עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע ולהעניק טכנולוגיה מעניקה MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, מכוני מחקר הבריאות הלאומי NHRI-EX106-10429NI, התוכנית מרכז מחקר אזורים נבחרים מענק משרד החינוך באמצעות מרכז מחקר המוח, האוניברסיטה הלאומית יאנג מינג בטייוואן, ומענקים בתר MOST106-2811-B-010-031 (ס-ווי. סי), MOST105-2811-B-010-036, MOST106-2811-B-010-030 (ה-Y.K.).

הפרוטוקולים בעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש ועדות של נבחרת יאנג מינג אוניברסיטת.
1. הכנה של בעל הגורים Neonatal במנגנון Stereotaxic
<ol><li>להפוך את המגש בראש: לחתוך התחתון של שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL (15 מ מ אורך) לתוך הצורה שמתאימה לראש של הגורים neonatal על-ידי הסרת 1/5 של הקיר של הצינור.</li>
	<li>קח קופסא עצה פיפטה עם הגודל הנכון שמתאים בעזרת המעמד של המנגנון stereotaxic, להסיר את המכסה העליון. מוספית את מגש ראש המבושלות שלב 1.1 וקלטת ההטבעה רקמות על גבי הבסיס של עצה מגש עם דבק חם נמס. הגובה בקלטת ההטבעה הרקמה הוא 7 מ מ, אשר נמצא בשימוש כדי לתמוך הצוואר וגוף של הכלבלב בתפקיד ראש-קבוע.</li>
	<li>מקם את כל ההתארגנות מנגנון stereotaxic רגיל.</li>
</ol>2. הכנת 30G מחטים הזרקת פלדת אל-חלד
<ol><li>מחטים נקיות מראש של מזרק 30 G בהשריה ב כלורופורם 3 ימים.</li>
	<li>להשתמש מלקחיים לסגת לאט ובזהירות את המחט מ שלה רכזת פוליפרופילן ברדס כימי.</li>
	<li>לשטוף את המחטים עם אתנול מוחלטת במשך 20 דקות ולאחריו שטיפות אתנול 70% 3 × 10 דקות על מטרף ב-50 סל ד. תנו לאוויר מחטים יבש, ולאחסן את המחטים נקי בתוך קופסה נקיים בטמפרטורת החדר (RT) עד השימוש.</li>
</ol>3. מכינים את מתאם עבור צינורות Microinjection
<ol><li>לחבר את המזרק microliter מחט ההזרקה 30G עם צינור פוליאתילן PE10 (PE10 tube). היכונו גישור המחט הזרקת ואת המזרק microliter מתאם אבובים (PE20 tube) PE20 פוליאתילן. השימוש המתאם הכרחי, מכיוון הקוטר של הצינור PE10 הוא קטן בהרבה מזה של המחט של המזרק microliter 26 גרם.</li>
	<li>להכין את הצנרור על המזרק microliter: לחבר את המחט הזרקת 30 G מראש נקי עם 5 ס מ PE20 צינור, ויסגור לצומת עם ודבק. מתאם אבובים הזה הוא לשימוש חוזר. הערה: אם המחט של מזרק microinjection 30 גרם, הכנה (שלב 3.1) והשימוש (שלב 3.3) מתאם זה אין צורך.</li>
	<li>םאתמה תא אבובים (להכין בשלב 3.1) בעזרת מזרק microliter (10 µL).</li>
	<li>חבר קצה אחד של הרכבת התחתית PE10 (לא יותר מ- 60 ס מ) על המחט 30 גרם של מתאם אבובים PE20. הר מחט ההזרקה 30G החדש אל הקצה השני של הצינור PE10.</li>
</ol>4. לטעון את הצינור Microinjection עם מים מזוקקים בלוק, צבען ווירוסים
<ol><li>הסר את הבוכנה של המזרק microliter. השתמש מזרק 25 גרם כדי לטעון את המזרק microliter ושפופרת שלה מחובר PE עם מים מזוקקים בלוק להסיר את האוויר הצנרת.</li>
	<li>מקם את הבוכנה בחזרה אל המזרק microliter ולאחר ללחוץ על הבוכנה עד µL 2 שרידי מים מזוקקים בקנה. אל תתנו הנפח של מים מזוקקים הפך נמוך יותר 2 µL.</li>
	<li>הר בקפידה את המזרק microliter אל משאבת מזרק קצב זרימת מיקרו.</li>
	<li>פיפטה כמויות קטנות של צבען 0.1% ירוק (מוכן ב- saline 0.9% וסינון במסנן מיקרומטר 0.22) ונוזלים וירוס בחתיכת עץ על מצלמות-מיקרוסקופים.</li>
	<li>תיסוג כמות קטנה של אוויר לחשיפה בועת אוויר בצומת בין מחט הזריקה 30 גרם שפופרת PE10 ואחריה טעינה 0.7 µL של ירוק מהיר המסונן לאמבטיה כדי לבדוק את זרימת הנוזלים על הצנרת microinjection.</li>
	<li>לסגת עוד כמות קטנה של אוויר כדי להפוך את בועת האוויר השני ואחריו העמסת נוזלים וירוס לתוך הצנרת microinjection.</li>
	<li>לצרף ולאבטח את המחט microinjection 30G את הזרוע של המנגנון stereotaxic.</li>
</ol>5. הרדמה של עכברים Neonatal מאת היפותרמיה
<ol><li>למקם את הכלבלב בשרוול כפפת לייטקס, לטבול אותו בקרח כתוש עד הצוואר למשך 5 דקות.</li>
	<li>לצבוט הרגליים של הכלבלב עם מלקחיים כדי לוודא כי אין תגובה משיכה של הרגליים.</li>
	<li>למקם את הגור עם כפפת לייטקס שרוול במגש הראשי, לשים קרח כתוש סביב שרוול גומי כדי לשמור אותה בקירור של היפותרמיה הרדמה.</li>
	<li>הוטרינר משחה למרוח את העיניים של גור למניעת יובש תוך בהרדמה במידת האפשר.</li>
</ol>6. microinjection
<ol><li>הכן ניתוח סטרילי על ידי ניגוב המכשיר stereotaxic ביסודיות עם 70% אתנול. לחטא את כלי כירורגי במועט אותם 70% אתנול.</li>
	<li>לנקות את הראש של הכלבלב עם 70% אתנול. לאתר של למדא ציון על הגולגולת ולסמן את למבדה עם עט מרקר. לכוון את מחט למדא, והגדר את הקדמי-אחוריים (AP) והקואורדינטות המדיאלי-לרוחב (ML) כאפס.</li>
	<li>להזיז את היד הזרקת לאתר היעד על פי הקואורדינטות X ו- Y של אתר היעד. עבור סטריאטום יום לאחר הלידה (P) 2 גורים, הקואורדינטות הן: AP, +2.4 מ מ, והשתרשה עמוק בלבה למדא; מל ', ±1.0 מ מ לרוחב מן האמצע; הגבי-הגחוני / (DV), −1.7 מ מ הגולגולת. לסמן את המיקום של צבע ירוק PE10 צינור עם עט.</li>
	<li>להפיל את המחט הזרקת 30G לאט לחדור דרך העור הגולגולת ולאחר מכן להעלות קצה המחט עד לעצירתו על פני השטח של הגולגולת. הגדר הקואורדינטה DV כאפס.</li>
	<li>להפיל את המחט הזרקת 30G באיטיות עד שהוא מגיע הקואורדינטה DV אתר היעד. המתן 1 דקות לאפשר parenchyma חידוש צורתו נורמלי. הפעל את התוכנית microinjection (nL 100 לדקה).</li>
	<li>ודא כי הסימן של צבע ירוק הוא נע צינור PE כדי להבטיח שהנוזל הוירוס מוזרק לתוך המוח.</li>
	<li>המתן 1 דקות םכסהה microinjection, ולאחר מכן לאט, בהדרגה להעלות את המחט לגובה 1/2 של DV עומק בתוך 30 s. לאחר 30 s, לאט לאט למשוך את המחט מהראש של הגורים.</li>
	<li>חזור על שלב 6.2 ל 6.7 עד השלמת את microinjections של כל אתרי יישוב.</li>
</ol>7. ההחלמה שלאחר הניתוח של הכלבלב
<ol><li>לחמם הגורים למשך 20 דקות בחממה 33 מעלות. בדוק את ההתאוששות של הכלבלב מהרדמה היפותרמיה כל 5 דקות עד הכלבלב שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.</li>
	<li>להחזיר את הכלבלב בחזרה אל הסכר אחרי הכלבלב הוא התאושש לחלוטין.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Athos, J., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+stereotaxic+surgery+in+mice.">High precision stereotaxic surgery in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4A.1-A.4A.9 (2001).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+neuroscientists.">DREADDs for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li><li>Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits.">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).</li><li>Tau, G. Z., Peterson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+development+of+brain+circuits.">Normal development of brain circuits.</a> Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).</li><li>Mitchell, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+neurodevelopmental+disease.">The genetics of neurodevelopmental disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).</li><li>Sahin, M., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+circuits,+and+precision+therapies+for+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders.">Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders.</a> Science. 350 (6263), (2015).</li><li>Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+microinjection+of+viral+vectors+expressing+Cre+recombinase+to+study+the+role+of+target+genes+in+cocaine+conditioned+place+preference.">Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference.</a> J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).</li><li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice:+a+neurosurgical+point+of+view.">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).</li><li>Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microinjection+technique+for+targeting+regions+of+embryonic+and+neonatal+mouse+brain+in+vivo.">A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo.</a> Brain Res. 1307, 43-52 (2010).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+controls+synaptic+wiring+of+corticostriatal+circuits+and+vocal+communication+by+opposing+Mef2c.">Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c.</a> Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).</li><li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neostriatal+mosaic:+multiple+levels+of+compartmental+organization+in+the+basal+ganglia.">The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia.</a> Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+regional+viral+injection+in+neonatal+mice+enables+structural+and+functional+interrogation+of+defined+neuronal+populations+throughout+targeted+brain+areas.">Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas.</a> Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

במחקר הנוכחי, נדגים שיטה פשוטה ואמינה stereotaxic עבור הזרקת AAV וירוסים לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal. אנחנו microinjected AAV-eGFP-Cre וירוסים לתוך סטריאטום של עכברים כתב Ai14-P2 ולאחר מכן נותחו בביטוי הגן כתב ב P14. מצאנו ש-AAV transduced תאים GFP-חיובית לאורך כל סטריאטום ברמות rostrocaudal. יתר על כן, כמעט כל התאים GFP-חיובי?...

מחקרים מודרניים של המבנה והתפקוד של המוח בדרך כלל דורשים מניפולציה גנטית של גנים ספציפיים בתוך תאים עצביים. כדי לחקור את הפונקציות של גנים שונים, העכברים הטרנסגניים נושאת אללים mutant, כולל נוק אאוט, טוק-in אללים באופן שגרתי נוצרו. ניתוח מוח stereotaxic למכרסמים למבוגרים היא שיטה סטנדרטית מקומית לספק סמים, וירוסים, המשדרים, אחרים אזורים ספציפיים של המוח מכרסמים1,2. החלת ניתוח מוח stereotaxic את העכברים הטרנסגניים מתיר אחד גנטית לתפעל את תפקוד הגן ואת פעילות. עצבית באוכלוסיות ספציפיות עצביים במוח העכבר. המניפולציה ייחודיים לסוג התא מספקת גישה רב-עוצמה לפענח עצביים פונקציות מורכבות את המעגלים העצביים של המוח3,4,5.
התפתחות עצבית של מערכת העצבים מתחילה אצל בשלבים עובריים מוקדמים ולהמשיך התהליכים התפתחותית לאחר הלידה עד תקופת ילדותי. כמחנכת ההבשלה של מערכת העצבים כולל את החיווט סינפטית מדויק של המעגלים העצביים, שהוא חיוני עבור פונקציות פיזיולוגיים, קוגניטיביים של המוח6. לכן, לימוד התפתחותית אירועים שמתרחשים בחלונות זמן neonatal חשוב לא רק להבנת התפתחות עצבית רגילה, אך זה עשויים גם כן לספק תובנות בפתוגנזה של התפתחותיות והפרעות מנוטלי7 ,8. למרות שיטות ניתוח מוח stereotaxic למכרסמים למבוגרים הם זמינים2,9, כמה פרוטוקולים זמינים באינטרנט עבור ניתוח מוח stereotaxic עכברים neonatal10,11. למעשה, microinjections stereotaxic של ריאגנטים לתוך מוחותיהם של העכבר neonatal הגורים קשים, כי ראשו של הגור neonatal חלש מכדי להיות קבוע במנגנון stereotaxic רגיל. עם זאת, היישום של ניתוח מוח stereotaxic העכברים הטרנסגניים הוא ריאלי עבור עכברים neonatal12. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה עם מלכודת תוצרת בית כדי לבצע ניתוח מוח stereotaxic ב העכבר היילוד הגורים. נדגים כי טכניקה זו מאפשרת למחיקת מותנית גנים floxed על ידי microinjecting recombinase לבטא AAV Cre DNA לתוך סטריאטום של הכתב ג'ין עכברים, מותנה העכברים הטרנסגניים floxed. טכניקה זו ישימה גם כדי לספק ריאגנטים לתוך סטריאטום neonatal של פראי-סוג עכברים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1134">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">30G PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">REF 305106</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Chloroform</td>
			<td style="width:273px;">JT Baker</td>
			<td style="width:199px;">9180-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Hamilton MICROLITER Syringe</td>
			<td style="width:273px;">Hamilton&#160;</td>
			<td style="width:199px;">80300</td>
			<td style="width:395px;">30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Polyethylene tubing PE20</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Polyethylene tubing PE10</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Micro Flow Rate Syringe Pump</td>
			<td style="width:273px;">Longer Precision Pump Co.</td>
			<td style="width:199px;">TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">25G syringe</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">REF 302105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Fast green</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:199px;">F-7252</td>
			<td style="width:395px;">0.1%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Standard Stereotaxic Instruments</td>
			<td style="width:273px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:199px;">68037</td>
			<td style="width:395px;">Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Anti-FOXP2 antibody</td>
			<td style="width:273px;">Abcam</td>
			<td style="width:199px;">ab16046</td>
			<td style="width:395px;">Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4K</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Anti-RFP antibody</td>
			<td style="width:273px;">Abcam</td>
			<td style="width:199px;">ab65856</td>
			<td style="width:395px;">Mouse monoclonal to RFP, 1:1K</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">BX63 microscope</td>
			<td style="width:273px;">Olympus</td>
			<td style="width:199px;">BX63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">LSM 880 confocal microscope</td>
			<td style="width:273px;">Zeiss</td>
			<td style="width:199px;">LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594</td>
			<td style="width:273px;">Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.</td>
			<td style="width:199px;">111-585-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40</td>
			<td style="width:273px;">Penn Vector Core</td>
			<td style="width:199px;">AV-9-PV1848</td>
			<td style="width:395px;">Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">AAV9.chicken actin-eGFP</td>
			<td style="width:273px;">AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan</td>
			<td style="width:199px;">N/A</td>
			<td style="width:395px;">1x1014 (GC/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:269px;">B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td style="width:273px;">The Jackson Labtorary&#160;</td>
			<td style="width:199px;">007914</td>
			<td>Ai14</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ</td>
			<td style="width:273px;">The Jackson Labtorary&#160;</td>
			<td style="width:199px;">026259</td>
			<td style="width:395px;">Foxp2fl/fl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:273px;">Corning&#160;cellgro</td>
			<td style="width:199px;">21-030-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains

גנים רבים באים לידי ביטוי מוח עובריים, חלק מהם מתבטאים באופן רציף במוח לאחר הלידה. עבור גנים ביטוי בהתמדה כאלה, הם עשויים לפעול כדי לווסת את תהליך התפתחותי ו/או תפקיד פיזיולוגי במוח neonatal. לחקור פונקציות הנוירוביולוגי של גנים ספציפיים במוח, זה חיוני כדי להשבית את הגנים במוח. כאן, אנו מתארים שיטה stereotaxic פשוטה כדי להשבית ביטוי גנים ב סטריאטום של העכברים הטרנסגניים ב windows בפעם neonatal. וירוסים AAV-eGFP-Cre היו microinjected לתוך סטריאטום Ai14 כתב ג'ין עכברים ביום כמחנכת (P) 2 באמצעות ניתוח מוח stereotaxic. בביטוי הגן כתב tdTomato זוהה סטריאטום P14, רומז ש-cre-loxP מוצלח מתווכת רקומבינציה DNA בתאים AAV transduced striatal. אנחנו עוד יותר תוקף טכניקה זו על-ידי microinjecting וירוסים AAV-eGFP-Cre לתוך P2Foxp2חליל/חליל עכברים. תיוג הכפול של ה-GFP, Foxp2 הראה כי תאים GFP-חיוביות חסרה Foxp2 immunoreactivity ב סטריאטום P9, רומז על אובדן Foxp2 החלבון בתאים striatal AAV-eGFP-Cre transduced. יחדיו, תוצאות אלו מדגימות של מחיקה גנטי אפקטיבי על ידי וירוסים stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre באוכלוסיות עצביים מסוימים במוחם neonatal של העכברים הטרנסגניים floxed. לסיכום, הטכניקה stereotaxic שלנו מספק פלטפורמה פשוטה וקלה עבור הנדסה גנטית במוח העכבר neonatal. הטכניקה לא ניתן להשתמש רק כדי למחוק גנים באזורים ספציפיים של המוח neonatal, אבל זה גם יכול לשמש כדי להזריק סמים תרופתי, המשדרים עצביים, optogenetics מהונדסים, chemogenetics חלבונים, אינדיקטורים פעילות. עצבית ו ריאגנטים אחרים לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal.

על הסט הראשון של הניסוי, אנחנו microinjected 200 nL של וירוסים AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (AAV-eGFP-Cre, 1/10 דילול בתוך תמיסת מלח של Dulbecco פוספט buffered) המבטאים את recombinase Cre DNA התמזגו עם GFP לתוך סטריאטום P2 של עכברים Ai14. העכברים Ai14 אקספרס tdTomato מדווח על בתיווך Cre מחיקה של מלון loxP (floxed) עצור קלטת (<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains at JoVE.com

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal

אנו מתארים פרוטוקול של ניתוח stereotaxic עם מכשיר ביתי הראש-קבוע עבור ריאגנטים microinjecting לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה גנטית ב תאים עצביים של אזורים ספציפיים של מוח העכבר neonatal.

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

stereotaxic-surgery-for-genetic-manipulation-striatal-cells-neonatal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K Views.  National Yang-Ming University. אנו מתארים פרוטוקול של ניתוח stereotaxic עם מכשיר ביתי הראש-קבוע עבור ריאגנטים microinjecting לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה גנטית ב תאים עצביים של אזורים ספציפיים של מוח העכבר neonatal.

Video: Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

מכרסמים כירורגיה Stereotaxic ועל צער בעלי חיים שיפורים תוצאה של ההתנהגות Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

דיסקציה והתרבות של עכבר דופאמין ו Explants Striatal ב תלת ממדי מבחני מטריקס קולגן

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

ניתוח Stereotaxic על הנגע Excitotoxic של אזורי מוח ספציפיים עכברוש למבוגרים בלבד

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית: הדמיה העכבר גנגליון תאים In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...