במתקן ההדמיה vivo באימפריאל קולג&#39; במומן על ידי MRC.

<ol>
	<li>Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Luciferase+to+Image+Bacterial+Infections+in+Mice.">Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice.</a> J. Vis. Exp. (48), e2547 (2011).</li><li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium.">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).</li><li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+specificity,+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium.">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).</li><li>Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+a+'hyperinfectious'+bacterial+state+after+passage+of+Citrobacter+rodentium+through+the+host+gastrointestinal+tract.">Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract.</a> Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).</li><li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifidobacterial+surface-exopolysaccharide+facilitates+commensal-host+interaction+through+immune+modulation+and+pathogen+protection.">Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li><li>Collins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-treatment+with+Bifidobacterium+breve+UCC2003+modulates+Citrobacter+rodentium-induced+colonic+inflammation+and+organ+specificity+of+infection.">Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection.</a> Microbiology. , 10-1099 (2012).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li><li>Hardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder.">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303, 851-853 (2004).</li><li>Szittner, R., Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence,+expression,+and+properties+of+luciferase+coded+by+lux+genes+from+a+terrestrial+bacterium.">Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium.</a> J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).</li><li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence.">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).</li><li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging.">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).</li><li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting.">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940 (2012).</li><li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man.">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).</li><li>Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+variations+of+skin+pigmentation+in+C57BL/6+mice+affect+optical+bioluminescence+quantitation.">Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation.</a> Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).</li><li>Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+biophotonic+imaging+as+a+training+aid+for+administration+of+substances+in+laboratory+rodents.">Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents.</a> Lab Anim. 41, 321-328 (2007).</li><li>Crepin, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+the+Tir:Nck+and+Tir:IRTKS/IRSp53+signalling+pathways+in+vivo.">Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo.</a> Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).</li><li>Willekens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+radiation+dose+in+micro-CT+with+optimization+of+the+scan+protocol.">Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol.</a> ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).</li><li>Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-animal+X-ray+dose+from+micro-CT.">Small-animal X-ray dose from micro-CT.</a> Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).</li><li>Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+effects+of+whole+or+partial+body+x-irradiation+on+mice:+life+shortening.">Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening.</a> Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).</li><li>Kohn, H. I., Kallman, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+strain+on+acute+x-ray+lethality+in+the+mouse.+II.+Recovery+rate+studies.">The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies.</a> Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).</li></ol>

הייצור והגישה חופשי למאמר זה הוא בחסות PerkinElmer. המחברים קווין P, פרנסיס, ג&#39;ף Meganck וChaincy קואו הם עובדי Caliper-PerkinElmer חברה. כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לנהלים מדעיים בעלי חיים Act 1986 ואושרו על ידי הוועדה לבחינה האתית המקומית.

סרט 4D של זיהום חיידקים מספק כלי שימושי כדי להמחיש ולפרש כמויות גדולות של נתונים הדמיה רבת אפנות במהירות ובקלות. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מפורט של איך זיהום מתפשט דרך עכבר בודד וניתן להשתמש בו כדי לחקור כיצד מחיקה של מארח או גנים של חיידקים או התערבות עומס חיידקים, הפצה, לוקליזציה והשפעת אסטרטגיות מסוימת במהלך מחקר אורך 7. סרטונים אלה מספקים גם עזרי הוראה שימושיים ואמצעי להפצת מידע לציבור. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה שיכול להשפיע על איכות הנתונים המתקבלים מהדמית DLIT-μCT והיכולת לקמפל וידאו 4D של זיהום. החלק החשוב ביותר של פרוטוקול זה הוא הזיהום המוצלח והומוגנית של עכברים עם ג rodentium. זה חיוני כי העכברים המשמשים למחקר הם בין 18-20 גרם ושbacteinoculums ריאל מוכן טרי וכ 5 X 10 9 CFU, כפי שתואר לעיל 2,3. לפני ההדבקה של העכברים חשוב לבדוק שהבידוד הוא bioluminescent באמצעות הספקטרום CT ופעם הבידוד כבר מוכן, הוא חייב להיות הומוגני הרף לפני כל עכבר gavaged על מנת להבטיח שהעכברים יקבלו מינוני זיהומיות דומים. ההדמיה DLIT-μCT של עכברים בצורה מיטבית, כך שפונקצית החשיפה האוטומטית בתוכנת 4.3.1 תמונת חיים קובעת באופן אוטומטי את הפרמטרים ההדמיה האופטימליים עבור האות להיות הרבה מעל לרעש. עם זאת, פונקצית החשיפה האוטומטית מסתמכת על הגדרות משתמש מוגדר ופרמטרים אשר צריכים להיות שונה, כמתואר בהליך. הימנעות מלעשות זאת תגרום לעניי תמונות עם מספר נמוך של פוטונים שנאסף ושאינם נובע בהתקדמות ברורה בזיהום, כהגדרות היצרן של הספקטרום CT לautoexposure מתוכנתות לגידולי הדמיה להביעגחלילית לוציפראז. שחזורים בוצעו באמצעות 560-620 ננומטר לתת את ההסכם הטוב ביותר בין הנתונים מדומים ומדודים, ולכן הם נתונים המהימנים יותר לכלול בבנייה מחדש. הגבלה לשימוש בDLIT-μCT היא שהקרינה מייננת מסריקת μCT גורמת לניזקי קרינה תת קטלניים שהוא מצטבר על מחקר אורך 18. חשיפה לקרינה תת קטלנית יכולה להחליש את התגובה החיסונית, גורמת לניזק לדנ&quot;א, ואפופטוזיס באיברים פנימיים 19. סופו של דבר, נזק קרינה תת קטלני מצטבר יכול לגרום למוות אם LD 50/30 לקרינה מייננת חריגה, אשר בין 5 עד 7 Gy בהתאם לזן העכבר וגיל של העכברים משמש 18,20,21. למרות שחלק מהניזקים מולקולריים מקרינה מייננת יכולים לרפא, שכן עיקרון העל הוא להעריך מינון שמרני, זה לא היווה בדרך כלל עבור בתכנון מחקר. במקום זאת, המטרה היא להישאר כמה שיותר רחוק בלow מגבלות אלה ככל האפשר ועדיין להשיג את מטרות המחקר. הדבר חשוב במיוחד במחקר זה בגלל התגובה החיסונית הנורמלית לזיהום, לתדירות של הדמיה, ואת העובדה כי מהונדס, חיסוני מורכב, או נגוע במידה רבה בעלי חיים עשויה להיות רגישה יותר לקרינה מייננת. כאשר מתכננים ניסוי להפקת סרט 4D של זיהום, חשוב להביא בחשבון את אורכו של הניסוי, במספר μCT סורק נדרש בתקופה זו וLD 50/30 לקרינה מייננת לזן העכבר שבשימוש. מגבלה נוספת פוטנציאל DLIT-μCT היא כוח של הביטוי העיתונאי בזן החיידקים נמצאים בשימוש, כמו זה ישפיע מגבלות זיהוי חיידקים ושעות הדמיה. מומלץ מאוד שחוקרים משתמשים תוקף זני חיידקים שנמצאים באופן מלא ארסיים, אבל מותאם למקסימאלי לוקס אופרון ביטוי, כפי שהוכיח בעבר לBLI2,3. אזהרה אחת לעיצוב הנוכחי של ההדמיה 4D היא שכל סרט מורכב מסריקות DLIT-μCT בודדות שיש להם קנה מידה פוטון שונה. זה יכול להפוך את התמונות קשה לפרש אם השינויים ללוקליזציה של מוקדי BL, או עוצמתו הם עדינים, או אם יש מוקד אחד אינטנסיבי BL מוקף במוקדים חלשים מרובים. לכן, עבור פריטים חזותיים אורכיים, חשוב לשמור על פסי הצבע עקביים בנקודתי הזמן. הרעיון של סרט 4D של זיהום יכול להיות מיושם על כל מחולל מחלה חיידקית שכותרתו כראוי. פיתוח עתידי של טכניקה זו ישאף להשתמש דימות פלואורסצנטי טומוגרפיה (פליט), כמו גם כדי להקל על DLIT החקירה של תגובות מארחות לזיהום באמצעות שילוב של חיידקים פתוגנים bioluminescent וזריקות ניאון ליד בדיקות אינפרא אדום כדי לחקור את התגובות מארחות לזיהום. בנוסף לכך, בפרוטוקול זה אנו רקמתאר את השימוש של חיידקי bioluminescent ליצור סרטי 4D של זיהום. עם זאת, במקרים מסוימים ייתכן שיהיה צורך להשתמש בחיידקי שכותרת ניאון, למשל תויגו iRFP, כך שכתב פליטת אור יכול לשמש לחקר גנטיקה המארחת במהלך זיהום. חשוב מכך, השימוש בהדמיה רבת שיטת שילוב DLIT / פליט-μCT תאפשר לנו לחקור את הלא פולשני פרמטרים מרובים במהלך זיהום חיידקים, אשר יתרמו באופן משמעותי להפחתה, העידון, וההחלפה של השימוש בבעלי החיים במחקר מדעי כפי שמתואר ביוזמה של NC3R <a href="http://www.nc3rs.org.uk/" target="_blank">(http://www.nc3rs.org.uk/).</a>

מודלים של בעלי חיים קטנים, באותם עכברי ניצול מסוימים, משמשים באופן שגרתי כדי לחקור פתוגנזה חיידקים או לבחון אסטרטגיות התערבות לטיפול בדלקות, כגון אנטיביוטיקה, פרוביוטיקה, Prebiotics וחיסונים 1-7. את readouts הניסיוני העיקרי מזיהומים בבעלי החיים קטנים הם עומס הפתוגן, לוקליזציה מרחב ובזמן של הזיהום, ושינויים בתגובה החיסונית של האורגניזם הנגוע. בהדמיה אופטית vivo הוא כלי רב ערך למחקר מחלות מדבקות והוא יכול לשמש כדי לפקח על מספר רב של readouts ניסוי באמצעות השימוש בגני הכתב (חלבוני לוציפראז, ניאון, בטא lactamase, וכו &#39;), צבעי ניאון, חלקיקים או בדיקות chemiluminescent ממוקדות לחלבון, תהליך ביולוגי, או מיקרואורגניזם 6. הדמיה פליטת אור (BLI) היא שיטת הדמיה אופטית המשמשת לניטור קולוניזציה של בעלי חיים קטנים, כגון עכברים וחולדות, על ידי bacte פתוגנייםRIA 3,6,8,9. עכברים נגועים בחיידקים רקומביננטי המבטאים לוציפראז, כגון לוקס CDABE אופרון מluminescens Photorhabdus. לאחר מכן ניתן לאתר חיידקים אלה דרך הייצור שלהם באמצעות אור CCD מבוסס in vivo הדמיה מערכת 3,6,9. חשוב לציין, רק מיקרו אורגניזמים הפעילים מטבולית הם bioluminescent (BL), כלומר רק תאים חיידקיים קיימא מזוהים על ידי מתודולוגיה זו 10,11. שימוש 2D BLI, את מיקומו של מקור BL הוא להסיק את פני השטח של בעלי החיים שבו האות נפלט 8. הלוקליזציה האנטומי המדויקת של מוקדי BL in vivo צריכה להיקבע באמצעות ניתוח vivo לשעבר של איברים 3,6,9 לעומת זאת, מורכבת 3D מפוזר אור ההדמיה טומוגרפיה (DLIT) יכולה לשמש כדי לקמפל שחזור 3D כמותית של BL מקור 12. DLIT מבוצע על ידי איסוף תמונות שצולמו באמצעות מסנני BL להקה עוברות אופטיים צרים ומוגדריםלאחר מכן מזין אותם לתוך 3D אלגוריתם שיקום טומוגרפיה אופטי מפוזר 1,7,12,13. נכון לעכשיו, הדמיה רבת שיטה היא השיטה היחידה העומדת למקבלת לוקליזציה האנטומי לא פולשנית אמיתית של bioluminescent מוקדי in vivo ללא צורך בניתוח vivo לשעבר. לאחרונה, השתמשנו בשילוב של DLIT שיתוף רשום עם μCT הדמיה כדי להעריך Citrobacter rodentium (ג rodentium) דינמיקת קולוניזציה בעקבות טיפול מניעתי עם חיידק הפרוביוטי 7. ג rodentium הוא פתוגן enteric ספציפי עכברי משמש להדבקת בני אדם עם מודל enteropathogenic וenterhemorrhagic חיידקי Escherichia 14. ג זיהום rodentium גורם דלקת המעי הגס, קשורות בדרך כלל עם הפסד מתון במשקל, שלשולים, תגובה חיסונית מקוטבת Th1 ושינויים פתולוגיים שונים, כוללים היפרפלזיה קריפטה הגס והצמדה והתבטלות הנגע formatiב -14. בנוסף לכך, ג פתוגנזה rodentium נחקרה ביסודיות באמצעות BLI ואת הדינמיקה שלה קולוניזציה בעכברי C57BL/6J מתועדת היטב, מה שהופך את החיידק זה מיקרואורגניזם מודל אידיאלי לשימוש עם רב שיטת הדמיה 3,4,7. פרוטוקול זה הוא ראשון שמתאר מתודולוגיה להדמית DLIT-μCT המשולבת של זיהום חיידקים באמצעות פלטפורמה אחת multimodality הדמיה, IVIS ספקטרום ה-CT, והדור של סרט 4D מראה את הדינמיקה האמיתית של זיהום זה הלא פולשני.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescent C. rodentium</td>
			<td>Frankel lab</td>
			<td>ICC180</td>
			<td>Wiles et al., 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td>Boots</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (100% v/v)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Oxygen</td>
			<td>BOC Medical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td>25 g in 1L Demineralised water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10283.0500</td>
			<td>37 g in 1L Demineralised water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Sigma (Fluka)</td>
			<td>60615</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Falcon tubes</td>
			<td>BD (Falcon)</td>
			<td>352070</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universals</td>
			<td>Corning (Gosselin)</td>
			<td>E5633-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD (Plastipak)</td>
			<td>300013</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved</td>
			<td>Vet Tech</td>
			<td>DE005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbanks (Cryovial)</td>
			<td>Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td>PL.170/Y</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum CT</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>133577 Rev A/ Spectrum CT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6kVA UPS</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 anesthesia system</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>118918</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anaesthesia filter charcoal</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>118999/00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image v4.3.1 SP1</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 44</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d multimodality imaging of citrobacter rodentium infections in mice

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לפקח על זיהום חיידקי bioluminescent באמצעות טומוגרפיה מרוכבים 3D המפוזרת אור הדמיה עם μCT המשולב (DLIT-μCT) ולאחר מכן של שימוש בנתונים אלה כדי ליצור ארבעה סרט (4D) ממדי של מחזור זיהום longitudinally. כדי לפתח את סרטי 4D זיהום וכדי לאמת את ההדמיה DLIT-μCT ללימודי זיהום חיידקים באמצעות IVIS ספקטרום CT, השתמשנו בזיהום עם bioluminescent ג rodentium, הגורם לדלקת המעי הגס הגבלה עצמית בעכברים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הזיהום של עכברים עם bioluminescent ג rodentium וניטור בלתי פולשני של התישבות על ידי הדמיה DLIT-μCT יומית וספירת חיידקים מצואה במשך 8 ימים. השימוש בספקטרום IVIS CT ​​מאפשר שיתוף רישום חלק של סריקות אופטיות וμCT באמצעות פלטפורמת הדמיה בודדת. שיטת μCT המינון הנמוכה מאפשרת הדמיה של עכבריםבמספר רב של נקודות זמן במהלך זיהום, מתן לוקליזציה האנטומי מפורטת של מוקדי חיידקי bioluminescent ב3D מבלי לגרום לחפצים מהקרינה המצטברת. חשוב מכך, את סרטי 4D של עכברים נגועים לספק כלי אנליטי חזק כדי לפקח על דינמיקת קולוניזציה חיידקית in vivo.

זיהום של עכברי C57BL/6J עם 5 X 10 9 CFU ג rodentium הוא מודל זיהום חיידקים מתואר היטב ותוצאות בזיהום במערכת העיכול הגבלה עצמית שיאים בין ימי הודעה זיהום 6-8 ונמשך בין 3 עד 4 שבועות 2,14. הזיהום מוגבל ללומן מעי על ידי מערכת החיסון העכברית וכתוצאה מכך, חיידקים הם לשפוך ללא הרף בצואה. קולוניזציה של עכברים על ידי ג ניתן לנטר rodentium הלא פולשני על ידי ספירת חיידקים ישירה מצואה, או הדמיה פליטת אור 2,3. כתב יד זה מתאר פרוטוקול מותאם לביצוע 3D ו 4D multimodality הדמיה של ג rodentium בתוך עכברים כדי לפקח על עומס חיידקים ולוקליזציה בזיהום. התוצאות המוצגות באיור 1 מדגימות את הבקרות הנדרשות להדמית 4D מוצלחת. לפני הזיהום של עכברים זה חיוני כדי להרתיעשלי שהבידוד הוא החיידקים המשמשים bioluminescent (איור 1 א) וכי בעקבות gavage האוראלי של עכבר עם bioluminescent ג rodentium, כי האות ניתן לצפות בקיבתו של בעל החיים ולא לריאות (איור 1) 16. בנוסף לניטור קולוניזציה חיידקים באמצעות הדמיה פליטת אור, זה תרגול טוב כדי לכמת מספרי חיידקים בצואה; המשמש כמדידה עקיפה של קולוניזציה חיידקית של רירית מערכת העיכול איור 2 מדגים את עומס החיידקים הטיפוסי בצואה שנלקח מ8 C57BL6 / ג&#39;יי. עכברים שנדבקו ~ 5 X 10 9 CFU ICC180 ומעקב במשך 8 ימי עליות התישבות לצרכן מיום 2 לצרכן עד יום שבו 6-7 פסגות הזיהום ב~ 5 X 10 10 CFU / g, אשר עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים 2,3,17. כדי להדגיש את החשיבות של מסגרת הערכהטינג התפשטות הזיהום בעכבר אחת, האיורים 1B ו -3, כמו גם וידאו 1 כבר נוצרת מאותו העכבר בעקבות ג זיהום rodentium, כפי שתואר לעיל. דיילי DLIT-μCT שימש כדי להעריך את ההתפלגות המרחבית של חיידקי bioluminescent בתוך העכבר הזה, תוך שימוש בשלד כהתייחסות אנטומי. איור 3 מדגים את שיקום DLIT-μCT של עכבר C57BL/6J נגוע ICC180 ב3 PI נקודות מפתח בזמן ניתן לראות 3 PI קטן bioluminescent מוקדי יום במעי הגס, אשר יציגו גידול מתון בעוצמת פליטת אור על ידי 5 PI היום עם שינוי קטן בהתפלגות המרחבית. ביום 7 PI אנו נצפו עלייה משמעותית בפליטת אור והתפשטות bioluminescent מוקדים על פני המעי הגס כולו. וידאו 1 הוא אוסף של שחזורי DLIT-μCT 3D מימים 1-8 פיי ICC180 וממחיש גrodentium בתוך מערכת העיכול הפרוקסימלית בין 1-2 ימים PI אשר מתפשטת למעי הגס ביום 3 PI מימים 4-6 PI מספרי החיידקים במעי הגס להרחיב עד לשיא ב 7 יום שבו צרכן מוקדי החיידקים מכסה את כל המעי הגס. ביום 8 PI רק שני מוקדי חיידקים שונים שנמצאים במעי הגס הפרוקסימלי ודיסטלי. היכולת להציג שחזור 3D המלא בכל נקודת זמן על פי סדר כרונולוגי מייצגת כלי רב עוצמה לניתוח אינטראקציות פתוגן המארחת וקלה יותר לפרש מאשר 3D עדיין באותו בסיס הנתונים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig1.jpg" /> איור 1. הדמיה פליטת אור של 2D) Bioluminescent ג rodentium ICC180 הבידוד ו-B) בעקבות עכבר gavage האוראלי עם 200 μl של הבידוד. ראש חץ (&gt;) ממחיש bioluminescent ג rodentium </<html> em&gt; בבטן. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig2.jpg" /> איור 2. ג דינמיקת קולוניזציה rodentium. כימות של ג המושבה rodentium להרכיב יחידות מצואה במשך 8 ימים PI <img alt="איור 3" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3.jpg" /> איור 3. טומוגרפיה-μCT הדמיה אור מפוזרת סריקה של bioluminescent ג זיהום rodentium מעכבר אחד במעקב ביום 3, 5 ו -7 PI ראש חץ (&gt;) ממחיש קולוניזציה הגס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/50450fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> וידאו 1.&quot;Target =&quot; p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בוידאו. סרט 4D של זיהום rodentium ג מעכבר אחד מימי מעקב 1-8 PI

Watch this Scientific Journal Video about 4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice at JoVE.com

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

הדמיה רבת שיטה היא גישה יקרת ערך לחקר התישבות חיידקים במודלים של בעלי חיים קטנים. פרוטוקול זה מתאר זיהום של עכברים עם bioluminescent<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; והניטור האורך של התישבות חיידקים באמצעות טומוגרפיה ההדמיה האור המפוזרת 3D המורכבת עם μCT הדמיה כדי ליצור סרט 4D של<em&gt; ג rodentium</em&gt; זיהום.

הדמיה של multimodality 4D<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; זיהומים בעכברים

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

4d-multimodality-imaging-of-citrobacter-rodentium-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

12.9K Views.  Imperial College London. הדמיה רבת שיטה היא גישה יקרת ערך לחקר התישבות חיידקים במודלים של בעלי חיים קטנים. פרוטוקול זה מתאר זיהום של עכברים עם bioluminescent Citrobacter rodentium והניטור האורך של התישבות חיידקים באמצעות טומוגרפיה ההדמיה האור המפוזרת 3D המורכבת עם μCT הדמיה כדי ליצור סרט 4D של ...

Video: 4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; דגם עכבר: תרומות הפתוגן ומארח לומדים קוליטיס המדבק

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

שלית Decidual אדם תרבויות איברים ללמוד זיהומים בבית הממשק האם והעובר

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to the frequent failure of traditional antibiotic treatments. Alternative therapeutics are urgently needed to tackle MDR bacteria.
An innovative non-antibiotic approach, antimicrobial blue light (aBL), has shown promising effectiveness against MDR infections. The mechanism of action of aBL is not yet well understood. It is commonly hypothesized that naturally occurring endogenous photosensitizing chromophores in bacteria (e.g., iron-free porphyrins, flavins, etc.) are excited by aBL, which in turn produces cytotoxic reactive oxygen species (ROS) through a photochemical process.
Unlike another light-based antimicrobial approach, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), aBL therapy does not require the involvement of an exogenous photosensitizer. All it needs to take effect is the irradiation of blue light; therefore, it is simple and inexpensive. The aBL receptors are the endogenous cellular photosensitizers in bacteria, rather than the DNA. Thus, aBL is believed to be much less genotoxic to host cells than ultraviolet-C (UVC) irradiation, which directly causes DNA damage in host cells.
In this paper, we present a protocol to assess the effectiveness of aBL therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in a mouse model of burn injury. By using an engineered bioluminescent strain, we were able to noninvasively monitor the extent of infection in real time in living animals. This technique is also an effective tool for monitoring the spatial distribution of infections in animals.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

In vivo חקירת טיפול באור כחול אנטימיקרוביים multidrug עמידים baumannii Acinetobacter צרוב דלקות באמצעות הדמיה פליטת אור

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

הדמיה Ca2 + תגובות במהלך זיהום שיגלה תאי אפיתל

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

הדמיה קונאפוקלית של זוגיות גדילי RNA ודפוס זיהוי רצפטורים להדבקת וירוס RNA שלילי-סנס

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...