ברצוננו להודות אריקה טיילור עבור עריכת כתב היד הזה. עבודה זו מומן על ידי מענקים של מכוני הבריאות הלאומיים (P01 HL098053, P01 AG033561 ו- R01 HL054732) כדי R.B., תוספת מחקר פוסט דוקטורט (R01 HL085481), מלגת (AAUW) S.B.D., מענקים של איגוד הלב האמריקני S.B.D. ואני חוזר לבסיס

1. HFD האכלה פרוטוקול <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg" /> טבלה 1. מתכון אוכל לעוף. 
טבלה זו מסכמת החומרים השונים המשמשים להכנת לשליטתנו מזון. לאחר ביצוע, 10 מ של המזון הוא נשפך לתוך מבחנות, מקורר ומאוחסנים ב 4 ° C לאחסון לטווח ארוך-
<ol><li>HFD הכנה <ol><li>להכין 1 ק ג של מזון שמן גבוהה, שוקל 700 גר' מוכנות מראש אוכל לטוס רגיל (ראה טבלה 1) ו- 300 גרם שמן קוקוס לתוך שני מיכלים נפרדים באמצעות איזון האנליטי.</li>
		<li>חום לכל מכולה בנפרד במיקרוגל, עד התוכן נמס לחלוטין. שופכים שמן קוקוס לתוך המיכל אוכל לעוף. מערבבים בעזרת מקצף עד טוב לערבב את השמן לתוך האוכל לעוף. 
		הערה: אין גושים של מזון או שמן צריך להיות גלוי. כאשר האוכל לטוס נמס במיקרוגל, להפסיק במרווחים של 1 דקות לערבב את האוכל ולמנוע גולש.</li>
		<li>לשקול מחדש את האוכל שומן גבוהה. אם המשקל הכולל פחות מ 1 ק ג (700 גרם מזון + 300 גרם שמן קוקוס), להוסיף מים (כ- 10 מ"ל) כדי לפצות על אידוי בזמן חימום, כדי להחזיר את המשקל 1 ק</li>
		<li>Pour מעורבב היטב 10 מ"ל מזון שמן גבוהה לכל מבחנה (בסביבות 25% נפח המבחנה). בשלב הבא, לכסות עם גזה כדי למנוע זבובים &#39; זיהום. מגניב לשעה בטמפרטורת החדר ואז להעביר את הבקבוקונים עד 4 ° C עבור אחסון עד כדי 4 שבועות. 
		הערה: האוכל הרגיל (NF) משמש כמזון שליטה. גם למזוג 10 מ"ל (בסביבות 25% נפח המבחנה) של NF לכל מבחנה. על האוכל HFD להחליף 30% של האוכל NF שמן קוקוס. עבור פקד ותנאים ניסיוני, הזבובים קיבלו את אותה כמות של NF ו- HFD (10 מ"ל של מזון לכל מבחנה).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg" /> איור 1 . HFD האכלה דרוזופילה. 
ערכת מראה את השלבים האכלה שונים עבור זבובים על בקרת מזון (תזונה נורמלית ללא תוספת של שמן קוקוס-NF) או HFD (עם התוספת של שמן קוקוס). התהליך כולו לוקח 10 ימים אחרי האוסף הראשונית של הזבוב הבוגר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="2"> <li>HFD האכלה של melanogaster ד הערה: פרוטוקול זה כולל שליטה ואוכל HFD האכלה נהלים התואמים כל קו לעוף. שליטה וזבובים ניסיוני שמים בקבוקונים המכילים את אותו כמות האוכל (NF או HFD).
	<ol><li>שימוש CO 2 כדי עזים ומתנגד הזבובים. 
		הערה: עבור ינוקות, אנא קרא הפניה 21 למבט כולל על גידול וטיפול melanogaster ד.</li>
		<li>לאסוף 0-5 בנות יום זבובים בקבוקונים והעברה (על-ידי היפוך) הזבובים לתוך מבחנות החדש שמכילות את NF (חימם בעבר בטמפרטורת החדר). תן לעידן זבובים במשך 5 ימים נוספים-21 מעלות צלזיוס</li>
		<li>בסוף 5 הימים, להוציא את הבקבוקונים המכיל HFD NF מ- 4 מעלות צלזיוס 
		הערה: כמו זבובים חיים, מתח יכול הטמפרטורות הקרות. תן את הבקבוקונים לשבת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר להתחמם לפני השימוש.</li>
		<li>באמצעות מגבונים לחים, לנקות ולהסיר עודפי הנוזלים מן הצדדים של הבקבוקונים.</li>
		<li>הוסף פיסת נייר סינון, קטנה על 1 ס מ x 3 ס"מ, לתוך האוכל השמן גבוהה כדי לספוג את הנוזל העודף. 
		הערה: שלב זה הוא קריטי עבור מניעת הזבובים נדבקות האוכל HFD.</li>
		<li>הבא, העברת הזבובים על האוכל השמן גבוהה (על-ידי היפוך). להניח את הבקבוקונים אופקית בצד שלהם, (לא עומדת) ב 21-22 מעלות צלזיוס במשך 5 ימים. 
		הערה: להימנע טמפרטורות גבוהות יותר כמו זה באופן חלקי ממיסים האוכל השמן גבוהה, גורם הזבובים לדבוק המזון ולמות.</li>
		<li>לאחר 5 ימים, העברה (על-ידי היפוך) הזבובים מן NF ו- HFD לתוך בקבוקונים חדשים ללא מזון כדי לאפשר את המעיים שלהם ריק במשך 30 דקות. בשלב הבא, להמשיך שקילה הזבובים. 
		הערה: אחד הצעדים הקריטיים ב הזה HFD האכלה פרוטוקול היא להכין HFD מעורבב היטב, ללא כל נתחי אוכל לעוף או שמן מרוכז. ערבוב הומוגנית וקירור של HFD עד 45-30 ° C, מומלץ, לפני לשפוך לתוך מבחנות ואחסון של האוכל-4 מעלות צלזיוס. לגיל המתאים ההתאמה של שליטה וזבובים ניסיוני חשוב כמו גם תנאים מבוקרים תזונתיים וסביבתיים פריור להאכיל HFD. במהלך שלב האכלה, שליטה וזבובים ניסיוני יש להעניק את אותה כמות של NF ו- HFD. אף פעם לא לאסוף זבובים בקבוקונים צפוף או בקבוקים (כדי למנוע תופעות transgenerational). תמיד שמים מקסימלית של 25 זבובים לכל מבחנה במהלך NF ו- HFD האכלה כדי למנוע הגבלות תזונתיות או אפקטים המתגודדים אחרים. HFD מורכב של שמן קוקוס 30%, ולכן טמפרטורות מעל 22 ° C עלול להמיס חלקית HFD, גורם הזבובים מקל על מזון שומני, מתים. לפני שאת מורחת את הזבובים HFD, לנקות את הבקבוקונים כדי להסיר את כל מזוט ולהוסיף נייר סינון כדי לספוג את כל הנוזלים העודפים במזון. במהלך הדגירה של הזבובים על HFD, הבקבוקונים שכוב על צדם לספק משטח אופקי ללא שומן הזבובים.</li>
	</ol></li> <li>במשקל של הזבובים <ol><li>עבור כל גנוטיפ ומגדר להיבדק, להשתמש של סולם לאולטרה רגישות כדי לתעד את המשקולות של mL 1.7 מראש שכותרתו וריקה צינורות.</li>
		<li>באמצעות הרדמה לעוף או CO 2, עזים ומתנגד לאסוף זבובים 36 של גנוטיפ באותה, מגדר, ואת האכלה מצב עם מברשת לתוך אחד מראש שקל 1.7 צינור mL-</li>
		<li>שוקל את הצינור המכיל זבובים עם אותו סולם לאולטרה רגישות.</li>
		<li>לקבוע את המשקל הממוצע לטוס בעקבות נוסחה זו: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg" /> הערה: המספר של זבובים פרוטוקול זה הוא 36.</li>
		<li>פלאש להקפיא את הצינורות 1.7 mL המכילה זבובים על-ידי צולל לתוך חנקן נוזלי עבור 2 דק לאסוף ולשים הצינורות לתיבות. בשלב הבא, להעביר את התיבות-80 מעלות (עדיף טמפרטורה) לאחסון עד לשימוש עם תג וזמינותו. 
		זהירות: חנקן נוזלי היא בטמפרטורה נמוכה ביותר. נא להשתמש ציוד מגן אישי המתאים.</li>
	</ol></li></ol> 2. Assay תגים <ol><li>הכנת ריכוז רגיל תג <ol><li>להכין 500 מ"ל של PBT (PBS 1 X, 0.05% טריטון).</li>
		<li>באמצעות צינורות 0.5 mL, הפתרון תג (טבלה של חומרים), להכין µL 100 של ריק (PBT בלבד) ו- µL 100 של שישה ריכוזים תג רגיל (2 µg/µL µg 1/µL 0.5 µg/µL; 0.25 µg/µL; 0.125 µg/µL; 0.0625 µg/µL) עם PBT-</li>
		<li>במקום הצינורות על קרח ולהמשיך עם טחינת הזבובים.</li>
	</ol></li> <li>טחינת הזבובים <ol><li>להוציא את הזבובים קפוא מ-80 מעלות צלזיוס (שלב 1.3). העברת הצינורות המכילים הזבוב על קרח</li>
		<li>ראשון, מקום 2 מ מ מתכת טחינת כדורים לתוך מתקן כדור 96-ובכן, להשתמש במברשת קטנה להסיר את הביצים נוספת.</li>
		<li>מקום 96-ובכן שהטחינה צלחת הפוכה מעל הכדור dispenser ו הפוך כדי להעביר את הכדורים מתכת ישירות לתוך הלוח שחיקה. צריך להיות כדור אחד לכל טוב.</li>
		<li>בעזרת פיפטה של רב ערוצית, להוסיף µL 600 של PBT לתוך כל שורה של צלחת שחיקה 96-ובכן.</li>
		<li>עם מלקחיים, להוסיף 3 זבובים לכל טוב. ציין את התנאי גנוטיפ, מין ואוכל של הזבובים בכל שורה/היטב של צלחת שחיקה 96-ובכן.</li>
		<li>מקום בחוזקה את הפקקים לצלחת שחיקה 96-ובכן. הקלטת יוטלו על העליונה כדי לוודא שאין זליגת.</li>
		<li>כראוי למקם את הצלחות שחיקה של 96-ובכן לתוך המכונה שחיקה. הגדר את המכונה המהירות הגבוהה ביותר ואת העיתונות &#34; לרוץ &#34; לטחון עם אמו והוריה מינימום 3</li>
		<li>לאחר 3 דקות, תפסיק לשפשף את ולהמשיך עם צלחת צנטריפוגה: centrifuג ' נרל אלקטריק למשך 15 דקות ב g x 4,000, 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, לנהל את הצלחת שחיקה בקפידה כדי למנוע ערבוב את תגובת שיקוע עם בגדר.</li>
	</ol></li> <li>טעינה הדגימה ונחישות תוכן תג <ol><li>לקחת צלחת 96-ובכן ספקטרופוטומטרים חדש. באמצעות פיפטה של רב ערוצית, לטעון µL 200 מהתרכובת תג לתוך כל שורה של הצלחת-</li>
		<li>µL 20 עומס של PBT לתוך הבאר הראשונה של השורה הראשונה, כדי ליצור ריק. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות.</li>
		<li>טען 20 µL של כל דילול סטנדרטי (מתוך שלב 2.1.2) לתוך הנותרים הבארות הראשונים בשורה ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות.</li>
		<li>באמצעות פיפטה של רב ערוצית, להעביר µL 20 של תגובת שיקוע מכל שורה של צלחת שחיקה על השורה המתאימה בצלחת ספקטרופוטומטרים 96-ובכן. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. למנוע יצירת בועות.</li>
		<li>הבא, הצב תשובה מכשילה גז-חדיר מעל החלק העליון של הלוח 96-ובכן.</li>
		<li>דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות 
		הערה: אם יש בועות הבארות, centrifuge את הצלחת למשך 2 דקות ב 2,000 g x כדי להסיר את כל הבועות. הנוכחות של בועות יפריעו הקריאה ספיגת.</li>
		<li>קרא ספיגת של כל טוב של הצלחת ב 550 ננומטר שימוש בקורא תואם microplate. בשלב הבא, לאתר את עקומת סטנדרטי ולקבוע את הריכוז [µg µL] של הדגימות לא ידוע.</li>
		<li>לקביעת כמות התוכן תג לאדם רשע במשקל זבוב, להשתמש בנוסחה הבאה: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg" /> הערה: ב פרוטוקול זה, היו 3 זבובים טחון ב- 600 µL של PBT; וכתוצאה מכך האחסון מתכוון לכל זבוב הוא 200 µL.</li>
	</ol></li> <li>Assay ברדפורד, נורמליזציה של תוכן תג עם תכולת החלבון <ol><li>להכין 7 µL 100 של אלבומין שור (BSA) דילולים סטנדרטי (75 µg/mL µg 100/mL; µg 150/mL; 200 µg/mL; 250 µg/mL; 500 µg/mL; 1,000 µg/mL) עם PBT-</li>
		<li>לקחת צלחת חדשה 96-ובכן, לטעון µL 200 של ריאגנט ברדפורד X 1 לתוך כל שורה של הצלחת-</li>
		<li>, הבאר הראשונה של השורה הראשונה, להוסיף 10 µL של PBT כדי ליצור ריק. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות.</li>
		בארות <li>להוסיף 10 µL של כל דילול סטנדרטי לתוך שאר הראשונים בשורה ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות.</li>
		<li>באמצעות פיפטה של רב ערוצית, להעביר µL 10 של הזבוב supernatant מכל שורה של צלחת שחיקה אל השורה המתאימה בצלחת 96-ובכן. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. למנוע יצירת בועות.</li>
		<li>הצב תשובה מכשילה גז-חדיר מעל החלק העליון של הלוח 96-ובכן.</li>
		<li>דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. אם יש בועות הבארות, centrifuge את הצלחת למשך 2 דקות ב 2,000 g x כדי להסיר אותם. 
		הערה: הנוכחות של בועות יפריעו הקריאה ספיגת.</li>
		<li>שימוש ספקטרופוטומטרים כדי לקרוא ספיגת של הריק, תקנים ודוגמאות לא ידוע-595 nm. להשתמש העקומה הסטנדרטי לקביעת הריכוזים [µg µL] של הדגימות בכל שורה.</li>
		<li>לנרמל את התג תוכן עם רמת חלבון באמצעות הנוסחה הבאה: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg" /></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+prevalence+of+overweight+and+obesity+in+children+and+adults+during+1980-2013:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2013.">Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013.</a> Lancet. 384, 766-781 (2014).</li><li>Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm">https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm</a> (2015)</li><li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+development+in+Drosophila+and+its+relationship+to+vertebrates.">Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates.</a> Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).</li><li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Drosophila+melanogaster+to+map+human+cancer+pathways.">Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways.</a> Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).</li><li>Chan, H. Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila models of human neurodegenerative disease.</a> Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).</li><li>Levine, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+sequences+homologous+to+a+protein+coding+region+conserved+between+homeotic+genes+of+Drosophila.">Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila.</a> Cell. 38, 667-673 (1984).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li><li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+an+emerging+model+for+cardiac+disease.">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342, 1-11 (2004).</li><li>Noyes, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expression+of+the+Drosophila+adipokinetic+hormone+gene.">Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene.</a> Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).</li><li>Rajan, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+flies+and+men:+insights+on+organismal+metabolism+from+fruit+flies.">Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies.</a> BMC Biol. 11, 38 (2013).</li><li>Rulifson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies:+growth+and+diabetic+phenotypes.">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296, 1118-1120 (2002).</li><li>Birse, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat-diet-induced+obesity+and+heart+dysfunction+are+regulated+by+the+TOR+pathway+in+Drosophila.">High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila.</a> Cell Metab. 12, 533-544 (2010).</li><li>Musselman, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-sugar+diet+produces+obesity+and+insulin+resistance+in+wild-type+Drosophila.">A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila.</a> Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).</li><li>Diop, S. B., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+Insights+into+Diabetic+Cardiomyopathy+from+Drosophila.">Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila.</a> Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).</li><li>Williams, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Obesity-Linked+Gene+Nudt3+Drosophila+Homolog+Aps+Is+Associated+With+Insulin+Signaling.">The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling.</a> Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).</li><li>Morris, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+diet-induced+insulin+resistance+in+adult+Drosophila+melanogaster.">Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster.</a> Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).</li><li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gene+tinman+is+required+for+specification+of+the+heart+and+visceral+muscles+in+Drosophila.">The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila.</a> Development. 118, 719-729 (1993).</li><li>Erkkila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fatty+acids+and+cardiovascular+disease:+an+epidemiological+approach.">Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach.</a> Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).</li><li>Ganz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+feeding+results+in+gender+specific+steatohepatitis+and+inflammasome+activation.">High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation.</a> World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).</li><li>Wang, C. Y., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance.">A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance.</a> Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).</li><li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).</li><li>Mathews, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+Dimorphism+of+Body+Size+Is+Controlled+by+Dosage+of+the+X-Chromosomal+Gene+Myc+and+by+the+Sex-Determining+Gene+tra+in+Drosophila.">Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila.</a> Genetics. 205, 1215-1228 (2017).</li><li>Golay, A., Bobbioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dietary+fat+in+obesity.">The role of dietary fat in obesity.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 21, 2-11 (1997).</li><li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1/Spargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase.">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Rep. 10, 1-13 (2015).</li><li>Chatterjee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+metabolic+adaptation+to+fasting+by+dILP6-induced+insulin+signaling+in+Drosophila+oenocytes.">Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).</li><li>Palanker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+HNF4+regulates+lipid+mobilization+and+beta-oxidation.">Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation.</a> Cell Metab. 9, 228-239 (2009).</li><li>Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+high-fat+diet+in+stress+response+of+Drosophila.">Role of high-fat diet in stress response of Drosophila.</a> PLoS One. 7, 42587 (2012).</li><li>Kitahara, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+class+III+obesity+(BMI+of+40-59+kg/m2)+and+mortality:+a+pooled+analysis+of+20+prospective+studies.">Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies.</a> PLoS Med. 11, 1001673 (2014).</li><li>Reis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+five+lipid+extraction+solvent+systems+for+lipidomic+studies+of+human+LDL.">A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL.</a> J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).</li><li>Turne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercritical+fluid+extraction+and+chromatography+for+fat-soluble+vitamin+analysis.">Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis.</a> J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).</li><li>Na, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+model+of+high+sugar+diet-induced+cardiomyopathy.">Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy.</a> PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השמנת יתר אינדוקציה בעכברים יכול לקחת חודשים19,20. בזבובים, זו HFD האכלה הפרוטוקול מאפשר אינדוקציה של עודף הצטברות שומן תוך מספר ימים או פחות, גורם מגביר הצטברות שומן רק לאחר 18 h (ראה איור 2). HFD האכלה עם פרוטוקול המתואר גלוקוז תוכן 12 ע...

אנחנו בתקופה שבה השמנת יתר, הנטל הכלכלי, המשויכת שלו הוא בעיה ברחבי העולם1. . שניים מתוך כל שלושה אמריקאים הם מעודף משקל או מהשמנת יתר עם פתולוגיות הקשורות ללב, הגורם העיקרי למוות בתוך אוכלוסיית הבוגרים2. השיטה היעילה חדש דרושים כדי שלמאחה לחקור את הרכיבים גנטית ומולקולרית מעורב ברגולציה של תסמונת מטבולית באמצעות מודל אורגניזמים. מסיבה זו, אנו בוחרים את המודל דרוזופילה זבוב הפירות כי היא חולקת את התהליכים הביולוגיים הבסיסיים ביותר עם יונקים, כולל בעכברים ובבני אדם3,4,5,6. הגנום של דרוזופילההוא מאוד שנשמרת במשך האבולוציה אבל בסך הכל הרבה יותר קטן עם פחות שכפול גנטי, המורכבות מטבולית, שהופך אותו אידיאלי עבור הבנת המנגנונים הבסיסיים מעורב מחלות אנושיות רבות4 , 7 , 8. בנוסף, תהליכים אופייניים המבוצע על ידי רקמת שומן, הבטן ואת הלבלב מיוצגים הזבוב ולסיים רגולטוריות פונקציות בגלוקוז, ליפיד חילוף חומרים, לדוגמה, דומים לבני אדם9, 10,11. יתר על כן, בסיסי מסלולים מולקולריים המעורבים בבקרה על השמנה, עמידות לאינסולין וסוכרת בבני פונקציונלית נשמרים דרוזופילה melanogaster12,13,14 , 15 , 16. כמו עילאיים, דרוזופילה יש לב פועם נוצרת במהלך הפיתוח על-ידי תהליכים דומים לזה של ה-3,לב בתרבית של17. לפיכך, התפתחות HFD אמין האכלה הפרוטוקול ואת וזמינותו תג תפוקה גבוהה, המותאמים למטרות סינון יעיל באמצעות תיבת כלי גנטי של דרוזופילה, לספק אמצעי חשוב ללמוד ולהבין את הבסיס הגנטי הבסיסי מחלות מטבוליות מורכבת המשמשת כבסיס.
המזון HFD עצמו עשוי מאכל לעוף מעבדה רגיל בתוספת שמן קוקוס, אשר מורכב ברובו של חומצות שומן רוויות ידוע להיות מזוהה עם תסמונת מטבולית18. בעוד שייצור השמנה במודלים יונקים, כגון מכרסמים, יכול לקחת חודשים19,20, שלנו HFD ממוטבת האכלה פרוטוקול דרוזופילה ביעילות, reproducibly מגדיל organismal שומן בעניין של ימים12,14. פרוטוקול זה, בשילוב עם וזמינותו תפוקה גבוהה תג, מאפשר הקרנה המונים יעילה על ההשפעות של גורמים גנטיים, השפעות הסביבה. סמים מועמדים לגלות מאפננים החדש של חילוף החומרים של השומן. כתוצאה מכך, צפויים פרוטוקולים אלה רלוונטיים להבין ו/או לחימה השמנת יתר, השמנת יתר-הקשורים פתולוגיות אנושי.
פרוטוקול האכלה הוא תכליתי ולא ניתן להחיל לחקור את ההשפעות מטבולית ופונקציונליים של חומצות שומן רוויות או רוויים יחיד. שימוש assay תגים תפוקה גבוהה זו אינה מוגבלת melanogaster ד, אך עשוי להתאים למגוון רחב של אורגניזמים מודל קטן עם לציפורן או מטריצה חוץ-תאית קשה (למשל, מינים אחרים דרוזופילה , C. elegans השני המתעוררים דגם הגעה אורגניזמים) כדי למדוד את תכולת שומן תחת תנאים סביבתיים, גנטי או פיזיולוגיות שונות, בכל שלב של פיתוח, לבגרות או שלב של מחלה מטבולית. וזמינותו תג מבוססת על מדידה ערכי צבע מוחלטים של סדרה של תגובות אנזימטיות זה לבזות את התגים לתוך חומצות שומן בחינם, גליצרול, גליצרול 3-פוספט ולבסוף2O H2 זה מגיב 4-aminoantipyrine (4-AAP) ו- 3.5- dichloro-2-hydroxybenzene (DHBS 3.5) כדי לייצר מוצר בצבע אדום נמדד באמצעות ספקטרופוטומטרים 96-ובכן סולפנט

<table width="924">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Talboys Ball dropper/bead Dispenser</td>
			<td style="width:209px;">Talboys</td>
			<td style="width:148px;">#: 930150</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Talboys High Throughput Homogenizer</td>
			<td style="width:209px;">Talboys</td>
			<td style="width:148px;">#: 930145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="width:400px;height:17px;">Grinding Balls, Stainless Steel&#160;</td>
			<td style="width:209px;">OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td style="width:148px;"># GBSS 156-5000-01</td>
			<td>5000 balls</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Masterblock 96 Well deep Microplates</td>
			<td style="width:209px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:148px;"># T-3058-1</td>
			<td>case of 80 plates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="width:400px;height:22px;">Greiner&#160; 96 well microplate flat bottom</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># M4436</td>
			<td>40 plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Greiner CapMat for sealing multiwell plates</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># C3606</td>
			<td>50 sealing plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Reagent Reservoirs&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># 1192T71</td>
			<td>12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661040</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td># 4661040</td>
			<td>1-10 ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661070</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td># 4661070</td>
			<td>30-300ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661020</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td>#4661020</td>
			<td>10-100ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td># P3131-S</td>
			<td>for 10 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td># P3133-S</td>
			<td>for 200 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td>#P1125</td>
			<td>for 100 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Roboz Surgical</td>
			<td># 5 Dumonts</td>
			<td>Super fine forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64</td>
			<td style="width:209px;">Cole-Parmer scientific experts</td>
			<td># EW-11333-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance</td>
			<td style="width:209px;">Cole-Parmer scientific experts</td>
			<td># EW-11333-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">96-Well microplate Centrifuge</td>
			<td style="width:209px;">Hettich Zentrifugen</td>
			<td style="width:148px;"># Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:209px;">Molecular devices</td>
			<td style="width:148px;"># SpectraMax 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator</td>
			<td style="width:209px;">Biostad</td>
			<td style="width:148px;"># 3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Infinity Triglycerides reagent</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># TR22421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Triglyceride Standard</td>
			<td style="width:209px;">Stanbio</td>
			<td style="width:148px;">#2103 - 030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Quick Start Bradford Protein Assay</td>
			<td style="width:209px;">Bio-RAD</td>
			<td style="width:148px;"># 500-0205</td>
			<td>1x dye Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Coconut oil</td>
			<td style="width:209px;">Nutiva</td>
			<td># 692752200014</td>
			<td>15 0z jar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># AM9625</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># 9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Gas-permeable Foil</td>
			<td style="width:209px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:148px;"># 740675</td>
			<td>50 pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">filter Paper</td>
			<td style="width:209px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;"># 28317-241</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Drosophila vials</td>
			<td style="width:209px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 32-116SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick Start Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td style="width:209px;">Bio-Rad</td>
			<td># 5000206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">FlyNap Anesthetic</td>
			<td style="width:209px;">Carolina</td>
			<td style="width:148px;"># 173025</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes Low-Lint</td>
			<td style="width:209px;">Uline</td>
			<td style="width:148px;"># S-8115</td>
			<td>1-Ply, 4.4 x 8.4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high fat diet feeding and high throughput triacylglyceride assay in drosophila melanogaster

מחלת לב היא הגורם מספר אחד למוות אדם ברחבי העולם. מחקרים רבים הראו קשרים חזקים בין השמנת יתר בתפקוד הלב אצל בני אדם, אבל מאמצי המחקר וכלים נוספים יש צורך להבהיר טוב יותר את המנגנונים המעורבים. במשך יותר ממאה, הדגם גנטית מאוד צייתן של דרוזופילה כבר אינסטרומנטלי גילוי גנים מרכזיים, מסלולים מולקולריים אשר הוכיח להיות מאוד שמור על פני מינים. תהליכים ביולוגיים רבים, מנגנוני המחלה באופן פונקציונלי נשמרים בתוך הזבוב, כגון פיתוח (למשל, תוכנית גוף, לב), סרטן, מחלות ניווניות. לאחרונה, המחקר של השמנת יתר, פתולוגיות משני, כגון מחלות לב דגם אורגניזמים, שיחק תפקיד קריטי מאוד הזיהוי של הרגולטורים מפתח מעורב תסמונת מטבולית אצל בני אדם.
כאן, אנו מציעים שתשמש כלי יעיל זה אורגניזם מודל זירוז השמנת יתר, כלומר, הצטברות שומן עודף, ולפתח פרוטוקול יעיל כדי לנטר בצורה של תגיות הצטברות שומן. בנוסף שנשמרת מאוד, אבל פחות מורכבים הגנום, הזבוב יש גם אורך חיים קצר לניסויים מהירה, בשילוב העלות האפקטיביות. מאמר זה מספק נוהל מפורט עבור דיאטה שומן גבוהה (HFD) האכלה דרוזופילה לזירוז השמנה ואת וזמינותו triacylglyceride (תג) של תפוקה גבוהה למדידת העלייה המשויך תכולת השומן, במטרה להיות מאוד לשחזור, יעיל לסינון גנטי או כימיות בקנה מידה גדול. פרוטוקולים אלה מציעים הזדמנויות חדשות ביעילות לחקור מנגנונים רגולטוריים מעורב השמנת יתר, וכן מספקים פלטפורמה סטנדרטית למחקר גילוי סמים בדיקה מהירה של השפעת סמים מועמדים על הפיתוח או מניעת השמנת יתר, סוכרת ומחלות מטבוליות הקשורות.

ד melanogaster, כפי שקורה עם מינים אחרים, יש דו-צורתיות בין זכרים ונקבות22. זה ידוע כי נשים הם גדולים, עם יותר שומן בתוך הבטן שלהם, מאשר זכרים22. כדי לבדוק את האפקטיביות של פרוטוקול שלנו, נוכל לבצע מבחני תג כדי לקבוע ההבדלים בתוכן התג בין זכרים ונקבות ?...

Watch this Scientific Journal Video about High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

זוהי דיאטה שומן גבוהה האכלה פרוטוקול לזירוז ההשמנה דרוזופילה, דוגמנית על הבנת המנגנונים המולקולריים יסודי מעורב lipotoxicity. הוא גם מספק assay triacylglyceride של תפוקה גבוהה למדידת הצטברות שומן דרוזופילה ואת פוטנציאל אחרים מודלים (חרק) בתנאים תזונתיים, סביבתיים, גנטי או פיזיולוגיים שונים.

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

high-fat-diet-feeding-high-throughput-triacylglyceride-assay

Research

JoVE Journal

Genetics

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

11.1K Views.  Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. זוהי דיאטה שומן גבוהה האכלה פרוטוקול לזירוז ההשמנה דרוזופילה, דוגמנית על הבנת המנגנונים המולקולריים יסודי מעורב lipotoxicity. הוא גם מספק assay triacylglyceride של תפוקה גבוהה למדידת הצטברות שומן דרוזופילה ואת פוטנציאל אחרים מודלים (חרק) בתנאים תזונתיים, סביבתיים, גנ...

Video: High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

תפוקה גבוהה בידוד Assisted רובוטית של מוטאנטים קטלניים רגישים-טמפרטורה<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for understanding the development and evolution of morphological phenotypes. Abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster has been particularly useful, allowing researchers to identify the loci that underlie inter- and intraspecific variations in morphology. Hitherto, however, D. melanogaster abdominal pigmentation has been largely assayed qualitatively, through scoring, rather than quantitatively, which limits the forms of statistical analysis that can be applied to pigmentation data. This work describes a new methodology that allows for the quantification of various aspects of the abdominal pigmentation pattern of adult D. melanogaster. The protocol includes specimen mounting, image capture, data extraction, and analysis. All the software used for image capture and analysis feature macros written for open-source image analysis. The advantage of this approach is the ability to precisely measure pigmentation traits using a methodology that is highly reproducible across different imaging systems. While the technique has been used to measure variation in the tergal pigmentation patterns of adult D. melanogaster, the methodology is flexible and broadly applicable to pigmentation patterns in myriad different organisms.

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

This work presents a method to quickly and precisely quantify the abdominal pigmentation of Drosophila melanogaster using digital image analysis. This method streamlines the procedures between phenotype acquisition and data analysis and includes specimen mounting, image acquisition, pixel value extraction, and trait measurement.

כימות פיגמנטציה בטן ב<em&gt; תסיסנית מלנוגאסטר</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

התפוקה הגבוהה של DNA פלאגיסינג ומעבר באמצעות טכנולוגיית ננו-לחילוק אקוסטית

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

דיגיטלי PCR מבוססי אינדקס תחרותי עבור ניתוח תפוקה גבוהה של כושר בסלמונלה

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...