שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי הרגולציה הגנטית של היווצרות ותחזוקה של מחסום הדם - מוח במהלך שלבים מרובים של התפתחות דרוסופילה. שיטה זו יכולה גם להיות מותאמת כדי לבחון את החדרות של מחסומים אחרים, כמו אפיתל המעי במגוון אורגניזמים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכה של תפקוד מחסום הדם - מוח ברקמות חיות.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כמו מניפולציות מדגם יכול להיות קשה צעדים רבים דורשים תשומת לב רבה לפרטים. עבור איסוף עוברים מקום מינימום של 50 נקבות בתולה עם 20 עד 25 זכרים לבקבוק עם מזון ארוחה תירס אגר דגירה זבובים אלה במשך יום עד יומיים לפני תחילת האוספים. יום לפני הקולקציה, מיץ תפוחים חם אגר צלחות ב 25 מעלות צלזיוס לילה.

למחרת בבוקר להעביר את זבובים הרדמה פחמן דו חמצני לכלוב איסוף ולה מניחים צלחת אגר מיץ תפוחים מחומם מראש עם כתם קטן של משחת שמרים בקצה הפתוח של הכלוב. ואז לאבטח את הצלחת לכלוב עם השרוול האדום. כדי לנקות עוברים ישנים יותר, לאפשר זבובים להטיל ביצים על צלחת אגר מיץ תפוחים במשך שעה אחת ב 25 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, הפוך את צד רשת הכלוב כלפי מטה והקש על הזבובים לתחתית הכלוב. החלף את אגר מיץ תפוחים עם צלחת חדשה מראש מיץ תפוחים אגר עם כתם קטן של משחת שמרים. אפשר לזבובים להטיל ביצים על הצלחת החדשה למשך שעה נוספת ב-25 מעלות צלזיוס.

כדי לאסוף בשלב מאוחר 17 עוברים להזרקה, להחליף את צלחת אגר מיץ תפוחים עם צלחת חדשה מראש מחומם עם כתם של משחת שמרים. ולאפשר לזבובים להטיל ביצים על הצלחת ב-25 מעלות צלזיוס. לאחר שעה, להחליף את הצלחת גיל הצלחת עם עוברים שנאספו במשך 19 שעות ב 25 מעלות צלזיוס, כך העוברים יהיו 20 עד 21 שעות בזמן ההדמיה.

בסוף הדגירה של 19 שעות, להסיר את צלחת איסוף העובר מהאינקובטור ולכסות את פני השטח של הצלחת עם PbTx. השתמש במברשת צבע כדי לשחרר את העוברים מפני השטח של הלוח לתוך מסננת רשת ניילון 70 מיקרומטר. ומציבים את המסננת עם עוברים בתספורת אקונומיקה של 50% בצלחת פטרי של 100 מילימטר במשך חמש דקות עם תסיסה מזדמנת בטמפרטורת החדר כדי לפענח אותם.

בסוף הדגירה, לשטוף את העוברים שלוש פעמים על ידי מערבולת מסננת PbTx טרי, באמצעות צלחת פטרי חדשה עבור כל לשטוף. לשטוף עוברים לצד אחד של מסננת עם PbTx ולהשתמש פיפטה זכוכית להעביר את העוברים על לוח ג'ל 2% agarose. הסר את הנוזל העודף עם נייר סינון.

יישר שישה עד שמונה עוברים על הלוח עם האחוריים מימין ואת הצדדים הגביים פונים כלפי מעלה ולחץ בחוזקה על פיסת קלטת דו צדדית מודבקת על שקופית על גבי העוברים. לאחר מכן לתעב את העוברים בטמפרטורת החדר במשך כ 25 דקות לפני כיסוי הדגימות עם שמן Halocarbon. עבור אוסף זחל, להקים צלב עם 5 עד 10 זבובים נקבה בתולה של הגנוטיפ הרצוי וחצי זכרים רבים של הגנוטיפ הרצוי בקבוקון עם מזון קמח תירס אגר.

לאחר חמישה עד שבעה ימים ב 25 מעלות צלזיוס, בהתאם לגנוטיפ, להשתמש במקלפים כדי לאסוף בעדינות זחלים instar השלישי נודד מן הבקבוקון ולשטוף את הזחלים עם PBS כדי להסיר כל מזון תקוע. מעבירים את הזחלים לצלחת אגר מיץ תפוחים לגנוטיפינג לפי הצורך לפני השימוש במברשת צבע לייבוש הזחלים על רקמה. לאחר מכן השתמש במדפים כדי להעביר שישה עד שמונה זחלים לשקופית מוכנה עם קלטת דו צדדית.

לפני ההזרקה, השתמשו במוציא מיקרופיפט כדי למשוך צינורות נימי לצורת מחט סטנדרטית לזריקות D.Melanogaster ועגנו את המחטים בחימר בצלחת פטרי. להזרקת עוברים, השתמשו בקצה פיפטה להעמסת ג'ל 20 מיקרוליטר כדי לטעון מחט מוכנה עם 5 מיקרוליטרים של 10 ק"ג דקסטרן מצומדים לסולפורהודאמין 101 חומצה כלוריד ולהעמיס את המחט לתוך מחזיק מחט. מקם את המחט במיקרומניפולטור מאובטח לבסיס פלדה והגדר את מנגנון ההזרקה ל-50 פאונד לאינץ' מרובע ו-5 עד 10 אלפיות שנייה עם טווח של 10.

מניחים את השקופית על שלב micromanipulator ולהבריש את קצה המחט על קצה הסרט דו צדדי בזווית של 45 מעלות כדי ליצור קצה זוויתי מעט שבור רק מספיק כדי לאפשר זרימה של 10 דקסטרן קילודלטון דרך הפתח. לשאוב את דוושת הרגל עד הצבע הוא בקצה המחט. ליישר את המחט, כך שהוא מקביל עם העובר ולנקב את הקצה האחורי של הדגימה.

לשאוב את דוושת הרגל כדי להזריק שני nanoliters של צבע לתוך הדגימה. שים לב לזמן ההזרקה למטרות דגירה והמשך במורד השקופית כדי להזריק דגימות נוספות. עבור הזרקת זחל, לעשות פתח זוויתי מעט גדול יותר מזה המשמש להזרקת עוברים זווית המחט מעט כלפי מטה לכיוון הדגימה לפני הזרקת הזחלים עם 220 nanoliters דומה כפי שהוכח עבור דגימות עובריות.

בסוף הדגירה הזרקה 10 דקות, להשתמש במוליך כותנה הטה להחיל ג'לי נפט בצד ימין ושמאל של הדגימות על המחוון כמרחב. מקם את החלק העליון של המכסה והצב את השקופית על שלב המיקרוסקופ הקונפוקל. בחר את המטרה 20X ותמונה את הדגימות לאורך העומק של כל עובר.

לאחר מכן לחשב את אחוז הדגימות עם מחסום דם - מוח בסכנה על פי הנוסחה. לפני תחילת הליך הניתוח, השתמש בלק כדי לטעון שתי תלושי כיסוי במים של כ- 0.5 ס"מ זה מזה על שקופית והצב זחל מוזרק ל- PBS במגלשה בסוף הדגירה של 30 דקות. באמצעות זוג אחד של ממטרות, לתפוס את הזחל באמצע הדרך במורד גוף הזחל ולהשתמש זוג שני של ממטרות להפריד את החצאים האחוריים של הזחל.

לאחר מכן, השתמשו בזוג ממטרות אחד כדי לאחוז באזור האחורי של ווים בפה ולהשתמש בזוג המדפים השני כדי להפוך את קיר הגוף מעל קצה זוג המדפים הראשון. המוח וחוט העצב הגחון ייחשפו. הפרד את המוח ואת חוט העצב הגחון מקיר הגוף על ידי ניתוק העצבים במידת הצורך והסרה את קיר הגוף מהמגלשה.

מכסים את הדגימה עם 10 מיקרוליטרים של 80% גליצרול. לאחר מכן מניחים תלוש כיסוי על גבי המדגם להדמיה ותמונה הדגימות כדי לקבוע את אחוז הדגימות עם מחסום דם - מוח בסכנה כפי שהוכח. כאשר סוג הבר בשלב מאוחר 17 עוברים מוזרקים עם 10 קילדלטון dextran מצומד סולפורהודאמין 101 חומצה כלוריד פלואורסצנטי צבע, מולקולת dextran גדולה נשללת חוט העצב הגחוני, כצפוי.

עוברים מוטנטים גולמיים הטרוזיגים 1 מפגינים מחסום דם -מוח שלם, דומה לזה שנצפה בעוברים בקרת סוג בר. לעומת זאת, עוברים מוטנטים גולמיים הומוזגוגיים 1 מפגינים פגמים בשלמות מחסום הדם - מוח, כאשר 10 ק"ג דקסטרן מציף את חוט העצב הגחוני, מה שמצביע על כישלון מחסום הדם - מוח להיווצר. בדגימות זחל בקרת סוג בר, 10 קילדלטון dextran אינו מצליח לחדור את מחסום הדם - מוח והוא נשלל מן המוח ואת חוט העצב הגחוני.

בעת ניסיון הליך זה, הזדקנות נאותה של העוברים היא קריטית כדי להבטיח את הדגימות נבדקות בגיל שבו היווצרות מחסום הדם - מוח צפוי להיות שלם. בעקבות הליך זה, ניתן לקדם מוטציות המציגות מחסום דם-מוח בסכנה באמצעות גנטיקה, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיה כדי להבין טוב יותר את תפקוד הגנים ברמה התאית. טכניקה זו תאפשר לחוקרים לזהות גנים נוספים הקריטיים להקמה ותחזוקה של מחסום הדם - מוח.