1. לפני התהליך, להכין ולאסוף את הפריטים הבאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נא עיין התמונה באיור 1 א) ו - 1b) לבניית פלטפורמה מעץ לרסן את העכבר במהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול לערבב עבור בלוטות הלימפה - HBSS + 1.25mg/ml collagenase TypeIV או 2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​collagenase D </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב עיכול עבור ריאות - HBSS + 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​collagenase </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל חרוזים לטקס (01:20) ב-PBS להזרקה intraperitoneal לדמיין את LDLNs </li></ol> הערה: LDLNs קטנים קשה למצוא. כדי ללמוד כיצד למצוא אותם, להזריק 200μl של 1:20 בדילול אדום חרוזי ניאון לטקס ה-IP לתוך העכבר. הצפק מנקז אלה LDLNs 8. 24 HPI, לחשוף את חלל בית החזה של העכבר כמתואר לעיל. LDLNs יהיה נראה ורוד מן החרוזים כי אזל חלל הצפק. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא דם אדום (RBC) הצפת תמוגה - 0.15M NH 4 Cl, 10mm KHCO 3, 0.1 mM Na 2 EDTA ב 1L DH 2 0. התאם את ה-pH 7.2-7.4 ולאחסן בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא 70μm או 100μm מסננת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במלאי פתרון של EDTA 0.5m, pH = 8.0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS ללא CaCl 2 ו - MgCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים ובוטה, הסתיים מלקחיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראי גרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Gavage (22 מד) מחט כפופות בזווית (איור 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוח קלקר וסיכות להפצת העכבר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחבת למעלה מאזן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנילין פתרון כחול - 10mg/ml ב H 2 O </li></ol> הערה: אנחנו נהיה באמצעות פתרון זה עבור הפגנה של טכניקה אותה זריקה. 2. הכנה וניהול של העכבר הרדמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת של Xylazine ו קטמין ב PBS סטרילי כך ריכוזי הסופי 2mg/ml ו 10mg/ml בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את העכבר על האיזון מחבת בראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את המינון הדרוש עכבר אחד. מנה ב Xylazine (2-4 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו קטמין (70-80 מ&quot;ג / ק&quot;ג) משקל הגוף באמצעות נפח מתאים של התערובת מוכן להזריק intaperitoneally. כל זן העכבר עשוי לדרוש אופטימיזציה של הרדמה. עכברים שקיבלו יותר מדי חומר הרדמה עלולה להיות קצב הנשימה מופחתת שעלולה להיות קטלנית לאחר inoculum הוא החדירו לתוך הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3-5 דקות, לצפות את העכבר על ההשפעות של ההרדמה. בדוק את הסימנים הבאים כדי לוודא העכבר נמצא בהרדמה מלאה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצב הנשימה צריך להאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר לא צריך למתוח את היד שלה, כאשר הרים בצוואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לא צריך להיות שום תגובה כאשר הגפיים האחוריות הן מגורה. אם הקריטריונים האלה אינם מתקיימים, לחכות כמה דקות ובדוק שוב לפני שתמשיך לשלב הבא. </li></ol></li></ol> 3. Intratracheal הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את innoculum ב 50μl מלוחים. ממלאים מזרק 1ml מצויד במחט סטרילית gavage כפוף עם innoculum. המזרק צריך להיות טעון עם כיס אוויר 100μl מאחורי innoculum כדי לוודא שכל הנוזל הוא החדירו לתוך הריאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על משטח העץ בזווית תלוי על החותכות שלו על החוט בעדינות לרסן אותו במקום עם חתיכת סרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ראי גרון עם יד שמאל (אם אתם ימניים) לתפוס זוג מלקחיים הסתיים בוטה. השתמש קצה ראי גרון ואת מלקחיים כדי לחטט בעדינות לפתוח את הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים, להוציא את הלשון החוצה להחזיק אותו בצד. מדריך להב ראי גרון לעבר הצד האחורי של הפה. שמור את ראי גרון לחצה מטה בעדינות בזווית של 90 מעלות עד שתראה את הפתיחה של קנה הנשימה. החזק את ראי גרון במקום. יש להקפיד כאשר מושכים את הלשון מן הפה ואת זה צריך להיעשות בעדינות כדי לא פוגע ברקמת מתרחשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם היד השנייה, לקחת את המזרק 1ml המכיל את innoculum, מצויד המחט gavage כפוף עם יד ימין שלך להכניס את המחט לתוך קנה הנשימה עד לכופף את המחט היא על ידי החותכות הקדמיות. דחוף את הבוכנה שווה להעביר את innoculum. Innoculum צריך לא בועה. משוך את המחט מתוך קנה הנשימה בהקדם האפשרי. עכברים לא להיחנק ולמות אם קנה הנשימה חסום במשך זמן רב מדי. החזק את העכבר זקוף לכמה שניות כדי לאפשר innoculum להיות בשאיפה לריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את העכבר מתוך פלטפורמת ולמקם אותו ליד מנורת חימום. אל תשאיר עכברים תחת חום ישיר לפרקי זמן ממושכים. העכבר צריך להיות ער לחלוטין בתוך 30 דקות לאחר ההליך (זמן ההחלמה עשוי להשתנות בהתאם זנים). עכברים יש לשים לב בחריצות בזמן הזה אסור לקבל חם מדי או קר מדי, זה יכול גם לשים את העכברים לתוך מצוקה נשימתית המובילה למוות. </li></ol> 4. קציר ועיבוד ניקוז בלוטות לימפה ריאות והריאות עבור cytometry זרימה<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן עכברים בשיטה הרצויה לפי הנחיות האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית המתת חסד. זה עשוי להשתנות בהתאם לתוצאות הבציר בודדים. מינהל קטלני עושה של נתרן pentobarbital הוא דוגמה הליך המתת חסד המתאים. לא ראינו השפעות שליליות ריאתי של המתת חסד על ידי ה-CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את הידיים והרגליים על לוח לנתיחה. עושים חתך לאורך אמצע בצד הגחון במספריים. משוך בעדינות את העור ולחשוף את שרירי קיר בית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא חתכים דרך שרירי קיר בית החזה כדי לחשוף את אברי הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את קצה עצם החזה עם מלקחיים לנקב את הסרעפת. חותכים את הסרעפת בצדי כלוב הצלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מספריים במקביל פני הלוח לנתיחה, חתך דרך חלל החזה לאורך קו dorso-הגחון משני הצדדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעט להרים את החזה למעלה. בצד ימין של הלב, ממש מתחת התימוס, לחפש שני בלוטות הלימפה. הצומת לימפה מעט גדול השלישי נמצא מתחת כלי דם קטנים עורקי העובר בניצב לקנה הנשימה. בלוטות הלימפה קציר לתוך 1 מ&quot;ל של תערובת הלימפה העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קצירת בלוטות הלימפה, החזק את הלב עם זוג מלקחיים לתפוס את הריאות עם אחר. קציר לתוך הריאות 3ml קרח קר PBS בצלחת 6 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את האונות של הריאות, לשאוב PBS וקוצצים האונות לחתיכות קטנות בעזרת מלקחיים ומספריים. הוסף 3ml של תמהיל לעיכול עבור הריאות. שמור את צלחת 6-היטב על הקרח במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בלוטות הלימפה עבור 25-30 דקות והריאות למשך 30 דקות ב 37 ° C. הוסף EDTA לריכוז סופי של 10mm לכל אחד תערובות העיכול כדי לעצור את התגובה ומניחים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 3ml, להעביר פיסות של הריאות באמצעות מחט 18GA 3 פעמים. מועכים את חתיכות של הריאות ואת LNs באמצעות 70-100μm strainers התא בעזרת הקצה האחורי של הבוכנה מזרק 1ml. שטפו את strainers תא עם 10 מ&quot;ל של HBSS ללא Ca 2 + ו - Mg 2 +. צנטריפוגה XG ב 500 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 5 מ&quot;ל של חיץ תמוגה RBC ו דגירה 3 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 10 מ&quot;ל של HBSS ללא Ca 2 + ו - Mg 2 + להרוות תמוגה. צנטריפוגה XG ב 500 דקות 5. תביא את הריאות השעיות LDLN תא בודד כדי 10 מ&quot;ל ו 5 מ&quot;ל בהתאמה. ספירת תאים חיים באמצעות hemacytometer על ידי הרחקה trypan כחול. תאים מוכנים כעת כתם עבור cytometry הזרימה. 1 אונה של הריאה יכול להיות מספיק עבור cytometry הזרימה. האונות אחרים יכולים לשמש שאלות ניסיוניות אחרים בתוך העכבר באותו כגון homogenates עבור ציטוקינים או רקמה היסטולוגיה. </li></ol> 5. נציג תוצאות: LDCs ומקרופגים מכתשיים בריאות לרכוש אנטיגן מן החללים מכתשיים של הריאות מיד לאחר אותה זריקה. איור 3 מראה אחוז CD11c + (ביטא על LDCs ומקרופגים מכתשיים) בתאים חיוביים נבגים anthracis Bacillus שכותרתו fluorescently, שלאחר 30 דקות זה הזרקה. בשלב זה, ~ 15.9% של CD45 + + CD11c תאים ההשעיה תא בודד ריאות טיפח anthracis Bacillus נבגים (איור 3, לוחות נמוך יותר). לאפיון נוסף של תאים CD11c + בריאות, עיין קים Braciale 4. חרוזים שכותרתו fluorescently משמשים באופן שגרתי כדי להעריך את הסחר של אנטיגנים חלקיקים כדי LDLNs 9. כדי להעריך את התחבורה מהריאות אל LDLNs, פלורסנט חרוזים לטקס הוזרקו עם LPS ו LDLNs נותחו בבית HPI 24. כ -4% של תאים CD11c היי ב LDLNs טיפח חרוזי ניאון ב 24hpi (איור 4). ניסויים אלה מראים כי נציג בפרוטוקול זה ניתן להשתמש ביעילות כדי לעקוב אחר תאים לרכוש אנטיגנים חלקיקים בשאיפה לריאות, ולאחר מכן תנועה אותם LDLNs. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. פלטפורמה מעץ עבור הרחקה עכברים במהלך ההזרקה זה. בלוק עץ נחתך בזווית מוטות מתכת הותאמו, מול נוף דמות 1a) ולהציג את הצד 1b דמות). פיסה קטנה של חוט נכרך סביב הבר מתכת לעגן את החותכות מול העכבר. חתיכה של סרט צורפה פלטפורמת לקשור סביב העכבר כדי לשמור אותו במקום במהלך ההליך. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. מחט להזרקה Gavage זה. Gavage מחט (מימין) היתה כפופה בזווית של ~ 135 ° (משמאל) להזרקה זה. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. אחוז של כל התאים + CD11c של הריאות כי הנמל הוא הזריק GFP להביע anthracis Bacillus (סטרן-p6GFP), אתגר הודעה 5hrs. עכברים AJ היו אתגר עם 1x10 8 GFP-Bacillus anthracis הנבגים והריאות נותחו על זיהום הודעה 5hrs. מגרשים נקודה להראות אחוז CD11c + לתאי ריאה, כי הם חיוביים anthracis Bacillus. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. זיהוי של חרוזים פלורסנט (צהוב / ירוק) בריאה ניקוז בלוטות הלימפה 24 שעות לאחר ההזרקה אני לא.. עכברים AJ ניתנו גם PBS (הפאנל השמאלי) או 5x10 9 Fluoresbrite microspheres י.ג. (0.5μm) עם 10μg LPS (פאנל מימין) זה LDLNs נותחו 24hpi. נציג מגרשים נקודה להראות אחוז התאים CD11c היי ב LDLNs כי חרוזים הנמל פלורסנט זממו נגד ערוץ ריקה.

<ol>
	<li>Grayson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+lung+dendritic+cell+maturation+and+migration+during+respiratory+viral+infection.">Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection.</a> J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).</li><li>GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+between+dendritic+cell+subsets+of+the+lung.">Division of labor between dendritic cell subsets of the lung.</a> Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).</li><li>Bar-Haim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelationship+between+dendritic+cell+trafficking+and+Francisella+tularensis+dissemination+following+airway+infection.">Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection.</a> PLoS Pathog. 4, e1000211-e1000211 (2008).</li><li>Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+dendritic+cell+subsets+differ+in+their+capacity+to+support+the+induction+of+virus-specific+cytotoxic+CD8++T+cell+responses.">Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses.</a> PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).</li><li>Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-dendritic+cell+interaction+dynamics+during+the+induction+of+respiratory+tolerance+and+immunity.">T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity.</a> J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).</li><li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+pathology+and+efficacy+of+vaccination+in+a+murine+model+of+inhalational+anthrax.">Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax.</a> J Med Microbiol. , (2010).</li><li>Kiyono, H., Fukuyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALT-+versus+Peyer's-patch-mediated+mucosal+immunity.">NALT- versus Peyer's-patch-mediated mucosal immunity.</a> Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).</li><li>Parungo, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+drainage+of+the+peritoneal+space:+a+pattern+dependent+on+bowel+lymphatics.">Lymphatic drainage of the peritoneal space: a pattern dependent on bowel lymphatics.</a> Ann Surg Oncol. 14, 286-286 (2007).</li><li>Jakubzick, C., Helft, J., Kaplan, T. J., Randolph, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+methods+to+study+pulmonary+dendritic+cell+migration+reveals+distinct+capacities+of+DC+subsets+to+acquire+soluble+versus+particulate+antigen.">Optimization of methods to study pulmonary dendritic cell migration reveals distinct capacities of DC subsets to acquire soluble versus particulate antigen.</a> J Immunol Methods. 337, 121-121 (2008).</li><li>Higgins, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+levels+of+M-CSF+and+GM-CSF+influence+the+specific+generation+of+macrophage+populations+during+infection+with+Mycobacterium+tuberculosis.">Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection with Mycobacterium tuberculosis.</a> J Immunol. 180, 4892-4892 (2008).</li><li>Kool, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alum+adjuvant+boosts+adaptive+immunity+by+inducing+uric+acid+and+activating+inflammatory+dendritic+cells.">Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells.</a> J Exp Med. 205, 869-869 (2008).</li><li>Costa, D. L., Lehmann, J. R., Harold, W. M., Drew, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transoral+tracheal+intubation+of+rodents+using+a+fiberoptic+laryngoscope.">Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope.</a> Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).</li><li>Takahashi, S., Patrick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+lymphatic+drainage+to+individual+thoracic+and+cervical+lymph+nodes+in+the+rat.">Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat.</a> Lab Anim. 21, 31-31 (1987).</li><li>Broeck, W. V. a. n. d. e. n., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

יש לנו שימוש בפרוטוקול זה ללמוד הסחר של נבגים anthracis Bacillus מהריאות אל LDLNs. עבור יישומים דומים, מספר חלקיקים נמסר לריאות יש לבחור בקפידה כך שהחומר המוזרק ניתן להבחין LDLNs על ידי cytometry הזרימה. יש לנו גם השתמשו בהצלחה בשיטה זו להעברת המאמצת של תאים וסימון של אוכלוסיות תא?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> תא 70μm stariner </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> אנילין כחול </td><td> דיג </td><td> A967-25 </td><td></td></tr><tr><td> האכלת בעלי חיים מחט </td><td> פופר ובניו בע&quot;מ </td><td> 7920 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> סיגמא </td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase TypeIV </td><td> וורטינגטון </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> רוש </td><td> 11088974103 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite microspheres י.ג. (0.5μm) </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 17152 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS ללא כלוריד סידן מגנזיום כלוריד </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> קטמין הידרוכלוריד (100mg/ml) </td><td> Hospira Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ראי גרון Blade </td><td> , Inc PennCentury </td><td> דגם LS-1 </td><td> עיין <a href="http://www.penncentury.com">www.penncentury.com</a> </td></tr><tr><td> ראי גרון קל סיבים אופטיים </td><td> WelchAllyn </td><td> 80814 </td><td></td></tr><tr><td> חרוזי ניאון אדום (0.5μm) </td><td> Invitrogen </td><td> F8812 </td><td> עבור זריקה ip </td></tr><tr><td> Xylazine (100mg/ml) </td><td> לויד מעבדות </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry

תאים Phagocytic כגון מקרופאגים מכתשיים ריאות תאים דנדריטים ו (LDCs) ברציפות מדגם אנטיגנים מן החללים מכתשיים בריאות. LDCs, בפרט, ידועים להגר ריאה בלוטות הלימפה לנקז (LDLNs) שבו הם מציגים אנטיגנים לתאי T בשאיפה ליזום תגובה חיסונית מתאימה למגוון immunogens 1,2. כדי אינטראקציות בין מודל הריאות אנטיגנים הנישאים באוויר בעכברים, אנטיגנים יכול להינתן intranasally 1,3,4, intratracheally 5 או 6 אירוסולים. משלוח על ידי תוואי זה כרוך מיומנויות טכניות שונות ואת המגבלות שצריכות להיחשב לפני תכנון ניסוי. לדוגמה, חשיפה intranasal ו aerosolized מספק אנטיגנים הן הריאות בדרכי הנשימה העליונות. לפיכך אנטיגנים יכולים לגשת רקמות האף הקשורים הלימפה (NALT) 7, פוטנציאל סיבוך הפרשנות של התוצאות. בנוסף, בליעה, התעטשות לבין קצב הנשימה של העכבר עשויה גם להוביל הסתירות במינונים נמסר. למרות מעורבות של דרכי הנשימה העליונות עלול להיות המועדפת עבור מחקרים, זה יכול לסבך ניסויים התמקדות באירועים יזם במיוחד בריאות. בהגדרה זו, את המסלול intratracheal (זה) עדיף כפי שהוא מספק חומרים מבחן ישירות לתוך הריאות עוקף את NALT. פרוטוקולים רבים זה כרוך הזרקה אינטובציה עיוור או של קנה הנשימה דרך חלל הפה או חשיפה כירורגית של קנה הנשימה כדי לגשת הריאות. בזאת, אנו מתארים פשוטה, עקבית, לא ניתוחי שיטת החדרה זה. פתיחת קנה הנשימה הוא מדמיין באמצעות ראי גרון ומחט gavage כפוף מוכנס אז ישירות לתוך קנה הנשימה כדי לספק את innoculum. אנחנו גם לתאר נהלים קציר ועיבוד LDLNs והריאות לניתוח סחר אנטיגן על ידי cytometry הזרימה.

Watch this Scientific Journal Video about Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry at JoVE.com

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

אנו מדגימים לא ניתוחי מסירה של חומרי הבדיקה לריאות של העכברים הרדים דרך קנה הנשימה. שיטה זו מאפשרת חשיפה הריאות לפתוגנים, ציטוקינים חיידקים ווירוסים, נוגדנים, חרוזים, כימיקלים, או צבעים. בנוסף, אנו מתארים קציר ועיבוד של הריאות ניקוז ריאה בלוטות לימפה (LDLNs) עבור cytometry הזרימה.

לא ניתוחי Intratracheal החדרה של עכברים עם ניתוח ריאות וניקוז ריאות בלוטות הלימפה על ידי זרימת cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

non-surgical-intratracheal-instillation-mice-with-analysis-lungs-lung

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

57.0K Views.  University of Colorado School of Medicine. אנו מדגימים לא ניתוחי מסירה של חומרי הבדיקה לריאות של העכברים הרדים דרך קנה הנשימה. שיטה זו מאפשרת חשיפה הריאות לפתוגנים, ציטוקינים חיידקים ווירוסים, נוגדנים, חרוזים, כימיקלים, או צבעים. בנוסף, אנו מתארים קציר ועיבוד של הריאות ניקוז ריאה בלוטות לימפה (LDLNs) עבור cytom...

Video: Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

חקר אינטראקציות של<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Assay CFSE המבוסס לחקר נדידת תאי דנדריטים עור Murine לתוך ניקוז בלוטות הלימפה במהלך זיהום<em&gt; Mycobacterium בוביס</em&gt; Bacille Calmette-גרן

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

This article provides detailed methodology to identify and quantify functional T lymphocyte subsets present within murine kidney, aorta and lymph nodes by intracellular staining and flow cytometry. The model of angiotensin II induced hypertension was chosen to explain, step-by-step, the procedures and fundamental principles of flow cytometry and intracellular staining.

תאיים מכתים cytometry זרימה לזהות לימפוציטים קבוצות משנה בתוך Murine אבי העורקים, כליות בלוטות לימפה מודל של יתר לחץ דם

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

איסוף ועיבוד של בלוטות הלימפה של חיות גדולות לניתוח RNA: הכנת ללימודי Transcriptomic הלימפה של מיני בעלי חיים גדולים

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

אפיון של קבוצות משנה מונוציט האנושית על ידי דם לזרום Cytometry ניתוח

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

A Model of Self-limited Acute Lung Injury by Unilateral Intra-bronchial Acid Instillation

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic findings similar to human acute respiratory distress syndrome (ARDS). The resulting alveolar edema, alveolar-capillary barrier damage, and leukocyte infiltration predominantly affect the left lung, preserving the right lung as an uninjured control and allowing animals to survive. This model of self-limited acute lung injury enables investigation of tissue resolution mechanisms, such as macrophage efferocytosis of apoptotic neutrophils and restitution of alveolar-capillary barrier integrity. This model has helped identify important roles for resolution agonists, including specialized pro-resolving mediators (SPMs), providing a foundation for the development of new therapeutic approaches for patients with ARDS.

Selective intra-bronchial acid instillation to the left lung in mice results in unilateral and self-limited acute lung injury that models human acute respiratory distress syndrome (ARDS) induced by gastric acid aspiration.

מודל של פגיעה עצמית מוגבלת בריאה חריפה על ידי ברונכיט חד צדדית של חומצה בסימפונות

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...