שכותרתו התאושש עכבר הנמען PBS שחוסנו (Control). ג) תאים CFSE שכותרתו התאושש שני עכברים שונים פפטיד ספציפי הנמען, לציין את פסגות epitope פחתה ספציפיים. <img src="/files/ftp_upload/2250/2250fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ייצוג גרפי של הנתונים נותחו. שלוש נקודות הנתונים המוצגים עבור כל קבוצה של עכברים, PBS, פפטיד A, ו B. פפטיד <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מדגם </td><td> Epitope HIGH CFSE% פעמו </td><td> CFSE% LOW לא רלוונטי </td><td> יחס נמוך: גבוה </td><td> Epitope אחוז ספציפיות הריגת </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 42.8 </td><td> 57.2 </td><td> 1.34 </td><td> 16.97 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 43.1 </td><td> 56.9 </td><td> 1.32 </td><td> 15.94 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 44.3 </td><td> 55.7 </td><td> 1.26 </td><td> 11.74 </td></tr><tr><td> פפטיד </td><td> 39.7 </td><td> 60.3 </td><td> 1.52 </td><td> 32.56 </td></tr><tr><td> פפטיד </td><td> 38.6 </td><td> 61.4 </td><td> 1.59 </td><td> 35.61 </td></tr><tr><td> פפטיד </td><td> 40.6 </td><td> 59.4 </td><td> 1.46 </td><td> 29.99 </td></tr><tr><td> פפטיד B </td><td> 38.7 </td><td> 61.3 </td><td> 1.58 </td><td> 24.68 </td></tr><tr><td> פפטיד B </td><td> 38.5 </td><td> 61.5 </td><td> 1.60 </td><td> 25.32 </td></tr><tr><td> פפטיד B </td><td> 39.3 </td><td> 60.7 </td><td> 1.54 </td><td> 22.76 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS NT בקרה </td><td> 47.4 </td><td> 52.6 </td&gt; <td> 1.11 </td><td></td></tr><tr><td> פפ בקרה NT </td><td> 49.4 </td><td> 50.6 </td><td> 1.02 </td><td></td></tr><tr><td> פפ B NT בקרה </td><td> 45.6 </td><td> 54.4 </td><td> 1.19 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1. ניתוח הנתונים נציג &quot;. NT&quot; הוא לא הועבר.

<ol>
	<li>Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+epitope+escape+on+PD-1+expression+and+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+infection.">Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection.</a> J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).</li><li>Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+strength+of+T+cell+receptor+signal+controls+the+polarization+of+cytotoxic+machinery+to+the+immunological+synapse.">The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse.</a> Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).</li><li>Ingulli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+tolerance+and+immunity+in+vivo+by+CFSE-labeling+of+administered+cells.">Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells.</a> Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).</li><li>Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discordant+Brucella+melitensis+antigens+yield+cognate+CD8++T+cells+in+vivo.">Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo.</a> Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).</li><li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry.">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li><li>Weston, S. A., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+studies.+Analysis+by+flow+cytometry+and+fluorescence+microscopy.">New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy.</a> J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).</li><li>Akondy, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yellow+fever+virus+vaccine+induces+a+broad+and+polyfunctional+human+memory+CD8++T+cell+response.">The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response.</a> J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).</li><li>Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+antigen-driven+responses+by+flow+cytometry:+monitoring+proliferation+by+dye+dilution.">Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution.</a> Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).</li><li>Labadi, A., Balogh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+preferences+in+serosal+homing+and+distribution+of+peritoneal+B-cell+subsets+revealed+by+in+situ+CFSE+labeling.">Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling.</a> Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).</li><li>Suffner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+support+homeostatic+expansion+of+Foxp3++regulatory+T+cells+in+Foxp3.LuciDTR+mice.">Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice.</a> J Immunol. 184 (4), 1810-1820 .</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) מאוניברסיטת ויסקונסין במדיסון.

Assay זה יכול להיות שונה כדי לחקור את יכולת שגשוג של תאים, כולל הרחבת המשובטים, כי CFSE מתחלק יחסית שווה בשווה בין הצאצאים 10,11. אפשר גם להשתמש תיוג CFSE לחקור נדידת תאים 6,12, אם כי ישנם תאים אחרים התחקות השיטות עשוי להיות מתאים יותר בהתאם להשערה שלך, tetramers דוגמה פליט...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1 mm glass beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biospec Products</td>
<td>11079110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>70 &mu;m cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-well plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Costar</td>
<td>3799</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adjulite Incomplete Freund's Adjuvant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pacific Immunology</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-5879</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>16000-077</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FC 500 Flow Cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kontes glass tissue grinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>885300-0015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Beadbeater</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biospec Products</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>B-D</td>
<td>305175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm "M"</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
<td>PM992</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>157-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>10010-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PharmLyse lysing reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>555899</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>11875-093</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>B-D</td>
<td>309602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vybrant CFSE Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
<td>V12883</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

antigen specific in vivo killing assay using cfse labeled target cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFSE) יכול לשמש בקלות ובמהירות תווית האוכלוסייה תא עניין של בחקירה vivo. תיוג זה קלאסי שימשו במחקר התפשטות והגירה. בשיטה המוצגת כאן, יש לנו לקצר את ציר הזמן לאחר העברת המאמצת להסתכל הישרדות הרג epitope ספציפי שכותרתו CFSE תאים היעד 4-6. רמת הרג ספציפי של שיבוט CD8 + T תא יכולה להעיד על איכות התגובה, כמו הכמות שלהם עלולה להטעות. ספציפיות CD8 + T תאים יכול להיות מותש מבחינה תפקודית לאורך זמן עם ירידה ייצור ציטוקינים והרג 7,8. כמו כן, בטוח CD8 + T שיבוטים תא לא יכול להרוג, כמו גם עם אחרים שונים ספציפיות TCR 9. לקבלת חסינות מתווכת יעיל תא (CMI), אנטיגנים חייב להיות מזוהה המייצרים לא רק מספרים נאותה להגיב בתאי T, אלא גם חזקים מבחינה פונקציונלית ותאי T להגיב. כאן אנו בוחנים את התא אחוז הרג ספציפי של שני פפטיד ספציפי שיבוטים תא T ב BALB / c עכברים.

Watch this Scientific Journal Video about Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells at JoVE.com

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

זיהומים רבים לתגובה CTL חזק, אבל מדי פעם, כמות התאים להגיב אינו תואם לשליטה של ​​הפתוגן<sup&gt; 1</sup&gt;. אחד המדדים לבחינת איכות CTL הוא היכולת שלהם להרוג במיוחד<sup&gt; 2</sup&gt;. תיוג CFSE של תאים היעד יכול לשמש כדי לחקור את איכות התגובה CTL<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 3,4</sup&gt;.

אנטיגן ספציפי In vivo להרוג Assay באמצעות תווית CFSE תאים היעד

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

antigen-specific-in-vivo-killing-assay-using-cfse-labeled-target-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

19.5K Views.  University of Wisconsin-Madison. זיהומים רבים לתגובה CTL חזק, אבל מדי פעם, כמות התאים להגיב אינו תואם לשליטה של ​​הפתוגן 1. אחד המדדים לבחינת איכות CTL הוא היכולת שלהם להרוג במיוחד 2. תיוג CFSE של תאים היעד יכול לשמש כדי לחקור את איכות התגובה CTL In vivo

Video: Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

Assay רגישות יתר מושהה סוג חוצה vivo להסדרת אנטיגן ספציפי

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל<em&gt; במבחנה</em&gt; דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

שיטת Microarray לקביעת סרולוגית לזיהום Clostridium difficile נוגדן התגובות הבאות אנטיגן ספציפי

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

קוונפיקציה של מתרבים אנטיגן אנושי-ספציפי CD4+ T תאים באמצעות Carboxyפלואורומיתאת הדיקן אסתר

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...