Name: high fat diet feeding and high throughput triacylglyceride assay in drosophila melanogaster
Uploaded: 2017-09-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

ברצוננו להודות אריקה טיילור עבור עריכת כתב היד הזה. עבודה זו מומן על ידי מענקים של מכוני הבריאות הלאומיים (P01 HL098053, P01 AG033561 ו- R01 HL054732) כדי R.B., תוספת מחקר פוסט דוקטורט (R01 HL085481), מלגת (AAUW) S.B.D., מענקים של איגוד הלב האמריקני S.B.D. ואני חוזר לבסיס

1. HFD האכלה פרוטוקול <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg" /> טבלה 1. מתכון אוכל לעוף. 
טבלה זו מסכמת החומרים השונים המשמשים להכנת לשליטתנו מזון. לאחר ביצוע, 10 מ של המזון הוא נשפך לתוך מבחנות, מקורר ומאוחסנים ב 4 ° C לאחסון לטווח ארוך-
<ol><li>HFD הכנה <ol><li>להכין 1 ק ג של מזון שמן גבוהה, שוקל 700 גר' מוכנות מראש אוכל לטוס רגיל (ראה טבלה 1) ו- 300 גרם שמן קוקוס לתוך שני מיכלים נפרדים באמצעות איזון האנליטי.</li>
		<li>חום לכל מכולה בנפרד במיקרוגל, עד התוכן נמס לחלוטין. שופכים שמן קוקוס לתוך המיכל אוכל לעוף. מערבבים בעזרת מקצף עד טוב לערבב את השמן לתוך האוכל לעוף. 
		הערה: אין גושים של מזון או שמן צריך להיות גלוי. כאשר האוכל לטוס נמס במיקרוגל, להפסיק במרווחים של 1 דקות לערבב את האוכל ולמנוע גולש.</li>
		<li>לשקול מחדש את האוכל שומן גבוהה. אם המשקל הכולל פחות מ 1 ק ג (700 גרם מזון + 300 גרם שמן קוקוס), להוסיף מים (כ- 10 מ"ל) כדי לפצות על אידוי בזמן חימום, כדי להחזיר את המשקל 1 ק</li>
		<li>Pour מעורבב היטב 10 מ"ל מזון שמן גבוהה לכל מבחנה (בסביבות 25% נפח המבחנה). בשלב הבא, לכסות עם גזה כדי למנוע זבובים &#39; זיהום. מגניב לשעה בטמפרטורת החדר ואז להעביר את הבקבוקונים עד 4 ° C עבור אחסון עד כדי 4 שבועות. 
		הערה: האוכל הרגיל (NF) משמש כמזון שליטה. גם למזוג 10 מ"ל (בסביבות 25% נפח המבחנה) של NF לכל מבחנה. על האוכל HFD להחליף 30% של האוכל NF שמן קוקוס. עבור פקד ותנאים ניסיוני, הזבובים קיבלו את אותה כמות של NF ו- HFD (10 מ"ל של מזון לכל מבחנה).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg" /> איור 1 . HFD האכלה דרוזופילה. 
ערכת מראה את השלבים האכלה שונים עבור זבובים על בקרת מזון (תזונה נורמלית ללא תוספת של שמן קוקוס-NF) או HFD (עם התוספת של שמן קוקוס). התהליך כולו לוקח 10 ימים אחרי האוסף הראשונית של הזבוב הבוגר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="2"> <li>HFD האכלה של melanogaster ד הערה: פרוטוקול זה כולל שליטה ואוכל HFD האכלה נהלים התואמים כל קו לעוף. שליטה וזבובים ניסיוני שמים בקבוקונים המכילים את אותו כמות האוכל (NF או HFD).
	<ol><li>שימוש CO 2 כדי עזים ומתנגד הזבובים. 
		הערה: עבור ינוקות, אנא קרא הפניה 21 למבט כולל על גידול וטיפול melanogaster ד.</li>
		<li>לאסוף 0-5 בנות יום זבובים בקבוקונים והעברה (על-ידי היפוך) הזבובים לתוך מבחנות החדש שמכילות את NF (חימם בעבר בטמפרטורת החדר). תן לעידן זבובים במשך 5 ימים נוספים-21 מעלות צלזיוס</li>
		<li>בסוף 5 הימים, להוציא את הבקבוקונים המכיל HFD NF מ- 4 מעלות צלזיוס 
		הערה: כמו זבובים חיים, מתח יכול הטמפרטורות הקרות. תן את הבקבוקונים לשבת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר להתחמם לפני השימוש.</li>
		<li>באמצעות מגבונים לחים, לנקות ולהסיר עודפי הנוזלים מן הצדדים של הבקבוקונים.</li>
		<li>הוסף פיסת נייר סינון, קטנה על 1 ס מ x 3 ס"מ, לתוך האוכל השמן גבוהה כדי לספוג את הנוזל העודף. 
		הערה: שלב זה הוא קריטי עבור מניעת הזבובים נדבקות האוכל HFD.</li>
		<li>הבא, העברת הזבובים על האוכל השמן גבוהה (על-ידי היפוך). להניח את הבקבוקונים אופקית בצד שלהם, (לא עומדת) ב 21-22 מעלות צלזיוס במשך 5 ימים. 
		הערה: להימנע טמפרטורות גבוהות יותר כמו זה באופן חלקי ממיסים האוכל השמן גבוהה, גורם הזבובים לדבוק המזון ולמות.</li>
		<li>לאחר 5 ימים, העברה (על-ידי היפוך) הזבובים מן NF ו- HFD לתוך בקבוקונים חדשים ללא מזון כדי לאפשר את המעיים שלהם ריק במשך 30 דקות. בשלב הבא, להמשיך שקילה הזבובים. 
		הערה: אחד הצעדים הקריטיים ב הזה HFD האכלה פרוטוקול היא להכין HFD מעורבב היטב, ללא כל נתחי אוכל לעוף או שמן מרוכז. ערבוב הומוגנית וקירור של HFD עד 45-30 ° C, מומלץ, לפני לשפוך לתוך מבחנות ואחסון של האוכל-4 מעלות צלזיוס. לגיל המתאים ההתאמה של שליטה וזבובים ניסיוני חשוב כמו גם תנאים מבוקרים תזונתיים וסביבתיים פריור להאכיל HFD. במהלך שלב האכלה, שליטה וזבובים ניסיוני יש להעניק את אותה כמות של NF ו- HFD. אף פעם לא לאסוף זבובים בקבוקונים צפוף או בקבוקים (כדי למנוע תופעות transgenerational). תמיד שמים מקסימלית של 25 זבובים לכל מבחנה במהלך NF ו- HFD האכלה כדי למנוע הגבלות תזונתיות או אפקטים המתגודדים אחרים. HFD מורכב של שמן קוקוס 30%, ולכן טמפרטורות מעל 22 ° C עלול להמיס חלקית HFD, גורם הזבובים מקל על מזון שומני, מתים. לפני שאת מורחת את הזבובים HFD, לנקות את הבקבוקונים כדי להסיר את כל מזוט ולהוסיף נייר סינון כדי לספוג את כל הנוזלים העודפים במזון. במהלך הדגירה של הזבובים על HFD, הבקבוקונים שכוב על צדם לספק משטח אופקי ללא שומן הזבובים.</li>
	</ol></li> <li>במשקל של הזבובים <ol><li>עבור כל גנוטיפ ומגדר להיבדק, להשתמש של סולם לאולטרה רגישות כדי לתעד את המשקולות של mL 1.7 מראש שכותרתו וריקה צינורות.</li>
		<li>באמצעות הרדמה לעוף או CO 2, עזים ומתנגד לאסוף זבובים 36 של גנוטיפ באותה, מגדר, ואת האכלה מצב עם מברשת לתוך אחד מראש שקל 1.7 צינור mL-</li>
		<li>שוקל את הצינור המכיל זבובים עם אותו סולם לאולטרה רגישות.</li>
		<li>לקבוע את המשקל הממוצע לטוס בעקבות נוסחה זו: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg" /> הערה: המספר של זבובים פרוטוקול זה הוא 36.</li>
		<li>פלאש להקפיא את הצינורות 1.7 mL המכילה זבובים על-ידי צולל לתוך חנקן נוזלי עבור 2 דק לאסוף ולשים הצינורות לתיבות. בשלב הבא, להעביר את התיבות-80 מעלות (עדיף טמפרטורה) לאחסון עד לשימוש עם תג וזמינותו. 
		זהירות: חנקן נוזלי היא בטמפרטורה נמוכה ביותר. נא להשתמש ציוד מגן אישי המתאים.</li>
	</ol></li></ol> 2. Assay תגים <ol><li>הכנת ריכוז רגיל תג <ol><li>להכין 500 מ"ל של PBT (PBS 1 X, 0.05% טריטון).</li>
		<li>באמצעות צינורות 0.5 mL, הפתרון תג (טבלה של חומרים), להכין µL 100 של ריק (PBT בלבד) ו- µL 100 של שישה ריכוזים תג רגיל (2 µg/µL µg 1/µL 0.5 µg/µL; 0.25 µg/µL; 0.125 µg/µL; 0.0625 µg/µL) עם PBT-</li>
		<li>במקום הצינורות על קרח ולהמשיך עם טחינת הזבובים.</li>
	</ol></li> <li>טחינת הזבובים <ol><li>להוציא את הזבובים קפוא מ-80 מעלות צלזיוס (שלב 1.3). העברת הצינורות המכילים הזבוב על קרח</li>
		<li>ראשון, מקום 2 מ מ מתכת טחינת כדורים לתוך מתקן כדור 96-ובכן, להשתמש במברשת קטנה להסיר את הביצים נוספת.</li>
		<li>מקום 96-ובכן שהטחינה צלחת הפוכה מעל הכדור dispenser ו הפוך כדי להעביר את הכדורים מתכת ישירות לתוך הלוח שחיקה. צריך להיות כדור אחד לכל טוב.</li>
		<li>בעזרת פיפטה של רב ערוצית, להוסיף µL 600 של PBT לתוך כל שורה של צלחת שחיקה 96-ובכן.</li>
		<li>עם מלקחיים, להוסיף 3 זבובים לכל טוב. ציין את התנאי גנוטיפ, מין ואוכל של הזבובים בכל שורה/היטב של צלחת שחיקה 96-ובכן.</li>
		<li>מקום בחוזקה את הפקקים לצלחת שחיקה 96-ובכן. הקלטת יוטלו על העליונה כדי לוודא שאין זליגת.</li>
		<li>כראוי למקם את הצלחות שחיקה של 96-ובכן לתוך המכונה שחיקה. הגדר את המכונה המהירות הגבוהה ביותר ואת העיתונות &#34; לרוץ &#34; לטחון עם אמו והוריה מינימום 3</li>
		<li>לאחר 3 דקות, תפסיק לשפשף את ולהמשיך עם צלחת צנטריפוגה: centrifuג ' נרל אלקטריק למשך 15 דקות ב g x 4,000, 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, לנהל את הצלחת שחיקה בקפידה כדי למנוע ערבוב את תגובת שיקוע עם בגדר.</li>
	</ol></li> <li>טעינה הדגימה ונחישות תוכן תג <ol><li>לקחת צלחת 96-ובכן ספקטרופוטומטרים חדש. באמצעות פיפטה של רב ערוצית, לטעון µL 200 מהתרכובת תג לתוך כל שורה של הצלחת-</li>
		<li>µL 20 עומס של PBT לתוך הבאר הראשונה של השורה הראשונה, כדי ליצור ריק. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות.</li>
		<li>טען 20 µL של כל דילול סטנדרטי (מתוך שלב 2.1.2) לתוך הנותרים הבארות הראשונים בשורה ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות.</li>
		<li>באמצעות פיפטה של רב ערוצית, להעביר µL 20 של תגובת שיקוע מכל שורה של צלחת שחיקה על השורה המתאימה בצלחת ספקטרופוטומטרים 96-ובכן. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. למנוע יצירת בועות.</li>
		<li>הבא, הצב תשובה מכשילה גז-חדיר מעל החלק העליון של הלוח 96-ובכן.</li>
		<li>דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות 
		הערה: אם יש בועות הבארות, centrifuge את הצלחת למשך 2 דקות ב 2,000 g x כדי להסיר את כל הבועות. הנוכחות של בועות יפריעו הקריאה ספיגת.</li>
		<li>קרא ספיגת של כל טוב של הצלחת ב 550 ננומטר שימוש בקורא תואם microplate. בשלב הבא, לאתר את עקומת סטנדרטי ולקבוע את הריכוז [µg µL] של הדגימות לא ידוע.</li>
		<li>לקביעת כמות התוכן תג לאדם רשע במשקל זבוב, להשתמש בנוסחה הבאה: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg" /> הערה: ב פרוטוקול זה, היו 3 זבובים טחון ב- 600 µL של PBT; וכתוצאה מכך האחסון מתכוון לכל זבוב הוא 200 µL.</li>
	</ol></li> <li>Assay ברדפורד, נורמליזציה של תוכן תג עם תכולת החלבון <ol><li>להכין 7 µL 100 של אלבומין שור (BSA) דילולים סטנדרטי (75 µg/mL µg 100/mL; µg 150/mL; 200 µg/mL; 250 µg/mL; 500 µg/mL; 1,000 µg/mL) עם PBT-</li>
		<li>לקחת צלחת חדשה 96-ובכן, לטעון µL 200 של ריאגנט ברדפורד X 1 לתוך כל שורה של הצלחת-</li>
		<li>, הבאר הראשונה של השורה הראשונה, להוסיף 10 µL של PBT כדי ליצור ריק. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות.</li>
		בארות <li>להוסיף 10 µL של כל דילול סטנדרטי לתוך שאר הראשונים בשורה ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות.</li>
		<li>באמצעות פיפטה של רב ערוצית, להעביר µL 10 של הזבוב supernatant מכל שורה של צלחת שחיקה אל השורה המתאימה בצלחת 96-ובכן. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. למנוע יצירת בועות.</li>
		<li>הצב תשובה מכשילה גז-חדיר מעל החלק העליון של הלוח 96-ובכן.</li>
		<li>דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. אם יש בועות הבארות, centrifuge את הצלחת למשך 2 דקות ב 2,000 g x כדי להסיר אותם. 
		הערה: הנוכחות של בועות יפריעו הקריאה ספיגת.</li>
		<li>שימוש ספקטרופוטומטרים כדי לקרוא ספיגת של הריק, תקנים ודוגמאות לא ידוע-595 nm. להשתמש העקומה הסטנדרטי לקביעת הריכוזים [µg µL] של הדגימות בכל שורה.</li>
		<li>לנרמל את התג תוכן עם רמת חלבון באמצעות הנוסחה הבאה: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg" /></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+prevalence+of+overweight+and+obesity+in+children+and+adults+during+1980-2013:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2013.">Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013.</a> Lancet. 384, 766-781 (2014).</li><li>Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm">https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm</a> (2015)</li><li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+development+in+Drosophila+and+its+relationship+to+vertebrates.">Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates.</a> Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).</li><li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Drosophila+melanogaster+to+map+human+cancer+pathways.">Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways.</a> Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).</li><li>Chan, H. Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila models of human neurodegenerative disease.</a> Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).</li><li>Levine, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+sequences+homologous+to+a+protein+coding+region+conserved+between+homeotic+genes+of+Drosophila.">Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila.</a> Cell. 38, 667-673 (1984).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li><li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+an+emerging+model+for+cardiac+disease.">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342, 1-11 (2004).</li><li>Noyes, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expression+of+the+Drosophila+adipokinetic+hormone+gene.">Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene.</a> Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).</li><li>Rajan, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+flies+and+men:+insights+on+organismal+metabolism+from+fruit+flies.">Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies.</a> BMC Biol. 11, 38 (2013).</li><li>Rulifson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies:+growth+and+diabetic+phenotypes.">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296, 1118-1120 (2002).</li><li>Birse, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat-diet-induced+obesity+and+heart+dysfunction+are+regulated+by+the+TOR+pathway+in+Drosophila.">High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila.</a> Cell Metab. 12, 533-544 (2010).</li><li>Musselman, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-sugar+diet+produces+obesity+and+insulin+resistance+in+wild-type+Drosophila.">A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila.</a> Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).</li><li>Diop, S. B., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+Insights+into+Diabetic+Cardiomyopathy+from+Drosophila.">Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila.</a> Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).</li><li>Williams, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Obesity-Linked+Gene+Nudt3+Drosophila+Homolog+Aps+Is+Associated+With+Insulin+Signaling.">The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling.</a> Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).</li><li>Morris, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+diet-induced+insulin+resistance+in+adult+Drosophila+melanogaster.">Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster.</a> Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).</li><li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gene+tinman+is+required+for+specification+of+the+heart+and+visceral+muscles+in+Drosophila.">The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila.</a> Development. 118, 719-729 (1993).</li><li>Erkkila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fatty+acids+and+cardiovascular+disease:+an+epidemiological+approach.">Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach.</a> Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).</li><li>Ganz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+feeding+results+in+gender+specific+steatohepatitis+and+inflammasome+activation.">High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation.</a> World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).</li><li>Wang, C. Y., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance.">A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance.</a> Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).</li><li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).</li><li>Mathews, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+Dimorphism+of+Body+Size+Is+Controlled+by+Dosage+of+the+X-Chromosomal+Gene+Myc+and+by+the+Sex-Determining+Gene+tra+in+Drosophila.">Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila.</a> Genetics. 205, 1215-1228 (2017).</li><li>Golay, A., Bobbioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dietary+fat+in+obesity.">The role of dietary fat in obesity.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 21, 2-11 (1997).</li><li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1/Spargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase.">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Rep. 10, 1-13 (2015).</li><li>Chatterjee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+metabolic+adaptation+to+fasting+by+dILP6-induced+insulin+signaling+in+Drosophila+oenocytes.">Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).</li><li>Palanker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+HNF4+regulates+lipid+mobilization+and+beta-oxidation.">Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation.</a> Cell Metab. 9, 228-239 (2009).</li><li>Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+high-fat+diet+in+stress+response+of+Drosophila.">Role of high-fat diet in stress response of Drosophila.</a> PLoS One. 7, 42587 (2012).</li><li>Kitahara, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+class+III+obesity+(BMI+of+40-59+kg/m2)+and+mortality:+a+pooled+analysis+of+20+prospective+studies.">Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies.</a> PLoS Med. 11, 1001673 (2014).</li><li>Reis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+five+lipid+extraction+solvent+systems+for+lipidomic+studies+of+human+LDL.">A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL.</a> J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).</li><li>Turne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercritical+fluid+extraction+and+chromatography+for+fat-soluble+vitamin+analysis.">Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis.</a> J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).</li><li>Na, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+model+of+high+sugar+diet-induced+cardiomyopathy.">Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy.</a> PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השמנת יתר אינדוקציה בעכברים יכול לקחת חודשים19,20. בזבובים, זו HFD האכלה הפרוטוקול מאפשר אינדוקציה של עודף הצטברות שומן תוך מספר ימים או פחות, גורם מגביר הצטברות שומן רק לאחר 18 h (ראה איור 2). HFD האכלה עם פרוטוקול המתואר גלוקוז תוכן 12 ע...

אנחנו בתקופה שבה השמנת יתר, הנטל הכלכלי, המשויכת שלו הוא בעיה ברחבי העולם1. . שניים מתוך כל שלושה אמריקאים הם מעודף משקל או מהשמנת יתר עם פתולוגיות הקשורות ללב, הגורם העיקרי למוות בתוך אוכלוסיית הבוגרים2. השיטה היעילה חדש דרושים כדי שלמאחה לחקור את הרכיבים גנטית ומולקולרית מעורב ברגולציה של תסמונת מטבולית באמצעות מודל אורגניזמים. מסיבה זו, אנו בוחרים את המודל דרוזופילה זבוב הפירות כי היא חולקת את התהליכים הביולוגיים הבסיסיים ביותר עם יונקים, כולל בעכברים ובבני אדם3,4,5,6. הגנום של דרוזופילההוא מאוד שנשמרת במשך האבולוציה אבל בסך הכל הרבה יותר קטן עם פחות שכפול גנטי, המורכבות מטבולית, שהופך אותו אידיאלי עבור הבנת המנגנונים הבסיסיים מעורב מחלות אנושיות רבות4 , 7 , 8. בנוסף, תהליכים אופייניים המבוצע על ידי רקמת שומן, הבטן ואת הלבלב מיוצגים הזבוב ולסיים רגולטוריות פונקציות בגלוקוז, ליפיד חילוף חומרים, לדוגמה, דומים לבני אדם9, 10,11. יתר על כן, בסיסי מסלולים מולקולריים המעורבים בבקרה על השמנה, עמידות לאינסולין וסוכרת בבני פונקציונלית נשמרים דרוזופילה melanogaster12,13,14 , 15 , 16. כמו עילאיים, דרוזופילה יש לב פועם נוצרת במהלך הפיתוח על-ידי תהליכים דומים לזה של ה-3,לב בתרבית של17. לפיכך, התפתחות HFD אמין האכלה הפרוטוקול ואת וזמינותו תג תפוקה גבוהה, המותאמים למטרות סינון יעיל באמצעות תיבת כלי גנטי של דרוזופילה, לספק אמצעי חשוב ללמוד ולהבין את הבסיס הגנטי הבסיסי מחלות מטבוליות מורכבת המשמשת כבסיס.
המזון HFD עצמו עשוי מאכל לעוף מעבדה רגיל בתוספת שמן קוקוס, אשר מורכב ברובו של חומצות שומן רוויות ידוע להיות מזוהה עם תסמונת מטבולית18. בעוד שייצור השמנה במודלים יונקים, כגון מכרסמים, יכול לקחת חודשים19,20, שלנו HFD ממוטבת האכלה פרוטוקול דרוזופילה ביעילות, reproducibly מגדיל organismal שומן בעניין של ימים12,14. פרוטוקול זה, בשילוב עם וזמינותו תפוקה גבוהה תג, מאפשר הקרנה המונים יעילה על ההשפעות של גורמים גנטיים, השפעות הסביבה. סמים מועמדים לגלות מאפננים החדש של חילוף החומרים של השומן. כתוצאה מכך, צפויים פרוטוקולים אלה רלוונטיים להבין ו/או לחימה השמנת יתר, השמנת יתר-הקשורים פתולוגיות אנושי.
פרוטוקול האכלה הוא תכליתי ולא ניתן להחיל לחקור את ההשפעות מטבולית ופונקציונליים של חומצות שומן רוויות או רוויים יחיד. שימוש assay תגים תפוקה גבוהה זו אינה מוגבלת melanogaster ד, אך עשוי להתאים למגוון רחב של אורגניזמים מודל קטן עם לציפורן או מטריצה חוץ-תאית קשה (למשל, מינים אחרים דרוזופילה , C. elegans השני המתעוררים דגם הגעה אורגניזמים) כדי למדוד את תכולת שומן תחת תנאים סביבתיים, גנטי או פיזיולוגיות שונות, בכל שלב של פיתוח, לבגרות או שלב של מחלה מטבולית. וזמינותו תג מבוססת על מדידה ערכי צבע מוחלטים של סדרה של תגובות אנזימטיות זה לבזות את התגים לתוך חומצות שומן בחינם, גליצרול, גליצרול 3-פוספט ולבסוף2O H2 זה מגיב 4-aminoantipyrine (4-AAP) ו- 3.5- dichloro-2-hydroxybenzene (DHBS 3.5) כדי לייצר מוצר בצבע אדום נמדד באמצעות ספקטרופוטומטרים 96-ובכן סולפנט

<table><tbody><tr><td>Talboys Ball dropper/bead Dispenser</td><td>Talboys</td><td>#: 930150</td><td></td></tr><tr><td>Talboys High Throughput Homogenizer</td><td>Talboys</td><td>#: 930145</td><td></td></tr><tr><td>Grinding Balls, Stainless Steel&amp;nbsp;</td><td>OPS Diagnostics, LLC</td><td># GBSS 156-5000-01</td><td>5000 balls</td></tr><tr><td>Masterblock 96 Well deep Microplates</td><td>Greiner Bio-One</td><td># T-3058-1</td><td>case of 80 plates</td></tr><tr><td>Greiner&amp;nbsp; 96 well microplate flat bottom</td><td>Sigma Aldrich</td><td># M4436</td><td>40 plates</td></tr><tr><td>Greiner CapMat for sealing multiwell plates</td><td>Sigma Aldrich</td><td># C3606</td><td>50 sealing plates</td></tr><tr><td>Reagent Reservoirs&amp;nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td># 1192T71</td><td>12/PK</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661040</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661040</td><td>1-10 ul multipipette</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661070</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661070</td><td>30-300ul multipipette</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661020</td><td>Thermo Scientific</td><td>#4661020</td><td>10-100ul multipipette</td></tr><tr><td>Multichannel tips</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3131-S</td><td>for 10 uL pipette</td></tr><tr><td>Multichannel tips</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3133-S</td><td>for 200 uL pipette</td></tr><tr><td>Multichannel tips</td><td>Denville Scientific Inc</td><td>#P1125</td><td>for 100 uL pipette</td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Roboz Surgical</td><td># 5 Dumonts</td><td>Super fine forceps</td></tr><tr><td>Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64</td><td>Cole-Parmer scientific experts</td><td># EW-11333-00</td><td></td></tr><tr><td>Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance</td><td>Cole-Parmer scientific experts</td><td># EW-11333-49</td><td></td></tr><tr><td>96-Well microplate Centrifuge</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td># Rotina 420R</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular devices</td><td># SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator</td><td>Biostad</td><td># 3527</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Triglycerides reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td># TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Triglyceride Standard</td><td>Stanbio</td><td>#2103 - 030</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Protein Assay</td><td>Bio-RAD</td><td># 500-0205</td><td>1x dye Reagent</td></tr><tr><td>Coconut oil</td><td>Nutiva</td><td># 692752200014</td><td>15 0z jar</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Thermo Scientific</td><td># AM9625</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td># 9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Gas-permeable Foil</td><td>Macherey-Nagel</td><td># 740675</td><td>50 pieces</td></tr><tr><td>filter Paper</td><td>VWR</td><td># 28317-241</td><td>Pack of 100</td></tr><tr><td>Drosophila vials</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat #: 32-116SB</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bovine Serum Albumin Standard</td><td>Bio-Rad</td><td># 5000206</td><td></td></tr><tr><td>FlyNap Anesthetic</td><td>Carolina</td><td># 173025</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Kimwipes Low-Lint</td><td>Uline</td><td># S-8115</td><td>1-Ply, 4.4 x 8.4&quot;</td></tr></tbody></table>

high fat diet feeding and high throughput triacylglyceride assay in drosophila melanogaster

מחלת לב היא הגורם מספר אחד למוות אדם ברחבי העולם. מחקרים רבים הראו קשרים חזקים בין השמנת יתר בתפקוד הלב אצל בני אדם, אבל מאמצי המחקר וכלים נוספים יש צורך להבהיר טוב יותר את המנגנונים המעורבים. במשך יותר ממאה, הדגם גנטית מאוד צייתן של דרוזופילה כבר אינסטרומנטלי גילוי גנים מרכזיים, מסלולים מולקולריים אשר הוכיח להיות מאוד שמור על פני מינים. תהליכים ביולוגיים רבים, מנגנוני המחלה באופן פונקציונלי נשמרים בתוך הזבוב, כגון פיתוח (למשל, תוכנית גוף, לב), סרטן, מחלות ניווניות. לאחרונה, המחקר של השמנת יתר, פתולוגיות משני, כגון מחלות לב דגם אורגניזמים, שיחק תפקיד קריטי מאוד הזיהוי של הרגולטורים מפתח מעורב תסמונת מטבולית אצל בני אדם.
כאן, אנו מציעים שתשמש כלי יעיל זה אורגניזם מודל זירוז השמנת יתר, כלומר, הצטברות שומן עודף, ולפתח פרוטוקול יעיל כדי לנטר בצורה של תגיות הצטברות שומן. בנוסף שנשמרת מאוד, אבל פחות מורכבים הגנום, הזבוב יש גם אורך חיים קצר לניסויים מהירה, בשילוב העלות האפקטיביות. מאמר זה מספק נוהל מפורט עבור דיאטה שומן גבוהה (HFD) האכלה דרוזופילה לזירוז השמנה ואת וזמינותו triacylglyceride (תג) של תפוקה גבוהה למדידת העלייה המשויך תכולת השומן, במטרה להיות מאוד לשחזור, יעיל לסינון גנטי או כימיות בקנה מידה גדול. פרוטוקולים אלה מציעים הזדמנויות חדשות ביעילות לחקור מנגנונים רגולטוריים מעורב השמנת יתר, וכן מספקים פלטפורמה סטנדרטית למחקר גילוי סמים בדיקה מהירה של השפעת סמים מועמדים על הפיתוח או מניעת השמנת יתר, סוכרת ומחלות מטבוליות הקשורות.

ד melanogaster, כפי שקורה עם מינים אחרים, יש דו-צורתיות בין זכרים ונקבות22. זה ידוע כי נשים הם גדולים, עם יותר שומן בתוך הבטן שלהם, מאשר זכרים22. כדי לבדוק את האפקטיביות של פרוטוקול שלנו, נוכל לבצע מבחני תג כדי לקבוע ההבדלים בתוכן התג בין זכרים ונקבות ?...

Watch this Scientific Journal Video about High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

זוהי דיאטה שומן גבוהה האכלה פרוטוקול לזירוז ההשמנה דרוזופילה, דוגמנית על הבנת המנגנונים המולקולריים יסודי מעורב lipotoxicity. הוא גם מספק assay triacylglyceride של תפוקה גבוהה למדידת הצטברות שומן דרוזופילה ואת פוטנציאל אחרים מודלים (חרק) בתנאים תזונתיים, סביבתיים, גנטי או פיזיולוגיים שונים.

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

high-fat-diet-feeding-high-throughput-triacylglyceride-assay

Research

JoVE Journal

Genetics

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

11.2K Views.  Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. זוהי דיאטה שומן גבוהה האכלה פרוטוקול לזירוז ההשמנה דרוזופילה, דוגמנית על הבנת המנגנונים המולקולריים יסודי מעורב lipotoxicity. הוא גם מספק assay triacylglyceride של תפוקה גבוהה למדידת הצטברות שומן דרוזופילה ואת פוטנציאל אחרים מודלים (חרק) בתנאים תזונתיים, סביבתיים, גנ...

Video: High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and lowered activity levels. These multifactorial diseases arise from a combination of genetic, environmental, and behavioral factors. One such complex disease is Metabolic Syndrome (MetS), which is a cluster of metabolic disorders, including hypertension, hyperglycemia, and abdominal obesity. Exercise and dietary intervention are the primary treatments recommended by doctors to mitigate obesity and its subsequent metabolic diseases. Exercise intervention, in particular aerobic interval training, stimulates favorable changes in the common risk factors for Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM), Cardiovascular Disease (CVD), and other conditions. With the influx of evidence describing the therapeutic effect exercise has on metabolic health, establishing a system that models exercise in a controlled setting provides a valuable tool for assessing the effects of exercise in an experimental context. Drosophila melanogaster is a great tool for investigating the physiological and molecular changes that result from exercise intervention. The flies have short lifespans and similar mechanisms of metabolizing nutrients when compared to humans. To induce exercise in Drosophila, we developed a machine called the TreadWheel, which utilizes the fly&#39;s innate, negative geotaxis tendency to gently induce climbing. This enables researchers to perform experiments on large cohorts of genetically diverse flies to better understand the genotype-by-environment interactions underlying the effects of exercise on metabolic health.

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel uses rotational motion to gently induce exercise in adult Drosophila melanogaster by exploiting flies&#39; innate, negative geotaxis. It allows for analysis of the interactions between exercise and factors, such as genotype, sex, and diet, and their effect on physiological and molecular assays to assess metabolic health.

TreadWheel: מרווח אימון פרוטוקול בעדינות המושרה תרגיל דרוזופילה melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

שילוב של צריכת המזון כמותיים מבחני והפעלת בכפייה נוירונים ללמוד תיאבון בשנת דרוזופילה

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Behavior

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

מאכיל מיקרו-תפוקה גבוהה לבדיקה לכימות הצריכה בדרוסופילה

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Assay תפוקה גבוהה לבחינת העדפות הטלה של פרט<em&gt; תסיסנית</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Neuroscience

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

דרך פשוטה למדוד שינויים בהתנהגות שוחרת זכה שימוש<em&gt; תסיסנית</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב<em&gt; תסיסנית</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biology

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

כימות צריכת מקרונוטריאנטים במסך עצבי תרמוגנטי באמצעות זחלי דרוזופילה

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate their food environment. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a genetically tractable model organism that is widely used to decipher the molecular, cellular, and neural underpinnings of food preference. To analyze fly food preference, a robust feeding method is needed. Described here is a two-choice feeding assay, which is rigorous, cost-saving, and fast. The assay is Petri-dish-based and involves the addition of two different foods supplemented with blue or red dye to the two halves of the dish. Then, ~70 prestarved, 2-4-day-old flies are placed in the dish and&#160;allowed to choose between blue and red foods in the dark for about 90 min. Examination of the abdomen of each fly is followed by the calculation of the preference index. In contrast to multiwell plates, each Petri dish takes only ~20 s to fill and saves time and effort. This feeding assay can be employed to quickly determine whether flies like or dislike a particular food.

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

We present a protocol for a two-choice feeding assay for flies. This feeding assay is fast and easy to run and is suitable not only for small-scale laboratory research, but also for high-throughput behavioral screens in flies.

מבחני העדפת מזון מהירה בדרוסופילה

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate ...

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

TreadWheel: מרווח אימון פרוטוקול בעדינות המושרה תרגיל דרוזופילה melanogaster

שילוב של צריכת המזון כמותיים מבחני והפעלת בכפייה נוירונים ללמוד תיאבון בשנת דרוזופילה

מאכיל מיקרו-תפוקה גבוהה לבדיקה לכימות הצריכה בדרוסופילה

Assay תפוקה גבוהה לבחינת העדפות הטלה של פרט

דרך פשוטה למדוד שינויים בהתנהגות שוחרת זכה שימוש

את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב

כימות צריכת מקרונוטריאנטים במסך עצבי תרמוגנטי באמצעות זחלי דרוזופילה

מבחני העדפת מזון מהירה בדרוסופילה