ניתן להשתמש בה כדי לכמת ציטוטוקסיות בתווית תאי T כנגד שתי אפיטופים פפטיד נפרדים של אנטיגנים סרטניים בו זמנית. הטבע in vivo של ההתמדה הזאת מאפשר פונקציה cytotoxic של תאי T להימדד בתוך הארכיטקטורה שלם של איבר לימפואיד משני. בנוסף, ההרג שנצפה הוא השתקפות מדויקת של המספר המוחלט של תאי T, ולא רק את התדרים שלהם, אשר יכול להיות מטעה.
בדיקה זו מאפשרת בדיקה של תגובות תאי T ציטוטוקסיים לאנטיגנים אימונודומיננטיים ותת דומיננטיים של גידולים. לכן הוא מספק מידע בעל ערך בעת תכנון חיסון, כמו גם פרוטוקולים אימונותרפיים לסרטן. הפרוטוקול שלנו הותאם לחקר תגובות לתאי CD8 T.
עם זאת, זה יכול להיות שונה כדי למדוד cytotoxicity עורר על ידי סוגים אחרים של תאים רוצח, כגון תאי NK ולימפוציטים T דמויי innate. מבחן זה דורש ניסיון בטכניקה אספטית, טיפול ברקמת עכבר, הכנת תאי יעד, כמו גם מומחיות בזריקות ורידים בזנב. אחד צריך לרכוש סט כישורים זה לפני שתנסה את ההריגה in vivo.
לאחר קו תא הגידול חסידי T-אנטיגן חיובי הפך קונפלנטי לחלוטין או מעט יותר מדי confluent, בעדינות לשטוף את monolayer עם סטרילי, PBS חם, ולנתק את התאים הגידול עם 0.25% טריפסין EDTA ב ארון biosafety. הקש על הצדדים של בקבוק התרבות מספר פעמים כדי לשחרר את התאים חסידים הנותרים, ולעצור את התגובה לאחר כחמש דקות עם תוספת של חמישה מיליליטר של מדיום DMEM. פיפטה פתרון התא כמה פעמים לפני סינון ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר נקבוביות לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר.
לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, ולתלות את גלולה ב 10 מיליליטר של סטרילי, PBS קר עבור הראשון של שלוש שטיפות באותם תנאים. לאחר הכביסה השלישית, להשתמש מחדש את התאים בארבע פעמים 10 לשבעה תאים למיליליטר של ריכוז PBS סטרילי, ולהזריק 500 microliters של T-אנטיגן חיובי תא הגידול השעיה תוך-פרטית לתוך כל שישה עד 12 שבועות בן C57 שחור 6 עכבר נמען. להכנת טחול היעד, מניחים את העכבר התורם המתת דם בתוואי נוטה, לרסס את החיה עם 70% אתנול.
באמצעות מדפים סטריליים ומספריים, להרים את העור ולעשות חתך גחוני קטן באמצע הקו. חותכים את העור בצורה צולבת כדי לחשוף את הצפי, ולהשתמש במקלות כדי למשוך את הצמיטונום בצורה דמוית אוהל, מבלי לתפוס את כל האיברים הפנימיים. חותכים לפתוח את צפי כדי לחשוף את חלל צפי, בעדינות להעביר את הטחול מטחנת רקמות Dounce 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של PBS סטרילי.
השתמש הבוכנה כדי להפעיל לחץ ידני עד הרקמה הטחול מתפוגג לתוך השעיית תא הומוגני אדום, ולהעביר את homogenate לתוך צינור 15 מיליליטר. לאסוף את ההשעיה על ידי צנטריפוגה, ולתלות את גלולה בארבעה מיליליטר של מאגר אשלגן אשלגן אמוניום כלורי כדי לחסל את אריתרוציטים. לאחר ארבע דקות, לעצור את התהליך עם שמונה מיליליטר של מדיום מלא, ולסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר נקבובית לתוך צינור חדש 50 מיליליטר.
להפריד את תאי הדם הלבנים מפסולת תאי הדם האדומים על ידי צנטריפוגה, ולתלות מחדש את גלולה ב 12 מיליליטר של מדיום שלם. ואז לפצל את ההשעיה הטחול לשלושה aliquots ארבעה מיליליטר שווה. עבור קידוד פפטיד של הטשטוש היעד, דופק אחד splenocyte aliquot עם micromolar אחד של פפטיד לא רלוונטי, aliquot אחד עם micromolar אחד של אתר אני פפטיד, ועליקוט אחד עם micromolar אחד של פפטיד אתר IV במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
בסוף הדגירה, להסיר את עודף פפטיד על ידי צנטריפוגה ולשטוף את טשטוש פפטיד פעימות פעמיים ב 12 מיליליטר של סטרילי, קר PBS לכל לשטוף לצינור. לאחר הכביסה השנייה, יש למצות את התאים בארבעה מיליליטר של PBS טרי וסטרילי לצינור. הוסף 025, 0.25, ו- CFSE שני מיקרומולרים לתוך לא רלוונטי, אתר I, ואתר IV פפטיד פעמו השעיות טחול בהתאמה.
מניחים את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות עם היפוך ידני פעם בחמש דקות. בסוף הדגירה, מוסיפים שלושה מיליליטר של סרום בקר עוברי ללא חום לכל צינור כדי לעצור את תגובת CFSE ולהביא את הנפח הסופי בכל צינור עד 15 מיליליטר עם PBS. לאחר מכן לאסוף את התאים המסומנים בצבע על ידי צנטריפוגה עבור שתי שטיפות ב 12 מיליליטר של PBS טרי, סטרילי לכל לשטוף.
כדי לאשר תיוג CFSE נאותה של הטשטוש היעד, להשתמש מחדש את גלולה בשלושה מיליליטר של PBS ומערבבים עם מערבולת עדינה. העבר 10 מיקרוליטרים מכל מתלי תאים המסומנים ב- CFSE לתוך מיון תאים בודדים של חמישה מיליליטר עגולים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, או צינור FACS, המכיל PBS, וטען את הצינור על ציטומטר זרימה המצויד בלייזר 488 ננומטר. בתוכנת ציטומטר זרימה, ליצור שער לימפוציטים המבוסס על פיזור קדימה תכונות פיזור בצד של התאים לפני רכישת 5, 000 אירועים נופלים בתוך שער לימפוציטים בערוץ Fluorescence 1.
בתוך האוכלוסיה האב CFSE חיובי, לצייר שערי היסטוגרמה נוספים כדי לזהות את CFSE נמוך, CFSE-ביניים, ו CFSE גבוה subpopulations. לאחר מכן אשר מספר אירוע שווה או כמעט שווה בתוך שלושת השערים עבור שני הצינורות האחרים של תאים מסומנים. להזרקה של תאי היעד, תחילה בעדינות מערבולת צינורות המקור בריכה שלושת מתלי התא המסומן CFSE לתוך צינור חדש ביחסים שווים.
למעלה את תכולת הצינור עם PBS סטרילי, ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה לספירה. לאחר מכן כוונן את עוצמת הקול ל- 10 פעמים לשבעת תאי היעד המעורבים לכל 200 מיקרוליטרים של PBS לכל ריכוז נמען, והזריק 200 כרכים מיקרוליטריים של מתלי התא לווריד הזנב של כל עכבר C57 Black 6 נמען. שעתיים או ארבע לאחר ההזרקה, להסיר ולעבד את הטחול של כל חיה הנמען כפי שהוכח, ו resuspend תאי הדם הלבנים מבודדים בשלושה מיליליטר של PBS לכל טחול.
העבר בערך פעם אחת 10 לשבעת התאים מכל טחול מעובד לתוך צינור FACS נקי, ומיד להפעיל את התאים על ציטומטר הזרימה כפי שהוכח לשער CFSE נמוך, ביניים, ואוכלוסיות תא יעד גבוה. לאחר מכן לרכוש סך של 2, 000 CFSE-נמוך אירועים בערוץ Fluorescence 1, ולחשב את התזה הספציפית של כל אוכלוסיית תא היעד קוגניציה על פי הנוסחה המפורטת בטקסט. בניסוי מייצג זה, ההצלחה של דלדול תאי T רגולטוריים המתרחשים באופן טבעי בעכברים מוזרק עם נוגדן חד שבטי נגד CD25 אושרה על ידי ציטומטריית זרימה.
כצפוי, פסגות כמעט שוות המתאימות לתאי היעד של הבקרה וההתזהה היו ניתנות לגילוי בעכברים נאיביים. לעומת זאת, תאי יעד המציגים Site-IV נעדרו כמעט לחלוטין בעכברים בעלי פריים אנטיגן T, ללא קשר לטיפולם הקודם בנוגדנים חד שבטיים נגד CD25 או PBS. מעניין, באופן טבעי T reg התא דלדול על ידי נוגדן חד שבטי נגד CD25 מוגברת vivo cytotoxic T-לימפוציטים מתווך תזה של תאי היעד Site-I-פעימות.
בחקירה ייצוגית שנייה זו, מוות מתוכנת 1 המצור משופרת תת דומיננטי CD8 חיובי T תאים אתרים אחת ושתיים לוכסן-שלוש ספציפיות תגובות, מה שמרמז כי הפרעה למוות מתוכנת 1/מתוכנת מוות ליגנד 1 אינטראקציות עלול לגרום אפיטופ מתפשט בתגובות נגד סרטן CD8 חיובי תא T. זה קריטי בעת תיוג התאים התורמים שלך עם CFSE, ודא שהריכוזים שלך מדויקים. אחרת זה עלול לגרום פסגות היסטוגרמה חופפות, מה שהופך את החישובים הנדרשים שלך פרשנות נתונים קשה, אם לא בלתי אפשרי.
זה יהיה חשוב לייעל במבחני vivo cytotoxicity לכמת פונקציות אפקטים עורר על ידי סוגי תאים רוצח שונים המזהים אנטיגנים פפטיד ולא פפטיד באותו מארח.
