1. Antes del proceso, preparar y reunir los siguientes <ol><li> Por favor refiérase a la imagen de la Figura 1a) y 1b) para la construcción de una plataforma de madera para contener el ratón durante el procedimiento. </li><li> Digestión de la mezcla de los ganglios linfáticos - HBSS + 1.25mg/ml colagenasa TypeIV o 2,5 mg / ml de colagenasa D </li><li> Mezcla de digestión para los pulmones - HBSS + 1 mg / ml de colagenasa </li><li> Diluir las gotas de látex (1:20) en PBS durante la inyección intraperitoneal de visualizar el LDLNs </li></ol> Nota: LDLNs son pequeños y difíciles de encontrar. Para saber cómo se encuentran, se inyectan 200μl de las 1:20 diluido rojo bolas de látex fluorescentes ip en el ratón. El peritoneo desagües a estos LDLNs 8. 24 hpi, exponer la cavidad torácica del ratón como se describe anteriormente. El LDLNs se ve de color rosa de las cuentas que drena de la cavidad peritoneal. <ol start="5"><li> Glóbulos rojos (RBC) tampón de lisis - 0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA Na 2 en 1 litro dH 2 0. Ajustar el pH a 7,2-7,4 y almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Celular 70μm 100μm o colador </li><li> Solución madre de 0,5 M EDTA, pH = 8.0 </li><li> HBSS sin CaCl2 y MgCl2 </li><li> Tijeras y pinzas de extremos romos </li><li> Laringoscopio </li><li> Aguja de una sonda (calibre 22) se inclinó en un ángulo (Figura 2) </li><li> Espuma de poliestireno bordo y los pernos para la difusión del ratón </li><li> Balance bandeja superior </li><li> Anilina azul Solución - 10mg/ml en H 2 O </li></ol> Nota: Nosotros vamos a usar esta solución para la demostración de la técnica de inyección de la misma. 2. Preparación y administración de ratón anestesia <ol><li> Prepare una mezcla de xilazina y ketamina en PBS estéril a fin de que las concentraciones finales son 2mg/ml y 10mg/ml respectivamente. </li><li> Pesar el ratón sobre una balanza de platillos principales. </li><li> Calcular la dosis necesaria para cada ratón. Dosis a la xilazina (4.2 mg / kg) y ketamina (70-80 mg / kg) de peso corporal con un volumen adecuado de la mezcla preparada y se inyecta intaperitoneally. Cada cepa de ratón puede requerir la optimización de la anestesia. Los ratones que recibieron demasiada anestesia puede tener una tasa de respiración reducida que puede ser fatal después de la inoculación se inculca en los pulmones. </li><li> Después de 3-5 minutos, observe el ratón por los efectos de la anestesia. De verificación de los siguientes signos para confirmar que el ratón está completamente anestesiado: <ol><li> El ritmo respiratorio debe reducir la velocidad. </li><li> El ratón no se debe estirar su brazo al recogerlo por el cuello. </li><li> No debe haber ninguna respuesta cuando las extremidades posteriores son estimulados. Si estos criterios no se cumplen, espere unos minutos y vuelva a revisar antes de proceder al siguiente paso. </li></ol></li></ol> 3. Inyección intratraqueal <ol><li> Preparar el inóculo en solución salina 50μl. Llene una jeringa de 1 ml equipada con una aguja doblada sonda estéril con el inóculo. La jeringa debe estar cargado con una bolsa de aire 100μl detrás del inóculo para asegurar que todo el líquido se inculca en el pulmón. </li><li> Coloque el ratón sobre la plataforma inclinada de madera que cuelga de sus incisivos en el cable y frenar suavemente en su lugar con un pedazo de cinta. </li><li> Encienda el laringoscopio con la mano izquierda (si eres diestro) y tomar un par de fórceps romos terminado. Use la punta del laringoscopio y pinzas de la palanca suavemente a abrir la boca. </li><li> Con las pinzas, tire de la lengua y mantenerla a un lado. Guía de la hoja del laringoscopio hacia la parte posterior de la boca. Mantenga el laringoscopio presionado muy suavemente en un ángulo de 90 º hasta que vea la apertura de la tráquea. Sostenga el laringoscopio en su lugar. Se debe tener cuidado al tirar de la lengua de la boca y esto debe hacerse con cuidado para no daña el tejido se produce. </li><li> Con la otra mano, tome la jeringa de 1 ml que contiene el inóculo, equipado con la sonda de aguja doblada con las manos derecha e inserte la aguja en la tráquea hasta la curva de la aguja por los incisivos delanteros. Empuje el émbolo de manera uniforme para entregar el inóculo. El inóculo no debe tener burbujas. Retire la aguja de la tráquea, tan pronto como sea posible. Los ratones se asfixian y mueren, si se bloquea la tráquea por mucho tiempo. Mantenga el ratón vertical durante unos segundos para permitir inóculo que se inhala en los pulmones. </li><li> Tome el mouse fuera de la plataforma y lo coloque cerca de una lámpara de calentamiento. No deje a los ratones con el calor por largos períodos de tiempo. El ratón debe estar completamente despierto a los 30 minutos después del procedimiento (tiempo de recuperación puede variar en función de las cepas). Los ratones deben ser observados con diligencia durante este tiempo y no se debe permitir que se caliente demasiado o demasiado frío, esto también podría poner a los ratones en dificultad respiratoria que lleva a la muerte. </li></ol> 4. La recolección y el procesamiento de pulmón ganglios linfáticos de drenaje y los pulmones para citometría de flujo<ol><li> Sacrificio de ratones utilizando el método deseado según las directrices eutanasia AVMA. Esto puede variar dependiendo de los resultados de la cosecha individual. La administración de una letal de pentobarbital sódico no es un ejemplo de un procedimiento de eutanasia apropiado. No hemos visto los efectos negativos de la eutanasia pulmonar de CO 2. </li><li> Pin de los brazos y las piernas en una tabla de disección. Hacer una incisión a lo largo de la mitad de la cara ventral con unas tijeras. Tire suavemente la piel y exponer los músculos de la pared torácica. </li><li> Hacer incisiones a través de los músculos de la pared torácica para exponer los órganos abdominales. </li><li> Sostenga la punta del esternón, con las pinzas y perforar la membrana. Corte el diafragma a lo largo de los lados de la caja torácica. </li><li> Con las tijeras paralelas a la superficie de la placa de disección, corte a través de la cavidad torácica a lo largo de la línea dorso-ventral en ambos lados. </li><li> Levante ligeramente la caja torácica hacia arriba. En el lado derecho del corazón, justo debajo de la timo, busca dos ganglios linfáticos. Un nodo linfático tercero un poco más grande se encuentra debajo de un pequeño vaso sanguíneo arterial que corre perpendicular a la tráquea. Ganglios linfáticos de la cosecha en 1 ml de la mezcla de digestión de los ganglios linfáticos. </li><li> Después de la cosecha de los ganglios linfáticos, mantenga el corazón con un par de pinzas de agarre y los pulmones con el otro. Los pulmones de la cosecha en 3 ml de PBS enfriado con hielo en una placa de 6 pocillos. </li><li> Separar los lóbulos de los pulmones, aspirar el PBS y cortar los lóbulos en pequeños trozos con pinzas y tijeras. Añadir 3 ml de la mezcla de la digestión de los pulmones. Guarde la placa de 6 pocillos en el hielo durante esta etapa. </li><li> Incubar los ganglios linfáticos de 25-30 minutos y los pulmones durante 30 minutos a 37 ° C. Añadir EDTA a una concentración final de 10 mm a cada una de las mezclas de digestión para detener la reacción y el lugar en el hielo. </li><li> Con una jeringa de 3 ml, pasar pedazos de pulmones a través de una aguja 18GA 3 veces. Mash las piezas de los pulmones y la LN a través de filtros de células 70-100μm con la parte de atrás de un émbolo de la jeringa de 1 ml. Lavado de los filtros de células con 10 ml de HBSS sin Ca 2 + y Mg 2 +. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. </li><li> Resuspender el precipitado en 5 ml de tampón de lisis y se incuba durante 3 min a temperatura ambiente. Añadir 10 ml de HBSS sin Ca 2 + y Mg 2 + para saciar lisis. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Educar a los pulmones y las suspensiones de células individuales LDLN a 10 ml y 5 ml, respectivamente. Contador de células vivas usando un hemocitómetro por exclusión de azul tripan. Las células ya están listos para teñir de citometría de flujo. Un lóbulo del pulmón podría ser suficiente para citometría de flujo. Otros lóbulos se puede utilizar para otras preguntas experimentales en el ratón es el mismo, tales como los homogeneizados de citoquinas o de tejidos para histología. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Los países menos adelantados y los macrófagos alveolares de los pulmones adquieren antígeno de los espacios alveolares de los pulmones inmediatamente después de la inyección. La Figura 3 muestra el porcentaje de CD11c + (expresado en los países menos adelantados y los macrófagos alveolares), las células que son positivas para la etiqueta fluorescente esporas de Bacillus anthracis, 30 minutos después de que la inyección. En este momento, ~ 15,9% de CD45 + CD11c + células en la suspensión de pulmón de células individuales albergaba esporas de Bacillus anthracis (Figura 3, paneles inferiores). Para una mayor caracterización de células CD11c + en los pulmones, se refieren a Kim y Braciale 4. Cuentas de marcado con fluorescencia se utilizan habitualmente para evaluar el tráfico de los antígenos de partículas de LDLNs 9. Para evaluar este medio de transporte desde los pulmones hasta LDLNs, fluorescentes bolas de látex estaban inyectados con LPS y LDLNs fueron analizados a las 24 hpi. Cerca del 4% de células CD11c alta en el LDLNs albergaba perlas fluorescentes en 24hpi (Figura 4). Estos experimentos muestran que el representante de este protocolo puede ser utilizado eficientemente para rastrear las células que adquieren antígenos inhalados de partículas en los pulmones y posteriormente el tráfico a la LDLNs. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Plataforma de madera para sujetar a los ratones durante la inyección. Un bloque de madera fue cortada en un ángulo y barras de metal fueron ajustados, frente a ver la figura 1a) y 1b lado ver la figura). Un pequeño trozo de alambre se enrolla alrededor de la barra de metal para anclar la incisivos frente a la del ratón. Un pedazo de la cinta se sujeta a la plataforma para atar alrededor del ratón para mantenerla en su lugar durante el procedimiento. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Aguja por sonda nasogástrica para la inyección. Una aguja de sonda (derecha) fue doblado en un ángulo de ~ 135 ° (izquierda) para que la inyección. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Porcentaje de todas las células CD11c + en los pulmones que el puerto se inyecta expresando GFP Bacillus anthracis (Sterne-p6GFP), después del desafío 5h. AJ ratones fueron desafío con 1x10 8 esporas de Bacillus anthracis-GFP y los pulmones se analizaron después de la infección en 5h. Los gráficos de puntos muestra el porcentaje de CD11c + células de los pulmones que son positivas para Bacillus anthracis. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. La detección de perlas fluorescentes (amarillo / verde) en el pulmón ganglios linfáticos de drenaje 24 horas después de i. Inyección de t. AJ ratones se les administró PBS (izquierda) o 5x10 9 Fluoresbrite YG microesferas (0.5μm) con 10μg LPS (panel derecho) que se analizaron y LDLNs 24hpi. Representante de gráficos de puntos muestra el porcentaje de células CD11c alta en el LDLNs que las cuentas del puerto fluorescentes conspiraron contra un canal vacío.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+dendritic+cell+subsets+differ+in+their+capacity+to+support+the+induction+of+virus-specific+cytotoxic+CD8++T+cell+responses.">Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses.</a> PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).</li><li>Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-dendritic+cell+interaction+dynamics+during+the+induction+of+respiratory+tolerance+and+immunity.">T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity.</a> J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).</li><li>Thomas, R. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transoral+tracheal+intubation+of+rodents+using+a+fiberoptic+laryngoscope.">Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope.</a> Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).</li><li>Takahashi, S., Patrick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+lymphatic+drainage+to+individual+thoracic+and+cervical+lymph+nodes+in+the+rat.">Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat.</a> Lab Anim. 21, 31-31 (1987).</li><li>Broeck, W. V. a. n. d. e. n., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).</li></ol>

Hemos utilizado este protocolo para estudiar el tráfico de esporas de Bacillus anthracis de los pulmones a la LDLNs. Para aplicaciones similares, el número de partículas llega a los pulmones deben ser elegidos cuidadosamente para que el material inyectado puede ser detectado en el LDLNs por citometría de flujo. También se ha utilizado con éxito este método para la transferencia adoptiva de células y el etiquetado de poblaciones específicas de pulmón de células con anticuerpos marcados con fluorescenc...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Stariner celular 70μm </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anilina azul </td><td> Pescador </td><td> A967-25 </td><td></td></tr><tr><td> Aguja de alimentación de los animales </td><td> Popper y Sons Inc </td><td> 7920 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa </td><td> Sigma </td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa TypeIV </td><td> Worthington </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa D </td><td> Roche </td><td> 11088974103 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite YG microesferas (0.5μm) </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 17152 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> La ketamina HCl (100mg/ml) </td><td> Hospira Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hoja de laringoscopio </td><td> PennCentury, Inc </td><td> Para el modelo LS-1 </td><td> Se refieren a <a href="http://www.penncentury.com">www.penncentury.com</a> </td></tr><tr><td> Ligero de laringoscopio de fibra óptica </td><td> WelchAllyn </td><td> 80814 </td><td></td></tr><tr><td> Red bolas fluorescentes (0.5μm) </td><td> Invitrogen </td><td> F8812 </td><td> Para la inyección ip </td></tr><tr><td> Xilazina (100mg/ml) </td><td> Lloyd Laboratorios </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry

Fagocitos como los macrófagos alveolares y las células dendríticas del pulmón (PMA) de forma continua muestra los antígenos de los espacios alveolares de los pulmones. Los países menos adelantados, en particular, se sabe que migran a los ganglios linfáticos pulmonares drenan (LDLNs) donde presentan antígenos inhalados a las células T de iniciar una respuesta inmune apropiada a una variedad de inmunógenos 1,2. A las interacciones del modelo entre los pulmones y los antígenos en el aire en los ratones, los antígenos se puede administrar por vía intranasal 1,3,4, intratraqueal 5 o 6 en forma de aerosoles. La entrega por cada ruta incluye distintas habilidades técnicas y las limitaciones que deben tenerse en cuenta antes de diseñar un experimento. Por ejemplo, la exposición intranasal en aerosol y ofrece tanto a los antígenos de los pulmones y el tracto respiratorio superior. Por lo tanto, los antígenos pueden acceder a la nasal de tejido linfoide asociado (NALT) 7, lo que podría complicar la interpretación de los resultados. Además, la deglución, el estornudo y la tasa de respiración del ratón también puede dar lugar a incoherencias en las dosis administradas. Aunque el compromiso del tracto respiratorio superior puede ser preferible para algunos estudios, puede complicar los experimentos se centra en los eventos específicamente iniciado en los pulmones. En este contexto, la intratraqueal (IT) es preferible, ya que proporciona los materiales de prueba directamente en los pulmones y pasa por el NALT. Muchos protocolos de inyección incluyen la intubación o ciegos de la tráquea a través de la cavidad oral o la exposición quirúrgica de la tráquea para acceder a los pulmones. En este documento, se describe un simple y consistente, método no quirúrgico para la instilación. La apertura de la tráquea se visualizan mediante un laringoscopio y una aguja doblada sonda se inserta directamente en la tráquea para entregar el inóculo. También se describen los procedimientos para la recolección y procesamiento de LDLNs y los pulmones para el análisis del tráfico de antígeno por citometría de flujo.

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Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Nos ilustran no quirúrgico de entrega de materiales de prueba en los pulmones de ratones anestesiados a través de la tráquea. Este método permite la exposición del pulmón a los patógenos bacterianos y virales, las citocinas, los anticuerpos, los granos, productos químicos, ni colorantes. Nos describen con más detalle la recolección y procesamiento de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón (LDLNs) por citometría de flujo.

No quirúrgico instilación intratraqueal de ratones con el análisis de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón por citometría de flujo

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

El estudio de las interacciones de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Con neutrófilos mediante citometría de flujo y microscopía Tiempo Lapso

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Investigación

Inmunología e Infección

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Un ensayo basado en CFSE para estudiar la migración de la piel murina de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje durante la infección con<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacilo de Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

This article provides detailed methodology to identify and quantify functional T lymphocyte subsets present within murine kidney, aorta and lymph nodes by intracellular staining and flow cytometry. The model of angiotensin II induced hypertension was chosen to explain, step-by-step, the procedures and fundamental principles of flow cytometry and intracellular staining.

La tinción intracelular y citometría de flujo para identificar subconjuntos de linfocitos dentro de murino aorta, riñón y los ganglios linfáticos en un modelo de hipertensión

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

Determinación de subconjuntos de células T reguladoras en murino timo, pancreático drenaje del nodo de linfa y bazo mediante citometría de flujo

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparación de la médula ósea entera para el análisis de citometría de masa de células de linaje neutrófilo

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

A Model of Self-limited Acute Lung Injury by Unilateral Intra-bronchial Acid Instillation

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic findings similar to human acute respiratory distress syndrome (ARDS). The resulting alveolar edema, alveolar-capillary barrier damage, and leukocyte infiltration predominantly affect the left lung, preserving the right lung as an uninjured control and allowing animals to survive. This model of self-limited acute lung injury enables investigation of tissue resolution mechanisms, such as macrophage efferocytosis of apoptotic neutrophils and restitution of alveolar-capillary barrier integrity. This model has helped identify important roles for resolution agonists, including specialized pro-resolving mediators (SPMs), providing a foundation for the development of new therapeutic approaches for patients with ARDS.

Selective intra-bronchial acid instillation to the left lung in mice results in unilateral and self-limited acute lung injury that models human acute respiratory distress syndrome (ARDS) induced by gastric acid aspiration.

Un modelo de lesión pulmonar aguda autolimitada por la instilación unilateral de ácido intrabronal

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...