Video: Chromium Release Assay for Testing Cytotoxicity

ת לבדיקת מוות בתא: כרום שחרר את ההסתה של היכולת הציטוטוקסית

Overview

מקור: פרנסס נגד סג'אאסטד^1,2,ויטני סוונסון^2,3ותומאס ס. גריפית'^1,2,3,4
¹ מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, ותוכנית לתואר שני בביולוגיה של הסרטן, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
² המרכז לאימונולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
³ המחלקה לאורולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
⁴ מרכז הסרטן הבונים החופשיים, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455

אחת הפונקציות העיקריות של תאי מערכת החיסון היא להסיר תאי יעד שנדבקו בווירוסים או עברו טרנספורמציה לתא גידול. מביכה לבדיקות למדידת היכולת הציטוטוקסית של תאי מערכת החיסון היו מרכיב עיקרי במעבדות במשך שנים רבות. בדיקות אלה שימשו כדי לקבוע את היכולת של תאי T, תאי NK, או כל תא חיסוני אחר להרוג תאי מטרה באופן אנטיגן ספציפי או לא ספציפי. ליגנדים של מוות (למשל, ליגנד פאס או TRAIL), ציטוקינים (למשל, IFNg או TNF), או גרגירים ציטוטוקסיים (כלומר, perforin/granzyme B) המובעים על ידי תאים משפיעים הן כמה דרכים שבהן מוות תאי היעד יכול להיגרם. עם הפיצוץ במחקר אימונותרפי הגידול בשנים האחרונות, יש עניין גובר במציאת סוכנים כדי להגביר את הפעילות הציטוטוקסית של תאי החיסון כדי לשפר את תוצאות המטופל. לעומת זאת, מחלות מסוימות מסומנות על ידי פעילות מוגזמת של פעילות ציטוטוקסית של תאי מערכת החיסון, וכתוצאה מכך מאמצים לזהות סוכנים למתן תגובות אלה. לכן, לאחר מבחן שבו המשתמש יכול בקלות לשלב כל מספר של תאים משפיעים שונים, תאי יעד, ו / או מכפילי תגובה לתוך העיצוב הניסיוני יכול לשמש כאמצעי יקר ערך להערכה מהירה של היכולת הציטוטוקסית של תאים אפקטים ו / או התגובה של תא היעד.

בדיקות במבחנה אלה כרוכות בערבוב של אוכלוסיות תאים שונות, כמו גם באמצעות מספר נמוך יחסית של תאים משפיעים ויעד. לכן, אחד הצורך של ה- assay הוא לתייג את תאי היעד באופן שניתן לזהות בקלות כמות, ומאפשר למשתמש אז לקבוע את "אחוז תמוגה ספציפית" בתיווך התאים המשפיעים. רדיואקטיביות - במיוחד, כרום 51 (⁵¹Cr) בצורה של Na₂⁵¹CrO₄- היא דרך זולה לתייג במהירות ולא מדעית חלבונים תאיים בתוך תאי היעד (1). התיוג הקצר ואת זמני ההסתה הכוללת מקטין את הפוטנציאל לשינויים משמעותיים במספר ו /או פנוטיפ של תאי היעד, אשר יכול להשפיע על התוצאה של ההסתה. עם אובדן שלמות הממברנה של תאי היעד כתוצאה מהפעילות הציטוטוקסית של התאים האפקטורקטיביים, ⁵¹החלבונים התאיים המסומנים על-ידי Cr בתוך תאי היעד משתחררים לתוך ה- supernatant התרבותי, הופכים לזמינים לכמות. כמו בכל בדיקה הבוחנת את תפקוד תאי החיסון במבחנה, ישנם מספר שיקולים חשובים לשקול שיפור ביצועי הניסוי. אחת התכונות הקריטיות ביותר היא להשתמש במשפיע בריא (לפעילות ציטוטוקסית מקסימלית) ולמקד (להיענות מקסימלית ומוות ספונטני מינימלי/⁵¹Cr שחרור) תאים. נדרש מגע עם אפקט ותא יעד (מה שמוביל לשימוש נפוץ בלוחות עגולים בני 96 בארות כדי לעודד מגע בין תאים) (2). לבסוף, ניתוח הנתונים תלוי בהכללה של אוכלוסיות תאי יעד שליטה חיובית ושלילית.

הפרוטוקול הבא יתווה את השלבים לביצוע בדיקת שחרור ^{סטנדרטית של 51}Cr כדי למדוד את היכולת הציטוטוקסית של אוכלוסייה של תאים משפיעים, אם כי לאחרונה פותחה גרסה לא רדיואקטיבית באמצעות Europium. ⁵¹ Cr הוא פולט קרינת γ רב עוצמה. כתוצאה מכך, השימוש בבדיקה זו דורש אימון בטיחות קרינה נאות, שטח מעבדה ייעודי, מונה גמא וסילוק דגימות רדיואקטיביות.

רצף האירועים הכללי בבחינה זו הם: 1) להכין ⁵¹מטרות מתויגות Cr; 2) להכין תאים אפקט ולהוסיף צלחת בזמן תאי היעד הם תיוג; 3) להוסיף יעדים מסומנים לצלחת; 4) צלחת דגירה; 5) קציר סופר-טבעי; ו-6) לנתח נתונים לאחר הפעלת דגימות על מונה. דגימות מוכנות בדרך כלל במשולש, ולאחר מכן ממוצע להסביר את כל הבדלי pipetting עדין.

PPE נכון חשוב לבדיקה זו. באופן ספציפי, המשתמש צריך ללבוש חלוק מעבדה וכפפות. משקפי בטיחות עשויים להידרש על בסיס המעבדה או המוסד. צריך להיות מיגון עופרת בשפע לאחסון בטוח ושימוש ^{ב- 51}Cr במהלך כל השלבים. לבסוף, צריך להיות שטח מעבדה ייעודי וציוד להפריש לשימוש ⁵¹Cr, כולל כל השילוט הנכון כדי לציין היכן ^{נשמרות דגימות עם 51}Cr ודלפק גייגר מצויד בגשושית גמא כדי לסקור את החלל לזיהום אפשרי.

בתרגיל מעבדה זה, אנו נקבע את היכולת של תאים מונוניקלאריים אנושיים לדם היקפי (PBMCs), (CpG מגורה לעומת unstimulated) להרוג תאי מלנומה, באמצעות קו תא מלנומה אנושי WM793 כמודל ואת בדיקת שחרור כרום.

Procedure

מבט כולל על שגרה

ההסתה האופיינית של ⁵¹Cr-release למדידת מוות תאי כוללת את השלבים הבאים:

ראשית, תאי היעד מסומנים עם Na₂[⁵¹Cr]O₄. זה מבדיל אותם מתאי האפקטים שבבחינה.
בעוד שתאי היעד מתייגים, התאים האפקטור נאספות, ובאמצעות טכניקת הדילול הסדרתי, ירידה בטיטורציה של תאי האפקטור נוצרת בלוח בדיקת תחתון עגול של 96 באר.
בסוף תיוג תא היעד, התאים נשטפים תחילה ולאחר מכן מספר קבוע של תאים מתווספים ללוח בדיקת ה- assay ש

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Results

בדוגמה זו, תאים משפיעים מגורה עם CpG (איור 1, עיגולים שחורים) הרגו את תאי היעד בצורה יעילה יותר, ככל שהיחס בין התאים האפקטיביים לתאי היעד גדל. עלייה זו לא נצפתה PBMCs unstimulated (עיגולים לבנים),המציין כי גירוי CpG נחוץ עבור הגידול שנצפה תמוגה תא היעד.

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Application and Summary

ההבחנה המתוארת כאן יש גמישות רבה, כמו מגוון של אפקט ותאי יעד ניתן להשתמש בהתאם לשאלה הנשאלת. לדוגמה, הספציפיות לתאי האפקטים יכולה להיקבע על ידי שימוש בתאי מטרה שונים או מנגנון של הרג תאים משפיע יכול להיקבע על ידי שימוש בתאים לקויים בחלבונים ספציפיים או באמצעות מעכבים ספציפיים לחלבון. בעיה ...

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

References

Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C. and Chapuis. B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on ⁵¹Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology, 14 (2):181-196, (1968).
Kemp, T. J., B. D. Elzey, and T. S. Griffith. Plasmacytoid dendritic cell-derived IFN-alpha induces TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2L-mediated antitumor activity by human monocytes following CpG oligodeoxynucleotide stimulation. The Journal of Immunology, 171 (1): 212-218, (2003).

Tags

מבט כולל על שגרה

ההסתה האופיינית של ⁵¹Cr-release למדידת מוות תאי כוללת את השלבים הבאים:

ראשית, תאי היעד מסומנים עם Na₂[⁵¹Cr]O₄. זה מבדיל אותם מתאי האפקטים שבבחינה.
בעוד שתאי היעד מתייגים, התאים האפקטור נאספות, ובאמצעות טכניקת הדילול הסדרתי, ירידה בטיטורציה של תאי האפקטור נוצרת בלוח בדיקת תחתון עגול של 96 באר.
בסוף תיוג תא היעד, התאים נשטפים תחילה ולאחר מכן מספר קבוע של תאים מתווספים ללוח בדיקת ה- assay שכבר מכיל סדרה של דילול תאים משפיעים.
לאחר מכן, תערובת התאים של אפקט היעד מודגרת לפרק זמן מוגדר כדי לאפשר אינטראקציה מספקת בתאים עם תאי היעד, כדי לתווך תמה של תאים.
לבסוף, תרבות-העל נקצרים ונאספים לצינורות. כמות ⁵¹Cr היא כמות באמצעות מונה גמא.
בסוף, הנתונים נאספים ומשמשים לחישוב "תמוגת התא הספציפית באחוזים" של תאי היעד.

1. תיוג תאי יעד עם ⁵¹Cr

כדי להתחיל, להכין את תאי היעד, (כאן - קו תא מלנומה אנושי WM793), לתוך השעיית תא יחיד.
כדי לעשות זאת, ראשית להסיר את המדיה מן בקבוקון תרבית הרקמות.
לאחר מכן, לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של 1X PBS.
Trypsinize התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של טריפסין לצלחת במשך ~ 2 דקות.
הקש בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים מפני השטח הבקבוקון.
הוסף 5 מ"ל של מדיית RPMI לבקבוקון והעבר את המדיה למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים.
לאסוף את השעיית התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל וצנטריפוגה השעיית התא במשך 5 דקות ב 1200 סל"ד. דקאנט סופר-טבעי.
הוסף 10 מ"ל של מדיה לכדור וצינור בעדינות את המדיה למעלה ולמטה כדי להביא את התאים להשעיה.
לקבוע את ריכוז התא באמצעות hemocytometer.
העבר 1x10⁶ תאים לתוך צינור חרוט חדש 15 מ"ל.
צנטריפוגות מתלה התא במשך 5 דקות ב 1200 סל"ד decant supernatant.
מערבולת בקצרה את הצינור כדי resuspend גלולה התא בנפח הקטן של בינוני נשאר מאחור.
הוסף 100 μCi של ⁵¹Cr ישירות להשעיית תא היעד WM793.
הערה: צריך להיות שטח מעבדה ייעודי שהוקם לרדיואקטיביות המסוימת. בנוסף, צריך להיות מיגון עופרת בשפע לאחסון בטוח ושימוש ^{ב- 51}Cr במהלך כל השלבים, כמו גם שילוט מתאים כדי לציין היכן נשמרות דגימות עם ⁵¹Cr. מונה גייגר המצויד בגשושית פנקייק הוא גם הכרחי, לסקר את המרחב לזיהום אפשרי.
הוסף חתיכה קטנה של סרט רדיואקטיבי לצינור כדי לציין כי הצינור הוא עכשיו רדיואקטיבי.
מניחים את הצינור באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם מגן עופרת ודגרה למשך שעה אחת. תעיף את הצינור כל 15-20 דקות כדי להגדיל את ספיגת תאי המטרה של הכרום.
לאחר תקופת הדגירה, לשטוף את תאי היעד עם 5 מ"ל של FBS כדי להסיר כל עודף ⁵¹Cr.
צנטריפוגות התאים ב 1200 סל"ד במשך 5 דקות. דקאנט רדיואקטיבי FBS לשטוף לתוך מיכל פסולת מתאים.
respend הכדור ולשטוף בפעם השנייה עם FBS. בדוק את הכדור עבור רדיואקטיביות משולבת באמצעות מונה גייגר.
Resuspend הכדור במדיום מלא 10 מ"ל, השגת ריכוז תא של 10⁵ תאים / מ"ל.
הערה: שלב ספירת התאים לאחר ^{תיוג 51}Cr מושמט כאן בעיקר מטעמי בטיחות. ניתן להניח כי ריכוז התא WM793 זהה כפי שהיה לפני ^{תיוג 51}Cr.

2. הכנת תאים משפיעים

ניתן להשתמש במגוון תאים משפיעים, כגון תאי T אנושיים או עכבר ותאי NK. בדוגמה זו, PBMCs, מבודדים מדם שלם על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות סטנדרטית (לריכוז של 5x10⁶), שימשו.
כדי להתחיל, להוסיף 100 μL של תרבית רקמות בינוני לכל באר של אחת השורות (כאן שורה A, ראה טבלה 1) של צלחת עגולה 96-היטב. כאן, לא מתווספים תאים משפיעים, והם ישמשו "ריק" לקביעת "שחרור מינימום / ספונטני ⁵¹Cr" מתאי היעד.

טבלה 1: ⁵¹Cr לשחרר פריסת assay: שורה A- תאים היעד (10⁴ תאים / 100 μL) דגירה עם מדיה בלבד (יוצר 'ריק' לקביעת "שחרור מינימום / ספונטני ⁵¹Cr"). שורות B עד C - בארות המכילות אפקט שונה: יחסי תא יעד (E:T), הנעים בין 50:1 ל- 1.5:1. שורה H - תאי יעד (10⁴ תאים /100 μL) דגירה עם 1% NP-40 (NP-40 lyses את תאי היעד, יצירת "מקסימום או סך של ⁵¹שחרור Cr"). כל יחס E:T נבדק משולש עבור כל מצב ניסיוני. מחשבי PBMCs ומחשבי PBM בעלי גירוי של עמודה 1-3 ומחשבי PBMC מגורה CPG.

לאחר מכן, ליצור דילול תאים סדרתיים פי 2 של מחשבי ה- PBMCs (במשולש עבור כל מצב ניסיוני), כדי להשיג ריכוז תא אפקט הנע בין 5x10⁵ ל 15,625 תאים / 100 μL של מדיה (כאן שורות B עד G).
הערה: בדוגמה זו, המחולל ההתחלתי: יחס תא היעד (E: T) הוא 50:1. עם זאת, ניתן להתאים יחס זה בהתאם לפרטים הניסיוניים.
השאר את השורה האחרונה ריקה (כאן שורה H) על-ידי אי הוספת תאים משפיעים לבארות אלה. (שורה זו תשמש ליצירת "ספירות כוללות/דקות, או (ג. p.m)" או "מהדורת ⁵¹Cr המרבית").
מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס עד שתאי היעד מוכנים להוספתם.

3. הוספת ⁵¹Cr שכותרתו WM793 תאי יעד לאסאי

לאחר תקופת הדגירה, להסיר את תאי היעד מן האינקובטור לשטוף עם 5 מ"ל של FBS כדי להסיר כל עודף ⁵¹Cr.
צנטריפוגה התאים ב 1200 סל"ד במשך 5 דקות, באמצעות צנטריפוגה ייעודית.
הסר את שטיפת FBS (supernatant רדיואקטיבי) לתוך מיכל פסולת מתאים.
חזור על שלב הכביסה על ידי שימוש חוזר את הכדור ב 5 מ"ל טרי של FBS.
צנטריפוגות התאים שוב ב 1200 סל"ד במשך 5 דקות.
לבסוף, respend הכדור ב 10 מ"ל של מדיום מלא.
יוצקים את ההשעיה של תא WM793 עם תווית ⁵¹Cr (10⁵ תאים/מ"ל) למאגר ריאגנט חד פעמי.
לאחר מכן, הוסף 100 μL של תאי יעד אלה שכותרתו, לכל באר של לוח התאים אפקט 96-well, באמצעות pipette רב ערוצי.
לאחר מכן, להוסיף 100 μL של 1% NP-40 (במים) לשורת הבארות כי הם נטולי כל תאים אפקט (כאן שורה H). 1% NP-40 יהיה ליזה את תאי היעד, ולכן בארות אלה ישמשו פקדים כדי לקבוע את "ספירה כוללת / דקה, או (c. p.m)" או את המהדורה המרבית ⁵¹Cr.
אבטחו את המכסה לצלחת על ידי הוספת פיסת סרט קטנה חדירת גז לכל צד של הצלחת ומניחים פיסת סרט רדיואקטיבי על המכסה כדי לציין שהיא מכילה ⁵¹Cr.
בקצרה, צנטריפוגה הצלחת ב 1200 סל"ד. אם נעשה שימוש בלוח ניסוי אחד בלבד, הוסיפו צלחת איזון לצנטריפוגה.
הערה: חשוב להשתמש בצנטריפוגה המסומנת לטיפול בדגימות רדיואקטיביות.
מוציאים את הצלחת מהצנטריפוגה.
מניחים את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם חתיכת עופרת קטנה שמגנה על הצלחת לבטיחות נוספת. דגירה במשך 16 שעות כדי לאפשר תמה של תאי היעד.
הערה: תקופת הדגירה יכולה להשתנות בין 4 ל 18 שעות בהתאם לתאי האפקטים המשמשים ומנגנון פוטנציאלי של הרג מועסק.

4. קצירת סופרנטנטים

בסוף תקופת הדגירה, להסיר בזהירות את הסרט סביב קצה הצלחת ולהסיר את המכסה.
לאחר מכן, מניחים את מסגרת הקציר על הצלחת, ומוודאים לאשר כי דיסקי המסנן הקטנים נמצאים במקום עבור כל אחד מצעי הכותנה. זה יבטיח את האוסף של סופרנט ללא תאים.
עכשיו, לאט ובעדינות לחץ על תקעי הכותנה לתוך בארות.
לאחר כ -10 שניות, לשחרר את הלחץ על תקעים כותנה ולאחר מכן להעביר את תקעים כותנה לרצועות צינור.
מניחים כל אחד מהצינורות האלה לתוך צינור FACS משני.
לבסוף, לטעון צינורות FACS על מונה גמא ולהפעיל את הדגימות כדי כמות של ⁵¹Cr שוחרר בכל תנאי. דגימות נמדדות בדרך כלל במשך דקה אחת, ומאפשרות קביעה קלה של "ספירות / דקה".
בזהירות, להקליט את הסדר שבו הצינורות היו טעונים לתוך הדלפק.

5. ניתוח נתונים

כאן, מחשבי PBMCs לא מנוסים נוספו לשלוש העמודות הראשונות, ומחשבי PBMCs מגורה CpG (CpG ODN, (1 מיקרוגרם/מ"ל) עבור 24 שעות) נוספו לעמודות 4-6. ראה טבלה 2.

	1	2	3	4	5	6	7	8
A	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
C	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
F	1579	1472	1483	2028	1779	1769
G	1326	1325	1184	1801	1654	1565
H	9220	9367	8067	8774	9647	8236
אני	ממוצע של A1,A2,A3 ->		1164.67	סי.פי ספונטני.m		1058.33
J	ממוצע של B1,B2,B3 ->		1929.67	9.91%		7907.33	87.50%	50:1
K	ממוצע של C1,C2,C3 ->		1614.67	5.83%		5259	53.67%	25:1
L	ממוצע של D1,D2,D3 ->		1641.33	6.17%		3869	35.91%	12.5:1
M	ממוצע של E1,E2,E3 ->		1525.67	4.68%		2730.33	21.36%	6.25:1
N	ממוצע של F1,F2,F3 ->		1511.33	4.49%		1858.67	10.22%	3.12:1
O	ממוצע של G1,G2,G3 ->		1278.33	1.47%		1673.33	7.86%	1.56:1
P	ממוצע H1,H2,H3 ->		8884.67	מקסימום C.p.m		8885.67
				Unstim PBMC			CpG-stim PBMC	יחס E:T

טבלה 2: ⁵¹Cr לשחרר נתוני צ'ק: ערכי נתונים 'ספירה לדקה' / 'c. p.m', ערכי c. p.m ממוצעים וערכי תמותה ספציפיים באחוזים מחושבים.

הנתונים שנאספו (ספירות לדקה, כלומר.c.p.m) הוזנו לתאי גיליון אלקטרוני באותו אופן שבו הדגימות הונחו בלוח המקורי.
ראשית, הממוצעים של הטריפליקאטים חושבו. טבלה 2 - תאים I3 עד P3, עבור מחשבי PBMCs ותאים לא מנוסים I6 עד P6, עבור מחשבי PBMC מגורה CpG.
לאחר קביעת הממוצעים, אחוז תמיסת הספציפית עבור כל תנאי חושב באמצעות הנוסחה הבאה-
אחוז תמוגה ספציפית חושב עבור כל תנאי (טבלה 2 - תאים J4 עד O4, עבור מחשבי PBMCs unstimulated ו- J7 ל- O7, עבור מחשבי PBMCs לא מנוסים).

Skip to...

0:01

Concepts

2:39

Performing the Experiment

9:44

Results

Videos from this collection:

article

Now Playing

ת לבדיקת מוות בתא: כרום שחרר את ההסתה של היכולת הציטוטוקסית

Immunology

151.3K Views

article

ציטומטריית זרימה ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות (FACS): בידוד של לימפוציטים מסוג Splenic B

Immunology

92.5K Views

article

מיון תאים המופעל מגנטי (MACS): בידוד של לימפוציטים T תימיים

Immunology

22.7K Views

article

אליסה אסייס: עקיפה, כריך ותחרותי

Immunology

236.7K Views

article

אליספוט אסאי: זיהוי של IFN-γ הפרשת טחול

Immunology

28.3K Views

article

אימונוהיסטוכימיה ואימונוציטוכימיה: הדמיית רקמות באמצעות מיקרוסקופיה קלה

Immunology

78.4K Views

article

יצירת נוגדנים: ייצור נוגדנים חד שבטיים באמצעות היברידיות

Immunology

43.3K Views

article

מיקרוסקופיה חיסונית: כתמי אימונופלואורסצנטיות של מקטעי רקמות משובצים בפרפין

Immunology

53.5K Views

article

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות קונפוקלית: טכניקה לקביעת לוקליזציה של חלבונים בפיברובלסטים של עכברים

Immunology

42.9K Views

article

טכניקות מבוססות אימונופרציפיטציה: טיהור חלבונים אנדוגניים באמצעות חרוזי אגרוז

Immunology

87.3K Views

article

ניתוח מחזור התא: הערכת התפשטות תאי CD4 ו- CD8 T לאחר גירוי באמצעות כתמי CFSE וציטומטריית זרימה

Immunology

24.1K Views

article

העברת תאים מאמצת: הצגת טחול עכבר תורם לעכבר מארח והערכה של הצלחה באמצעות FACS

Immunology

22.1K Views

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved