עבודה זו נתמכה על ידי מענקים תפעוליים BAV מקרוהן וקוליטיס קרן של קנדה (CCFC) והמכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR). GB מומן על ידי מלגת לימודים לתואר שנייה מCIHR. BAV הוא הילדים עם הפרעות מעיים וכבדים (ילד) יו&quot;ר קרן לחקר מחלת מעי דלקתי בילדים וקנדה מחקר קתדרת הילדים גסטרואנטרולוגיה.

1. הכנת Citrobacter rodentium הבידוד וGavage האוראלי של עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן וחיטוי לוריא Bertani מרק (LB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג ג קיימא rodentium ממניות גליצרול קפוא ופס על הצלחת אגר LB באמצעות לולאת סטרילי inoculating או קצה פיפטה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לחסן 3 מ&quot;ל של מרק LB סטרילי בצינור תרבות בז עם מושבות מצלחת LB באמצעות לולאה או inoculating קצה פיפטה. הכנת הבידוד צריך להיעשות תוך שימוש בטכניקות אספטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת ג תרבות rodentium אירובי על 37 מעלות צלזיוס בלילה בbenchtop דגירה ייקר ב 200 סל&quot;ד. מרק LB המחוסן אמור להופיע לאחר מעונן תרבות הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנורה הטתה מחט gavage קיבה מחוברת למזרק 1 מ&quot;ל לgavage כל עכבר עם 100 μl של ג הלילה תרבות rodentium. בעדינות את עורף העכבר, תוך כדי אחיזה בעור הרפוי בחוזקה את הצוואר ובגבועם אגודל ואצבעות. משוך את ראשו של בעל החיים עם האצבע שלך כדי לשתק את הראש וליישר את הוושט להחדרה של מחט gavage. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על העכבר בתנוחה זקופה ולכוון את קצה הנורה של מחט gavage בצד של הפה שלו ועל לשונו. בעדינות להעביר את המחט לאורך הגג של הפה ולקדם אותו לוושט. אם קיימת התנגדות הרגישה במהלך הליך זה, להסיר את מחט gavage מחדש להכניס אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להזריק 100 μl של בידוד החיידקים ועדינות להסיר את מחט gavage. לפקח על קצב נשימה ובהתנהגות של העכבר לאחר החזרתו לכלוב שלו. </li></ol> הערות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלבי 2 ו 3, גם להכין צינור תרבות בז באמצעות טכניקות אספטיים עם 3 מ&quot;ל של מרק LB סטרילי כדי להיות מתורבת לילה כדי לוודא שאין זיהום חיידקים של המרק עצמו. מרק LB צריך להופיע ברור לאחר תרבות הלילה. </li><li&gt; עדינות להתסיס את התרבות בתוך צינור הבז לפני טעינת מזרקים לgavage כך שמינון שווה של חיידקים מועבר לכל עכבר, בשלב 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות לינה אמורה להיות מושלכת אם הוא כבר מחוסן במשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכל ג זיהומי rodentium ודיור של חיות נגועות צריכים להתבצע ברמת בטיחות ביולוגית מתקן 2. </li></ul> 2. מדידת חדירות המחסום אפיתל במעי ג עכברים נגועים rodentium <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד שלמות המחסום לאחר פגיעת נקודת זמן רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של assay, להכין מספיק 4 isothiocyanate kDa fluorescein (FITC)-dextran מומסת בנאגר מלוח פוספט (PBS) לריכוז של 80 מ&quot;ג למ&quot;ל -1 gavage כל עכבר עם 150 μl ולהכין את עקומת הסטנדרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עורף העכבר וgavage עם 150 μl של FITC-dextran. למשוך אוכל מכלוב בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם עכברים 4 שעות אחריgavaging ולאסוף כמה שיותר דם ככל האפשר (~ 450 μl) דרך לנקב לב. הוסף את הדם לריכוז סופי של 3% דקסטרוז החומצה ציטראט בצינור microcentrifuge להרתיע קרישה. להרדים את העכברים ולאסוף רקמות מעי גסות בPBS לספירת חיידקים (שלבים 3.1-3.5) ושל 10% בפורמלין לקיבוע רקמה וסופו של דבר צביעת immunofluorescence (שלבים 4.1-4.8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את דגימות הדם ב1000 XG ל12 דקות בצנטריפוגה ב 4 ° C. לאסוף הסרום ולדלל ל 1/10 ו1 / 100 ב PBS. הוסף 100 μl של כל דגימה בשני הדילולים האלה לצלחת גם 96 במשכפל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את עקומת הסטנדרט, לדלל המקורי 80 מ&quot;ג המ&quot;ל -1 FITC-dextran משמש לgavage העכברים בPBS לריכוזים הבאים: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, ו 0 מיקרוגרם / מ&quot;ל . הוסף 100 μl של כל ריכוז לצלחת גם 96 בשלושה העתקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הקרינה של כל דגימה באמצעות fluorometer בעירור wavelength של 485 ננומטר וגל פליטה 535 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את נתוני הגלם ידי התוויית עקומת הסטנדרט. את הנתונים הגולמיים לכל דגימה למשוואה של הקו שנוצר על ידי עקומת הסטנדרט כדי לקבוע את הריכוז של FITC-dextran בכל מדגם קלט. </li></ol> הערות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיל 4 ואילך צעד, לשמור דגימות דם על קרח ולצמצם את החשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מודדים את שלמות המחסום אפיתל זמן נקודה, או לפני, 7 ימים לאחר הפגיעה הם אופטימליים, כניזק לרקמות חמור מתרחש לאחר נקודה זו. מדידת יושרת מכשול בטרם התרחשות ניזק חמורה מאפשרת לך לקבוע את ההבדלים בחדירות מקסימאליים במהלך ג זיהום rodentium בין הזנים של עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שעכברי בקרה נגועים גם נבדקים לשלמות מחסום האפיתל. </li></ul> 3. מדידה של עומס חיידקים ברקמות של ג עכברים נגועים rodentium <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 המ&quot;ל סטרילי PBSND מתכת חרוז לסיבוב autoclaved שפל צינור צנטריפוגה מ&quot;ל 2 באמצעות טכניקת aseptic. רקמות בודדות שנאספו מכל חיה תהיינה ממוקמות בצינורות PBS נפרדות. לשקול את הצינורות לפני תוספת של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את cecum ומעי הגס מהעכבר. הפרד cecum מהמעי הגס ודוחף החוצה את תוכן luminal באמצעות מלקחיים. הוסף את התוכן לצינור PBS. לאחר שנפרד 0.5 סנטימטר מסעיפים במעי הגס וcecum דיסטלי לקיבעון פורמלין 10%, חתך את המעי הגס וcecum נותר longitudinally ולשטוף עם PBS סטרילי לפני נחת צינורות ברקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את צינורות PBS עם רקמה ולאחר מכן הומוגני את הדגימות באמצעות מקצף חרוז 6 דקות ליום 30 רץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שימוש בטכניקות אספטיים, להוסיף 180 PBS סטרילי μl להיטב לצלחת גם 96. הוסף 20 μl של כל מדגם הומוגני לבאר הראשונה בכל שורה. מערבב היטב ולדלל סדרתי, והוסיף 20 μl מכל קודם גם להשיג דילולים מ -10 -1 (ראשוןLL) ל10 -6. 10 μl הצלחת של כל דילול מכל מדגם בשלושה עותקים בצלחת LB תחתית מרובעת עם רשת. דגירת הלילה בשעת 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת יחידות מושבה להרכיב (CFU), אז ממוצע של 3 ספירות, ולהקליט את הדילול שבכל דגימה שנספרה. הכפל CFU הממוצע של 50, כמו 20 μl של מדגם המ&quot;ל המקורי 1 היה בשימוש, ועל ידי גורם הדילול שבמדגם נספר כתוצאה CFU / מ&quot;ל. לבסוף, לחלק לפי משקל הרקמה כדי לקבוע CFU / g. </li></ol> 4. הערכה היסטולוגית וכתמי immunofluorescence של רקמות נגועות קולון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף רקמות כמו בשלב 3.2. רקמות חנות בלילה פורמלין, ולאחר מכן לשטוף עם אתנול 70%. שבץ רקמות בפרפין ולחתוך 5 חלקי מיקרומטר לכתמים. כתם עם hematoxylin &amp; eosin להערכה היסטולוגית ולהמשיך לשלבים הבאים להכתמת immunofluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לdeparaffinize רקמות לפני הצביעה, מחליק במקוםצנצנת מכתימה Coplin ולשים באמבט מי 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בשלב בא, שקופיות מקום בקסילן במשך ארבע כביסות של 2 דקות כל אחד. שקופיות אז יש rehydrated עם שתי כביסות 5-דקות באתנול 100%, ואחרי 5 דקות לשטוף 1 בכל אחד מאלה: אתנול 95%, 75% אתנול ו DH 2 0. שטיפות אלו צריכות להיעשות במנדף להימנע מחשיפה לאדים מזיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות מקום בצנצנת Coplin עם חיץ מראש התחמם נתרן ציטראט ולאחר מכן למקום ספינה למשך 30 דקות, אז תנו לו לשבת 30 דקות. תהליך זה מפרק את חלבון קישורי צלב עשוי קיבעון פורמלין אחזור אתרי antigenic פוטנציאליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBS יזיד למשך 5 דקות, שלוש פעמים. מגלשות יבשות ושטח סביב סימן רקמות עם עט PAP כדי ליצור מחסום הידרופובי, שמירה על ריאגנטים המכתים מותאמים ברקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה חסומה לשעה 1 בטמפרטורת חדר עם חיץ חסימה (למשל α תיש סרום) בתא לחות immunostaining. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל חסודנוגדן ארי לריכוז רצוי באמצעות חיץ דילול נוגדן. יוצק את חסימת חיץ ולהוסיף 50-100 μl של נוגדן ראשוני לרקמות. לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBS יזיד למשך 5 דקות, שלוש פעמים. הוסף 50-100 μl של נוגדן משני דילול בחיץ דילול נוגדנים לרקמות ו הדגירה בטמפרטורת החדר למשך השעה 1 בחושך. לשטוף עם DH 2 O למשך 5 דקות, שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש שקופיות, להוסיף DAPI להאריך בינוני זהב הרכבה ולהחיל coverslip. צפו בשקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> הערות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS יזיד ניתן להחליף עם PBS המוכן טרי כאלטרנטיבה, כדי למנוע התפתחות חיידקים במדיום השטיפה מ4 ואילך צעד. </li></ul>

<ol>
	<li>Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD:+lessons+from+mouse+infection+models.">The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).</li><li>Cario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+Receptors+in+Inflammatory+Bowel+Diseases:+A+Decade+Later.">Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).</li><li>Eckmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Inflammatory+Bowel+Disease.">Animal Models of Inflammatory Bowel Disease.</a> Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).</li><li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man.">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).</li><li>Luperchio, S., Schauer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+Citrobacter+rodentium+and+transmissible+murine+colonic+hyperplasia.">Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia.</a> Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).</li><li>Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+host+responses+to+enteric+bacterial+pathogens:+a+balancing+act+between+resistance+and+tolerance.">Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance.</a> Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).</li><li>MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+defences+to+Citrobacter+rodentium.">Host defences to Citrobacter rodentium.</a> International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).</li><li>Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+the+Citrobacter+rodentium+infection+model+in+laboratory+mice.">Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).</li><li>Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2+plays+a+critical+role+in+maintaining+mucosal+integrity+during+Citrobacter+rodentium-induced+colitis.">Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis.</a> Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).</li><li>Dennis, A., Kudo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p50+subunit+of+NF-&#954;B+is+critical+for+in+vivo+clearance+of+the+non-invasive+enteric+pathogen+Citrobacter+rodentium.">The p50 subunit of NF-&#954;B is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection &amp; Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).</li><li>Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88+signalling+plays+a+critical+role+in+host+defence+by+controlling+pathogen+burden+and+promoting+epithelial+cell+homeostasis+during+Citrobacter+rodentium-induced+colitis.">MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis.</a> Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).</li><li>Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signaling+mediated+by+MyD88+is+required+for+a+protective+innate+immune+response+by+neutrophils+to+Citrobacter+rodentium.">TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium.</a> Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).</li><li>Bry, L., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+T+cell+dependent+serum+antibody,+but+not+the+gut-associated+lymphoid+tissue,+for+surviving+acute+mucosal+infection+with+Citrobacter+rodentium,+an+attaching+and+effacing+pathogen.">Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).</li><li>Simmons, C. P., Clare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+for+B+lymphocytes+and+CD4++T+cells+in+immunity+to+infection+by+the+attaching+and+effacing+pathogen+Citrobacter+rodentium.">Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection &amp; Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).</li><li>Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Roles+of+Notch+and+Wnt/&#946;-Catenin+Pathways+in+the+Regulation+of+Hyperplasia+and/or+Colitis+in+Response+to+Bacterial+Infection.">Critical Roles of Notch and Wnt/&#946;-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection.</a> Infection &amp; Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

זיהום rodentium Citrobacter מספק מודל יקר לחקר מחלות וקוליטיס בעכברים מדבקים. מודל ייחודי זה מאפשר אפיון של שתי התגובות המארחות, כמו גם את התכונות של חיידקים פתוגניים. השלבים מתוארים בפירוט בפרוטוקול זה שימוש המוצלח של דגם זה. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה כדי לזכור בעת גרימת קוליטיס ומנתח את התשובות. ראשית, ההכנה טרי ג לילה בידוד rodentium במרק LB נדרש לזיהום מוצלח של עכברים. כמו במנה של 10 8 -10 9 אורגניזמים נדרשה להדביק רוב הזנים של עכברים, אם נשאר בבידוד ייקרו או על גבי הספסל בטמפרטורת חדר לתקופות ממושכות, לא יהיו מספיק אורגניזמים קיימא שנותרו בתרבות כדי לגרום לדלקת מעי גס על זיהום. חשוב גם כדי להתסיס בידוד החיידקים לפניטעינת המזרק לזיהום, על מנת להבטיח שכל עכבר מקבל מינון שווה של חיידקים. כאשר איסוף רקמות על תחנה סופית של הזיהום, להשלים שקיעה של רקמות המעי הגסות בנפח גדול של 10% פורמלין נדרש לקיבוע רקמה תקין להתרחש. הוא הציע כי רקמות תתווספנה לפורמלין בבקבוקון מ&quot;ל 5, ולא לתוך צינורות microcentrifuge כ10:01 יחס מקבע לרקמות מומלצות. קיבעון נכון הוא חיוני לניתוח מאוחר יותר היסטולוגית, כמו גם כתמי immunofluorescence של רקמות אלה. כמו כן, חשוב לזכור כי זני נוקאאוט שונים יהיו שונים תגובות על אינדוקציה של ג קוליטיס rodentium. כשמדביק זן חדש בפעם הראשונה, עכברים צריכים להיות במעקב מקרוב כדי לקבוע נקודת סיום הומאני לניסוי, במידת צורך. נקודתי זמן לניתוח של יושרת אפיתל מכשול, המון חיידקים, והיסטולוגיה ניתן להגדיר בהתבסס על התגובה של העכברלהתאמץ עניין לזיהום. כציפוי של homogenates רקמות על צלחות LB כדי לקבוע המון חיידקים הוא לא שיטה כל סלקטיבית, ביצוע PCR לג גן ספציפי rodentium על מושבות חיידקים ניתן לעשות כדי לבדל ג rodentium מbacterialcolonies האחר בצלחת. אפשרות נוספת היא homogenates רקמות הצלחת אגר על MacConkey, כמדיום הזה הוא סלקטיבית יותר לג rodentium מ אגר LB. גישה חלופית היא להשתמש סטרפטומיצין ג עמיד פראי מסוג instead.Substitution המתח rodentium עם זן עמיד סטרפטומיצין יגרום אינדוקציה מאותו דגם קוליטיס מתואר בפרוטוקול זה. היתרון של שימוש בזן העמיד לסטרפטומיצין הוא ניתוח קל יותר של עומסי חיידקים, כhomogenates רקמות מזיהומים אלה ניתן מצופה על אגר LB בתוספת סטרפטומיצין במקום אגר LB לבד. זה ימנע צמיחה פוטנציאלית של commחיידקי ensal על הצלחת, מה שהופך את תהליך ספירת CFU קל יותר ומדויק יותר. חלופה נוספת תוך מדידת עומסי חיידקים, היא לדגירת צלחות לאחר ציפוי דילולים של homogenates רקמות על אגר LB באו 37 מעלות צלזיוס למשך לילה או בטמפרטורת חדר במשך 2-3 ימים, וכתוצאה מהתפתחות חיידקים איטיות יותר, לפני הספירה. פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לייצר מודל חזק של קוליטיס המדבק, כמו גם השיטות המשמשות לאפיון ג זיהום rodentium בעכברים. מלבד שימוש במודל זה כדי לבחון אינטראקציות פתוגן מארחים ותגובות חיסוניות, זה יכול לשמש גם כדי ללמוד איך זיהום חיידקים יכול להגביר את הסיכון לסרטן המעי גס. ניתן לעשות זאת על ידי חשיפת ג rodentium נגוע עכברים לazoxymethane המסרטן, או על ידי הלימוד כיצד משפיע זיהום על התפשטות תאים אפיתל, או על גני המעורבים בהתמיינות תאי אפיתל או התפתחות גידולים 15. לנוing מודל קוליטיס המדבק המפורטים בפרוטוקול זה, מספרי חיידקים יכולים גם להיות מוערכים באתרים נוספים ומעיים, כגון בלוטות לימפה, טחול mesenteric והכבד. מספרים גבוהים יותר באיברים אלה עלולים להצביע על כך שעכבר הזן הנבדק הוא רגיש מאוד לזיהום. שימוש בטכניקת צביעת immunofluorescence תארה, מספר בלתי מוגבל של מנגנונים בתגובה לזיהום יכול להיות חוקר. ברגע שמכיר את הטכניקות המפורטות כאן, הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי לאסוף רקמות למדוד נקודתי קצה אחרות, כגון להפקה והערכה של רמות ביטוי גני RNA, יותר ביסודיות כדי לאפיין תגובות לג rodentium זיהום.

זיהום על ידי חיידקים פתוגנים enteric מעורר דלקת במערכת עיכול (GI), כמו גם פתולוגיה במעיים ופתופיזיולוגיה, כולל שלשולים ובעיות בתפקוד מחסום אפיתל במעי. המנגנונים הארסיים שבו חיידקים פתוגנים ליישב במערכת העיכול של מארחיהם, כמו גם תגובות מארחות ספציפיות המגנות מפני זיהומים כאלה הם הבינו היטב, אך ההתקדמות האחרונה בדוגמנות של זיהומים חיידקיים enteric החלה לסייע להבנה של תהליכים אלה שלנו. חיידקי enteric נקשר גם למחל מעי דלקתיות (IBDs). המחלות של IBDs קרוהן (CD) והאוניברסיטה קליפורניה הן מחלות מורכבות של מסיבות לא ברור, המתאפיינות בדלקת מעיים כרוניות וניזק לרקמות. מודלי עכבר רבים של דלקת מעיים קיימים, מדלקת ספונטנית בזנים מהונדסים גנטי, כגון IL10 - / - עכברים, לאתגרים עם תרכובות כימיים, כגון נתרן גופרתי dextran (DSS) ודinitrobenzene חומצת sulfonic (DNBS) 1. זה כבר שער שהתגובה הדלקתית הכרונית הסתגלותי בהווה בחולי IBD לפתח באנשים רגישים גנטי עם חשיפה לא תקינה של מערכת החיסון ברירית המעי לחיידקי enteric 2, ולכן המחקר של מודלים של קוליטיס המדבק גם מציע פוטנציאל משמעותי להגדרת פוטנציאל מארח פתוגניים . תגובות לחיידקי enteric Citrobacter rodentium המושרה קוליטיס היא האחד הדגמים הנדירים של קוליטיס המדבק שכבר אפיינו 1,3 היטב, ומאפשרים לניתוח של תגובות מארחות לחיידקי enteric והבנה נוספת של מנגנונים אפשריים של היווצרות מחלת מעי דלקתי; צעד חיוני בפיתוח טיפולים מונעים וטיפוליים חדשניים. ג rodentium הוא מצרף גרם שלילי והשתפשפות (/ E) הפתוגן, עכברי ספציפי חיידקים הקשור באופן הדוק לאדם החשובפתוגנים enteropathogenic E. coli (EPEC) וenterohaemorrhagic E. coli (EHEC) 3-8. משפחתו של פתוגנים / E אינטימית לצרף קרום התא המארח הקודקוד של האפיתל cecal ומעי גס, ויצרה מבנה לא פולשנית דום דמוי בתא הפונדקאי. אתגר אוראלי עם ג rodentium של 10 8 -10 9 אורגניזמים מייצר דגם חזק של קוליטיס המדבק מתאפיין היפרפלזיה או התארכות מעי של מאורות, חדירה לתא חיסוני mononuclear וירידה בכמות תאי גביע 3,4. האתר הראשוני של קולוניזציה, כמה שעות אחרי אתגר, הוא בתיקון cecal, ואחרי התקדמות למעי גס דיסטלי 2 עד 3 ימים לאחר ההדבקה 3. בזני עכברי immunocompetent, אישור של הפתוגן מושגת 3 עד 4 שבועות לאחר ההדבקה 1,3,4. עם זאת, זנים רבים מהונדסים גנטי, כלומר גן לקוי או נוקאאוט (- / -) עכברים, נמצא להצגת increased רגישות לזיהום וכתוצאה מכך לניזק מוגזם ו / או דלקת ודלקת כרונית 9-14. השימוש במודל זה קוליטיס המדבק בנוקאאוט הזנים האלה, חסרי חלבוני איתות מולדות רבות, היה הכרחי בחושפים כמה חלבונים מארחים אינטגרליים לרזולוציה של זיהום ודלקת מעיים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מרק לוריא </td><td> ABM </td><td> G247 </td><td> הוסף 25 גר &#39;אבקת LB ל1L של מים. חיטוי לפני השימוש. </td></tr><tr><td> צלחת תחתונה מרובעת עם רשת </td><td> דיג </td><td> 08-757-11A </td><td></td></tr><tr><td> צינור תרבות פלקון </td><td> Sarstedt </td><td> 62.515.006 </td><td></td></tr><tr><td> נורה הטתה מחט gavage קיבה </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 18060-20 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק 1 מ&quot;ל </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> 4 kDa FITC-dextran </td><td> סיגמא </td><td> FD-4 </td><td></td></tr><tr><td> חומצת לימון </td><td> סיגמא </td><td> C7129 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> ציטרט הנתרן </td><td> דיג </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> דקסטרוז </td><td> דיג </td><td> D16.1 </td><td></td></tr><tr><td> חומצת ציטראט דקסטרוז </td><td></td><td></td><td> 20 חומצת mM ctiric, ציטרט הנתרן mM 110, 5 המ&quot;מ דקסטרוז </td></tr><tr><td> לוח שחור 96-היטב </td><td> דיג </td><td> 07-200-762 </td><td></td></tr><tr><td> חרוזי מתכת (5 מ&quot;מ) </td><td> Qiagen </td><td> 69989 </td><td></td></tr><tr><td> 10% פורמלין </td><td> דיג </td><td> 5F93-4 </td><td></td></tr><tr><td> 5 מיליליטר בקבוקון </td><td> DiaMed </td><td> STK3205 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> דיג </td><td> H345-23 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin </td><td> דיג </td><td> E511-100 </td><td></td></tr><tr><td> קסילן </td><td> דיג </td><tד&gt; HC700-1GAL </td><td></td></tr><tr><td> 20 Tween </td><td> סיגמא </td><td> P5927 </td><td></td></tr><tr><td> צנצנת מכתימה Coplin </td><td> VWR </td><td> 47751-792 </td><td></td></tr><tr><td> חיץ ציטרט הנתרן </td><td></td><td></td><td> 10 ציטרט הנתרן מ&quot;מ, 0.05% Tween 20, pH 6.0 </td></tr><tr><td> עט פאפ </td><td> Cedarlane </td><td> Mu22 </td><td></td></tr><tr><td> סרום עיזים </td><td> סיגמא </td><td> G902-3 </td><td></td></tr><tr><td> שור אלבומין (BSA) </td><td> דיג </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמא </td><td> T8532 </td><td></td></tr><tr><td> יזיד הנתרן </td><td> סיגמא </td><td> SZ002 </td><td></td></tr><tr><td> חסימת חיץ </td><td></td><td></td><td> 2% סרום עיזים, 1% BSA, 0.1% Triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% נתרןתזיד, 0.01 M PBS, 7.2 pH, לערבב וחנות ב 4 ° C. </td></tr><tr><td> חיץ דילול נוגדן </td><td></td><td></td><td> 0.1% Triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% יזיד הנתרן, 0.04% EDTA </td></tr><tr><td> חיץ דילול חיץ ונוגדן לחסימת טיר </td><td></td><td></td><td> מתכונים כנ&quot;ל, אך ללא תוספת של חומרי ניקוי (טריטון X-100 ו 20 tween) </td></tr><tr><td> להאריך מגיב Antifade זהב עם DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> דיג </td><td> 12.54SE </td><td></td></tr><tr><td> Benchtop דגירה ייקר </td><td> Barnstead מעבדת קו </td><td> מקס Q4000 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorometer </td><td> פרקין אלמר </td><td> Victor2D </td><td></td></tr><tr><td> צנטריפוגה בקירור </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microfuge 22R</td><td></td></tr><tr><td> אוניית קיטור </td><td> בלק אנד דקר </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי </td><td> Zeiss </td><td> Axio Image.Z1 </td><td></td></tr></tbody></table>

the citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לייצר מודל חזק של מחלה מדבקת וקוליטיס, כמו גם את השיטות כדי לאפיין Citrobacter זיהום rodentium בעכברים. ג rodentium הוא הפתוגן גרם שלילי, עכברי ספציפי חיידקים הקשור באופן הדוק לחשיבות קלינית האנושי פתוגנים enteropathogenic E. coli וenterohemorrhagic E. coli. עם ההידבקות בג עכברי rodentium, immunocompetent סובלים מירידה במשקל צנוע וחולפת ושלשולים. ביסטולוגיה, התארכות מעי קריפטה, חדירה לתא חיסוני, ודלדול תא גביע הם נצפו. חיסול של זיהום מושג לאחר 3 עד 4 שבועות. מדידה של יושרת מעי אפיתל מכשול, עומס חיידקים, וניזק היסטולוגית בנקודתי זמן שונים לאחר הדבקה, מאפשרת אפיון של זני עכברים רגישים לזיהום. מנגנון הארסיותזה שבו חיידקים פתוגנים ליישב את המעי של מארחיהם, כמו גם תגובות מארחות ספציפיות המגנות מפני זיהומים כאלה הם הבינו היטב. לכן ג מודל rodentium של זיהום חיידקי enteric משמש ככלי חשוב כדי לסייע בהבנה של תהליכים אלה שלנו. חיידקי enteric נקשר גם למחל מעי דלקתיות (IBDs). זה כבר שער שהתגובה הדלקתית הכרונית הסתגלותי ראתה בחולי IBD לפתח אצל אנשים רגישים גנטיים לאחר חשיפה לא תקינה של מערכת החיסון ברירית המעי לחיידקי enteric. לכן, המחקר של מודלים של קוליטיס המדבק מציע פוטנציאל משמעותי להגדרת פוטנציאל תגובות מארחות פתוגניים לחיידקי enteric. ג rodentium המושרית קוליטיס היא דגם נדיר אחד כזה שמאפשר ניתוח של תגובות מארחות לחיידקי enteric, קידום ההבנה של מנגנונים אפשריים של IBD פתוגנזה שלנו;חיוני בפיתוח טיפולים מונעים וטיפוליים חדשניים.

במהלך ניסוי זיהום רגיל, עכברים נגועים בכ -2.5 x 10 CFU 8 עד gavage של 100 ג לילה μl תרבות rodentium. זיהום של עכברי C57BL / 6 עם ג תוצאות rodentium בירידה במשקל צנוע וחולפת ושלשולים. אמנם נדיר עם C57BL / 6 עכברים, בעלי חיים עלולים להיות חולים ודורשים euthanization. לכן, עכברים צריכים להיות במעקב למידה של ירידה במשקל ותסמינים של מצוקה כגון פרוות piloerect ויציבה כפופה, כדי לקבוע את המידה שבה זנים שונים מושפעים מהזיהום. תוצאות מוצגות באיורי 1 עד 4 הן נציג של זיהום נעשה באמצעות תרבות לילה שהוכנה ממניות גליצרול קפוא. ב7 ימים לאחר פגיעה, עכברים היו מורדמים ודם נאסף באמצעות לנקב לב. איור 1 מציג FITC-dextran נמדד בסרוםשל עכברי C57BL / 6, כמו גם מאגרה כמו עכברי נוקאאוט הקולטן 2 (TLR2), אשר בעבר כבר נמצאו להפגין יושרת המחסום אפיתל לקוי במהלך הזיהום 9. בנוכחות של מחסום אפיתל במעי שלם, 4 kDa FITC-dextran הוא גרוע חדיר דרך שכבה זו. לכן, רמות גבוהות של FITC-dextran בסרום מצביעות ירידת ערך של שלמות המחסום אפיתל במעי במהלך הדבקה ומאפשרת מולקולה זו לדלוף פני. כביקורת, רמות בסרום בעכברים נגועים gavaged עם FITC-dextran מוצגות גם. לאחר פגיעה בשבוע אחד, המון חיידקים במעי הגס נמצאו לשיא סביב 10 9 CFU / g 3,4. המון חיידקים יכולים להימדד בנקודות לאחר פגיעת זמן רצוי כדי לאשר זיהום, כמו גם להעריך אם עכברי נוקאאוט שונים סובלים מעומס חיידקים עלו או ירדה. כג rodentium הוא הפתוגן שיכול luminal אינטימי adhפה לתאי אפיתל במעי, המון חיידקים בתוכן, luminal cecal, ורקמות מעי גסות ניתן למדידה. איור 2 מראה המון חיידקים טיפוסיים נמדד לאחר הפגיעה 7 רקמות cecal ומעי גסים, כמו גם ביום בתוך חלל מעי C57BL / 6 עכברים. רוב הפתולוגיה נצפתה במהלך ג זיהום rodentium בעכברי C57BL / 6 מתרחש ב2 סנטימטר דיסטלי של colon11. Macroscopically של 7 ימים לאחר פגיעה, עיבוי של רירית המעי, כמו גם קיצור באורך של המעי הגס נצפה, עם ניזק גלוי קטן ראה בC57BL / 6 עכברים. בדרך כלל במהלך הדבקה, C57BL / 6 עכברים סובלים דלקת מתונה בלבד ומאופיינת ביסטולוגיה פתולוגיה על ידי חדירה של תאים חיסונית, התארכות של מאורות מעי גסים וירידה בכמות תאי גביע (איור 3). כפי שניתן לראות בסעיפי H &amp; E באיור 3, מספר תשובות מארחות הם רכובים during זיהום עם ג rodentium. כדי להמשיך לאפיין את השינויים הללו, כתמי immunofluorescence יכולים להיות מנוצלים כדי לבחון את השינויים בחלבונים של עניין, כגון סמנים של תפוצה, מוות של תאים, או תגובות חיסוניות מולדות ומסתגלות. מכתים immunofluorescence הוא גם ערך לבחינת היבטים של תגובת החיידקים, כגון הלוקליזציה שלה בתוך הרקמה הנגועה. דוגמה לטכניקת צביעה זו, בוחנת מארח חלבון ki67 (אדום), מרקר לשגשוג תאים וג rodentium החלבון טיר, ירוק, לבחון לוקליזציה חיידקים ביום 12 לאחר הפגיעה מוצג באיור 4. <img src="/files/ftp_upload/50222/50222fig1.jpg" alt="איור 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50222/50222fig1highres.jpg" /> איור 1. מדידה של סרום FITC-dextran להעריך שלמות מחסום האפיתל. עכברים היוgavaged עם 4 kDa FITC-dextran תנאים נגועים ולאחר 7 ימים לאחר פגיעה, לאחר שרמות סרום FITC-dextran נקבעו. C57BL / 6 עכברים (WT) מפגינים עלייה זניחה ברמות FITC-dextran סרום ב7 ימים לאחר פגיעה בהשוואה לתנאים נגועים. לעומת זאת, TLR2 - / - עכברים גדלו רמות של FTIC-dextran בסרום באופן משמעותי בהשוואה לתחילת מחקר המצביע על יושרה נפגעת קשה מכשול בזן זה בג זיהום rodentium, כפי שהוכח בעבר. <img src="/files/ftp_upload/50222/50222fig2.jpg" alt="איור 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50222/50222fig2highres.jpg"/> איור 2. ג עומס rodentium בלומן, cecum, ומעי הגס של C57BL הנגוע / 6 עכברים ב7 ימים לאחר פגיעה. לומן, cecal, ורקמות מעי נאספו, הומוגני, ומצופה בדילול סדרה על אגר LB. כל גircle מייצג מדגם יחיד שנאסף מבעלי חיים בודדים. קווים מלאים מצביעים על הממוצע הגיאומטרי ואילו עמודות אנכיות שגיאה מצביעים SEM. <img src="/files/ftp_upload/50222/50222fig3.jpg" alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50222/50222fig3highres.jpg"/> איור 3. ניתוח היסטולוגית של ניזק הנגרם על ידי C. זיהום rodentium. על ידי חדירה של 7 ימים לאחר פגיעה מתונה חיסונית תא, כמו גם התארכות של מאורות, דלדול תא גביע ובצקת קלה הוא ציין לעומת שליטת רקמה נגועה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50222/50222fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/50222/50222fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. מכתים immunofluorescence על נגועה והיום 12 לאחר infecרקמות tion של עכברי C57BL / 6. רקמות מעי גסת דיסטלי מוכתמות למארח חלבון ki67 (אדום) וג rodentium החלבון טיר (ירוק).

Watch this Scientific Journal Video about The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis at JoVE.com

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

זיהום rodentium Citrobacter מספק מודל יקר ללמוד זיהומים חיידקיים enteric כמו גם לארח תגובות וקוליטיס חיסוניים בעכברים. פרוטוקול זה מתאר מדידה של יושרת מכשול, עומס הפתוגן ופגיעת היסטולוגית מאפשרת אפיון היסודי של תרומות פתוגן ומארח לקוליטיס המדבק העכברי.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; דגם עכבר: תרומות הפתוגן ומארח לומדים קוליטיס המדבק

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

the-citrobacter-rodentium-mouse-model-studying-pathogen-host

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

26.3K Views.  BC Children's Hospital. זיהום rodentium Citrobacter מספק מודל יקר ללמוד זיהומים חיידקיים enteric כמו גם לארח תגובות וקוליטיס חיסוניים בעכברים. פרוטוקול זה מתאר מדידה של יושרת מכשול, עומס הפתוגן ופגיעת היסטולוגית מאפשרת אפיון היסודי של תרומות פתוגן ומארח לקוליטיס המדבק העכברי.

Video: The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

הדמיה של multimodality 4D<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; זיהומים בעכברים

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including neoplastic, autoimmune, and chronic inflammatory diseases. Emerging evidence implicates pathogen-induced chronic inflammation in the development and progression of chronic diseases with a wide variety of clinical manifestations. Due to the complex and multifactorial etiology of chronic disease, designing experiments for proof of causality and the establishment of mechanistic links is nearly impossible in humans. An advantage of using animal models is that both genetic and environmental factors that may influence the course of a particular disease can be controlled. Thus, designing relevant animal models of infection represents a key step in identifying host and pathogen specific mechanisms that contribute to chronic inflammation.
Here we describe a mouse model of pathogen-induced chronic inflammation at local and systemic sites following infection with the oral pathogen Porphyromonas gingivalis, a bacterium closely associated with human periodontal disease. Oral infection of specific-pathogen free mice induces a local inflammatory response resulting in destruction of tooth supporting alveolar bone, a hallmark of periodontal disease. In an established mouse model of atherosclerosis, infection with P. gingivalis accelerates inflammatory plaque deposition within the aortic sinus and innominate artery, accompanied by activation of the vascular endothelium, an increased immune cell infiltrate, and elevated expression of inflammatory mediators within lesions. We detail methodologies for the assessment of inflammation at local and systemic sites. The use of transgenic mice and defined bacterial mutants makes this model particularly suitable for identifying both host and microbial factors involved in the initiation, progression, and outcome of disease. Additionally, the model can be used to screen for novel therapeutic strategies, including vaccination and pharmacological intervention.

Animal models have proven to be invaluable tools in defining host and pathogen specific mechanisms that contribute to the development of chronic inflammation. Here we describe a mouse model of oral infection with the human pathogen Porphyromonas gingivalis and detail methodologies to assess the progression of inflammation at local and systemic sites.

מודל של עכברים של דלקת כרונית הנגרם על ידי פתוגן באתרים מקומיים ומערכתיים

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

זיהום הניסיון עם<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; כמודל תגובות לימוד מארח אינטרפרון-γ

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

מודל תרבות Bursal-תא ראשי לשעבר Vivo עוף ללמוד פתוגנזה וירוס מחלה זיהומית Bursal

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...