פרופיל SEC הוא דרך רבת עוצמה לנתח את איכות החלבון. המטרה היא לאסוף פרופיל SEC עבור חלבון ממברנה באמצעות פלואורסצנטיות, אשר יכול להשפיע על איכות הדגימה. FSEC משתמש בכמויות קטנות של דגימה וניתן לבצע אותו לטיהור, הוא פשוט יחסית, וניתן לבצע אותו על ציוד הזמין במעבדות רבות.
מי שידגים את ההליך יהיה ג'ק רייט, מדען חלבונים בכיר מחברת Peak Proteins. התחילו בהכנת פלטות התאים על ידי הפשרת פלטת התאים המאוחסנת במינוס 80 מעלות צלזיוס בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, או עד שהדגימה כבר לא קפואה. העבר את הדגימה מיד לקרח.
כדי להשהות מחדש ולהמיס את הדגימה, הוסף שני מיליליטר של מאגר המסיסות ללוח התא. יש לדגור עם היפוך מקצה לקצה בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 עד 30 דקות. לאחר מכן הוסיפו חומר ניקוי מעורבב מראש כדי לקבל ריכוז סופי של 1%דודציל מלטוזיד, או DDM, ו-0.1% כולסטרול המיסוקצינאט, או CHS.
יש להמיס במשך 30 דקות עם היפוך מקצה לקצה בארבע מעלות צלזיוס. כדי לבצע שלב צנטריפוגה במהירות נמוכה, צנטריפוגה את הדגימה בצנטריפוגה על ספסל באמצעות דלי מתנודד החוצה וצנטריפוגה ב 2000 גרם במשך 15 דקות. לאחר מכן בצע צנטריפוגה במהירות גבוהה על ידי העברת הסופרנאטנט מהצנטריפוגה במהירות נמוכה לצינורות אולטרה צנטריפוגה באמצעות מחט קהה המחוברת למזרק חמישה מיליליטר.
הקפידו לא להפריע לפלטת הצבעים. לאחר איזון זוגות הצינורות, מניחים אותם ברוטור אולטרה-צנטריפוגה בזווית קבועה וצנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב 250, 000 גרם. הכן את הכרומטוגרפיה הנוזלית החלבונית המהירה, או מערכת FPLC על ידי מילוי המערכת בכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל, או חיץ SEC, וטיהור משאבות האוויר.
חבר את עמודת ה-SEC ל-FPLC, וודא שאף אוויר לא נכנס לעמודה. יש לאזן מראש את עמודת ה-SEC על ידי שטיפתה בנפחי עמודות של פי 1.5 של מים מזוקקים ומסוננים ברמת מעבדה, ולאחר מכן נפחי עמודות של פי 1.5 של חיץ SEC בקצב הזרימה והלחץ המומלצים עבור העמודה. כדי להריץ את ניסוי ה-SEC, העבירו את הסופרנאטנט משלב הצנטריפוגה במהירות גבוהה למזרק של מיליליטר באמצעות מחט קהה המחוברת למזרק.
הגדר את לולאת הדגימה להיטען. מלא לולאת דגימה של 500 מיקרוליטר על ידי הזרקת 600 עד 700 מיקרוליטר של הדגימה מהמזרק ליציאת הטעינה. לאחר מכן, הזריקו את הדגימה מהלולאה לתוך העמודה על ידי ריקונה עם ארבעה מיליליטר של חיץ SEC בקצב הזרימה והלחץ המומלצים.
הפעל את העמודה באותו קצב זרימה עד למעבר של פי 1.5 מנפח המאגר, והתחל לאסוף 90 שברים של 0.2 מיליליטר לאחר מעבר של פי 0.25 מנפח העמודה. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר 90 מיקרוליטר של מים מזוקקים באיכות מעבדה ממאגר לכל באר של צלחת אטומה, שטוחה, 96 בארות. לאחר מכן מעבירים את 10 המיקרוליטרים של הדגימות מצלחת 96 בארות לצלחת האטומה, בעלת התחתית השטוחה, 96 בארות, ומניחים את צלחת הבאר בקורא צלחות.
עבור GFP המסומן פלואורסצנטי, et את העירור קרוב ככל האפשר ל 488 ננומטר ולזהות את הפליטה הפלואורסצנטית קרוב ככל האפשר ל 507 ננומטר לפני מדידת האות. חקירת הטווח הדינמי והגבולות התחתונים של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר, או זיהוי EGFP עבור קורא הלוחות, הצביעה על כך שלקורא הלוחות היה גבול זיהוי נמוך יותר של 30 ננוגרם וטווח דינמי של עד 500 ננוגרם חלבון המסומן בתווית EGFP לכל באר לפני רוויית האותות. המרת נפחי האלוטיון לקו והתאמתם כנגד משקלים מולקולריים של לוג אפשרה להעריך את המשקל המולקולרי של הקולטנים המצמדים לחלבון G על ידי אינטרפולציה של העקומה הסטנדרטית.
תנאי מיצוי הממברנה האופטימליים נחקרו על ידי בדיקת DDM ולאוריל מלטוז נאופנטיל גליקול כנגד מיצוי ללא חומרי ניקוי עם קופולימר חומצה זכרית סטירן. ההשפעה של הוספת ליגנד על פרופיל הכרומטוגרפיה של גודל הפלואורסצנטי נחקרה על ידי הוספת ספינגוזין-1-פוספט, או S1P, לדגימה במהלך מסיסות. הדגימה המסיסה, בנוכחות S1P, הראתה עקבות עדיפים עם צבירה מופחתת.
חקירת היציבות ארוכת הטווח של קולטן סרוטונין 5HT2AR בתנאים שונים הצביעה על כך שהחלבון בחלקיקי השומנים של חומצה זכרית סטירן נשאר יציב למשך זמן רב יותר, אפילו בטמפרטורות שליליות. הזמן בין נקודת המסיסות לבין העברת המדגם בטור ה-SEC הוא קריטי לזמן. אסור שיהיו הפסקות, ויש לשמור על הדגימה קרה.
לאחר FSEC, תושג הבנה של המבנה, חומר הניקוי או החיץ הטובים ביותר. זה מאפשר אופטימיזציה של טיהור חלבונים ותומך באפיון ביופיזי ומבני במורד הזרם.
