This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

.1 הכנת ריאגנטים לאטקס בבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שנאגרו מלוח גליצין (GBS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 גליצין גרם, נתרן כלורי 11.7 גרם ושל מים מזוקקים 100 מ&quot;ל לכוס זכוכית 200 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים להמסה באמצעות stirrer מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התערובת ל500 מ&quot;ל מדידת צילינדר ולהוסיף מים מזוקקים כדי להפוך כולל של 200 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון בחזרה לכוס 200 מ&quot;ל, לבדוק את רמת החומציות ולהתאים ל8.2 עם הידרוקסיד 5 M נתרן. הערה: הידרוקסיד הנתרן הוא מאכל, ללבוש ציוד מגן אישי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר את הפתרון באמצעות 0.22 מיקרומטר מסננים וכמה 60 מ&quot;ל מזרקים לתוך בקבוק זכוכית מ&quot;ל preautoclaved בורג כתרים 250. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחסן ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של GBS עם 0.2% אלבומין בסרום שור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.2 גרם של אלבומין בסרום שור אבקה (BSA) ושל GBS 100 מ&quot;ל לכוס זכוכית 200 מ&quot;ל ולערבב לפזר באמצעות stirrer מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנןלעקר את הפתרון באמצעות 0.22 מיקרומטר מסננים באמצעות מספר מזרקים 60 מ&quot;ל לבקבוק זכוכית כתרים מ&quot;ל preautoclaved בורג 250. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב 4 ° C.. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה מגיב לאטקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל 2 מ&quot;ל עגול צינור microfuge תחתון. הערה: סיבוב צינורות תחתון משמשות כדי למזער יישוב חלקיקים אשר עשוי להשפיע קובץ מצורף נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה P1000 עם טיפים סטרילי להוסיף 975 μl של GBS לתוך צינור microfuge, ולאחר מכן להוסיף 25 μl של antiserum דלקת ריאות המתאים עבור מגיב הלטקס שמכין (כלומר, בריכה, קבוצה, סוג או גורם). הפוך חמש פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל חלקיקי לטקס פוליסטירן 01:10 ידי הוספת 120 μl של חלקיקי לטקס ל1,080 μl של תמיסת מלח פיסיולוגי סטרילי. הערה: זה יכול להתבצע בכמויות גדולות יותר, אבל צריך להיעשות טרי בכל פעם ריאגנטים הלטקס מיוצרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1,000 μl של ההשעיה 01:10 לטקס (מוכנה בשלב 1.3.3) ל1,השעיה 000 μl 01:40 antiserum (מוכן בשלב 1.3.2). הפוך חמש פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C על גלגל מסתובב לאט (לדוגמא, 4 סל&quot;ד גלגל בקוטר 38.5 סנטימטר) עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ל15 דקות ב 1,100 x גרם. בטל supernatant ועדינות resuspend גלולה ב2 מ&quot;ל של תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ל15 דקות ב 1,100 x גרם. בטל supernatant ולהוסיף 1 מ&quot;ל של GBS ובעדינות resuspend גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ההשעיה הלטקס לתוך 5 מ&quot;ל שכותרתו בורג כתרים צינור. הוסף 1 מ&quot;ל נוסף של GBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של GBS מכיל 0.2 BSA% (w / v) (pH 8.2) (מוכן בשלב 1.2). הוסף 40 μl של 10% (w / v) פתרון של אזיד הנתרן כחומר משמר. הערה: יזיד הנתרן הוא מסוכן אם בשאיפה, והוא גירוי עור ועיניים. רצוי לרכוש פתרון 10% מוכנים ולא צורת האבקה, כמו זה ממזער את הסיכון של חשיפת משאיפת. ציוד מגן אישי (כולל כפפותמשקפי סנסציה ד) צריכים להיות משוחק בעת הטיפול מגיב זה. עיין בגיליון נתוני בטיחות של חומרים לפרטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים לטקס חנות ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של מגיב לטקס ביקורת שלילית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל 2 מ&quot;ל עגול צינור microfuge תחתון. הערה: סיבוב צינורות תחתון משמשות כדי למזער יישוב חלקיקים אשר עשוי להשפיע קובץ מצורף נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה P1000 עם טיפים סטרילי להוסיף 975 μl של GBS לתוך צינור microfuge, ולאחר מכן להוסיף 25 μl antiserum ארנב הרגיל. הפוך חמש פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך כמו בשלבי 1.3.3 ל1.3.10 לעיל </li></ol></li></ol> .2 בקרת איכות (QC) של ריאגנטים לאטקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא מגיב לטקס לRT. מייד לפני השימוש, לערבב בעדינות מגיב לטקס על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק מגיב לautoagglutination ידי pipetting 15 μl לשקופית מיקרוסקופ זכוכית והמשך כבצעדים 4.7 ו4.8 להלן. לא צריך להיות שוםgglutination של חלקיקי הלטקס. מגיב אמורה להופיע לבן וחלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המגיב נגד פנל של בידודי דלקת ריאות מעבר נמוך. השתמש בתרבויות טריות גדלו מוכנות כמו בשלב 3 הפנל של בידודים צריך לכלול נגזרות של סרוטיפ &#39;היעד&#39; (סרוטיפ הספציפי למגיב נבדק) וזנים אל &#39;אינו יעד &quot;(נגזרות של סרוטיפים אחרים שלא צריך בדרך כלל לעבור מגיב עם המגיב). כולל בודד לפחות אחד מכל סוג סרוטיפ יעד ולא יעד עבור כל מגיב לטקס עובר QC. אם יש רק אחד יעד או serotype אינו היעד, בדיקת שני בידודים שונים של סרוטיפ המסוים. הערה: פנל הבדיקה צריך לכלול מספר בידודים של כל serotype, שחלקם נדירים במחלה פולשנית ו / או אוספי תרבות סוג. עדיף לכלול כמה מרכבה מבודדת, כפי שהם לעתים קרובות יותר תובעניים לסרוטיפ (מידע לא מוצג), ובכך בודקים את o הקיבולת נוספתf ריאגנטים ולהבטיח כי חומרים כימיים עשויים מסוגלים serotyping שני פולשנית וכרכרה מבודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך בבדיקות של חומרים כימיים לטקס עם יעד ודלקת ריאות שאינם יעד מבודד לפי השיטה המתוארת בשלבי 3 ו -4 להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים בקרת איכות בזמן ייצור ולאחר מכן לפחות אחת לשנה לאחר מכן. הערה: אם מגיב לא עובר QC, אצווה חייב להיות מושלך והכנה חדשה שנעשתה. במקרה של כישלון QC חוזר אנו ממליצים על חומרים כימיים שמיוצרים תוך שימוש בשיטות החלופיות שמתוארות בOrtika et al. 2013 8 ובדיון שלהלן. </li></ol> .3 הכנת תרבויות דלקת ריאות לSerotyping <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות לולאת סטרילי לבחור מושבה אחת של דלקת הריאות לבודד ופס זה החוצה אל אגר דם לא סלקטיבי מוצק, כך שהבידוד העיקרי מכסה כשליש ממשטח הצלחת. Streak למושבות אחת. הערה: לוחות שהוכנו מסוס defibrinated או דם כבשים מתאימים; אבל צלחות דם מוכנות עם דם אדם או דם של בעלי החיים citrated אינן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה O הצלחת / N על 37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לצמיחה על הצלחת לטוהר ולהעריך שיש צמיחה מספיק לserotyping. הערה: תרבות טהורה של בודד דלקת הריאות נדרשת לserotyping. מהניסיון, ומחוברות, או בסמוך מחוברות הצמיחה שלנו מכסה כשליש ממשטח הצלחת הוא בדרך כלל מספיק על מנת להשלים serotyping. כתרבויות דלקת ריאות עלולות להיות מועדות לautolysis, תרבויות מוכנות לserotyping צריכה להיבדק בתוך 24 שעות של תת תרבות. אל תיקח את צלחת התרבות מחוץ לחממה יותר מ 15 עד 20 דקות לפני serotyping מתחיל. </li></ol> .4 Serotyping אטקס התלכדות ניצוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל חומרים כימיים הלטקס ממקרר ולאפשר להם לחמם לRT למשך כimately 30 דקות. מייד לפני השימוש, בעדינות להפוך את הצינורות כדי לערבב את חומרים כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 15 μl של מגיב לטקס שליטה שלילי לשקופית מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות μl 1 לולאה חד פעמית סטרילי לקחת תנופה של תרבות דלקת הריאות, כך שהלולאה היא כמחצית מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למרוח הבידוד על פני השטח של השקופיות קרובות לירידה של מגיב לטקס ביקורת שלילי. הבידוד צריך להיות גלוי בשקופית הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות וביסודיות לערבב הבידוד למגיב לטקס שליטה השלילי באמצעות הלולאה. ודא כי הירידה אינה מתפשטת עוד יותר מאשר הגודל ההתחלתי שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את השקופית, מחזיקים אותו בשני הקצוות. רוק השקופיות קדימה ואחורה דקות 1. תשמור על עצמך כדי לשמור על הנוזל נע באיטיות, ולהבטיח שהגודל של הירידה לא להגדיל. הערה: לחלופין להשתמש בכיסא נדנדה צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב להתלכדות מקרוסקופית (כלומר, על ידיבעין בלתי מזוינת) וסליקה של ההשעיה על רקע שחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מגיב לטקס ביקורת השלילי לא מראה התלכדות או סליקה להמשיך בדיקות התרבות, החלפת חומרים כימיים לטקס מבחן למגיב לטקס שליטה השלילי בצעדי 4.1-4.8 לעיל. לולאה טרי יש להשתמש בכל פעם. להמשיך בבדיקות של חומרים כימיים לטקס מתחילים עם הבריכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כל אחד מהחומרים הכימיים &#39;הבריכה&#39; לטקס ברציפות עד בדיקה חיובית מתקבלת. הערה:. סדר הבדיקה של הבריכות ניתן לעשות זאת ב&#39;סיבובים &#39;כדי לשקף את השכיחות המקומית של זנים אל מסוימים (למשל, על ידי בדיקת שלוש בריכות ככל הנראה בשקופית הראשונה אם תגובה חיובית ולא התקבל, לאחר מכן מבחן הבא שלוש הסיכוי הטוב ביותר של הבריכות שנותרו בשקופית השנייה, וכן הלאה עד שתגובה חיובית מתקבלת). הדבר מבטיח כי קפסיד הנפוצים ביותר נבדקים ראשון, צמצום הזמן וריאגנטים צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">באמצעות המקש של יצרן antisera לקבוע איזה פרט antisera מיוצג בבריכה החיובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן כל אחת מהקבוצות או הסוגים הכלולים בבריכה החיובית בנפרד כדי לקבוע את &quot;הקבוצה&quot; או &quot;סוג&quot; כמו בשלבים 4.1-4.8 לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את התוצאה על ידי התייחסות למפתח של יצרן antisera. אם &#39;סוג&#39; נקבע (לדוגמא, סרוטיפ 5), אז אין בדיקות נוספות נחוצה ותוצאה זה נרשמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם &quot;קבוצה&quot; נקבעה (לדוגמא, קבוצה 19), ולאחר מכן עיין במפתח היצרנים כדי לקבוע את הגורמים להיבדק. המשך בדיקות עם חומרים כימיים &quot;גורם&quot; לטקס האישיים ולקבוע את סרוטיפ הסופי (למשל, 19B סרוטיפ). </li></ol>

<ol>
	<li>Rudan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+etiology+of+childhood+pneumonia+in+2010:+estimates+of+incidence,+severe+morbidity,+mortality,+underlying+risk+factors+and+causative+pathogens+for+192+countries.">Epidemiology and etiology of childhood pneumonia in 2010: estimates of incidence, severe morbidity, mortality, underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries.</a> J Glob Health. 3 (10401), (2013).</li><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years:+global+estimates.">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li><li>Henrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+newly+recognized+types+of+Streptococcus+pneumoniae.">Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae.</a> J Clin Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).</li><li>Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+pneumococcal+serogroups+cause+the+most+invasive+disease:+implications+for+conjugate+vaccine+formulation+and+use,+part+I.">Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.</a> Clin Infect Dis. 30, 100-121 (2000).</li><li>Mulholland, K., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 379, 1388-1389 (2012).</li><li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378, 1962-1973 (2011).</li><li>Satzke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae:+Updated+recommendations+from+the+World+Health+Organization+Pneumococcal+Carriage+Working+Group.">Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group.</a> Vaccine. , (2013).</li><li>Ortika, B. D., Habib, M., Dunne, E. M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+latex+agglutination+reagents+for+pneumococcal+serotyping.">Production of latex agglutination reagents for pneumococcal serotyping.</a> BMC Res Notes. 6 (49), (2013).</li><li>Adegbola, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+and+antimicrobial+susceptibility+patterns+of+isolates+of+Streptococcus+pneumoniae+causing+invasive+disease+in+The+Gambia+1996-2003.">Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003.</a> Trop Med Int Health. 11, 1128-1135 (2006).</li><li>Slotved, H. C., Kaltoft, M., Skovsted, I. C., Kerrn, M. B., Espersen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+latex+agglutination+test+for+serotyping+of+pneumococci+(Pneumotest-Latex).">Simple, rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex).</a> J Clin Microbiol. 42, 2518-2522 (2004).</li><li>Turner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+detection+of+nasopharyngeal+cocolonization+by+multiple+pneumococcal+serotypes+by+use+of+latex+agglutination+or+molecular+serotyping+by+microarray.">Improved detection of nasopharyngeal cocolonization by multiple pneumococcal serotypes by use of latex agglutination or molecular serotyping by microarray.</a> J Clin Microbiol. 49, 1784-1789 (2011).</li><li>Mudany, M. A., Kikuchi, K., Totsuka, K., Uchiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+serotyping+kit+for+Streptococcus+pneumoniae.">Evaluation of a new serotyping kit for Streptococcus pneumoniae.</a> J Med Microbiol. 52, 975-980 (2003).</li><li>Lalitha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+by+agglutination+assays:+a+cost-effective+technique+for+developing+countries.">Serotyping of Streptococcus pneumoniae by agglutination assays: a cost-effective technique for developing countries.</a> Bull World Health Organ. 74, 387-390 (1996).</li><li>Shutt, C. K., Samore, M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Denka+Seiken+slide+agglutination+method+to+the+quellung+test+for+serogrouping+of+Streptococcus+pneumoniae+isolates.">Comparison of the Denka Seiken slide agglutination method to the quellung test for serogrouping of Streptococcus pneumoniae isolates.</a> J Clin Microbiol. 42, 1274-1276 (2004).</li><li>Gella, F., Serra, J., Gener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latex+agglutination+procedures+in+immunodiagnosis.">Latex agglutination procedures in immunodiagnosis.</a> Pure Appl Chem. 63, 1131-1134 (1991).</li><li>Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+using+the+Quellung+reaction.">Capsular serotyping of Streptococcus pneumoniae using the Quellung reaction.</a> J. Vis. Exp. (84), (2014).</li><li>Arai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antiserum-coated+latex+particles+for+serotyping+Streptococcus+pneumoniae.">Use of antiserum-coated latex particles for serotyping Streptococcus pneumoniae.</a> Microbiol Immunol. 45, 159-162 (2001).</li><li>Lafong, A. C., Crothers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+latex+agglutination+method+for+typing+pneumococci.">Simple latex agglutination method for typing pneumococci.</a> J Clin Pathol. 41, 230-231 (1988).</li><li>Ortega-Vinuesa, J. L., Bastos-Gonzalez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+factors+affecting+the+performances+of+latex+agglutination+tests.">A review of factors affecting the performances of latex agglutination tests.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 12, 379-408 (2001).</li><li>Yap, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+slide+latex+agglutination+test+for+rotavirus+antigen+detection.">Development of a slide latex agglutination test for rotavirus antigen detection.</a> Malays J Pathol. 16, 49-56 (1994).</li><li>Severin, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latex+agglutination+in+the+diagnosis+of+meningococcal+meningitis.">Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis.</a> J Clin Pathol. 25, 1079-1082 (1972).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

התלכדות לטקס היא שיטה פשוטה, מהירה וזולה לserotyping דלקת ריאות. ריאגנטים התלכדות לטקס דלקת ריאות מסחריים זמינים, אבל הם כרגע לא מבדילים כל דלקת הריאות הידועות קפסיד 10,12. עם זאת, ניתן לייצר חומרים כימיים התלכדות לטקס בקלות בתוך הבית באמצעות antisera נרכש הועלה נגד אנטיגנים קופסית דלקת ריאות ספציפיות. בשיטה המתוארת כאן, נוגדנים באופן פסיבי קשורים לחלקיקי לטקס כדי להפוך את קבוצה של חומרים כימיים התלכדות לטקס. תגובת לטקס חיובית מתרחשת כאשר נוגדנים ספציפיים קשורים לחלקיקי הלטקס לצרף לאנטיגנים בכמוסת פוליסכריד של דלקת הריאות לבודד 18,19. חלקיקי הלטקס צמודים לנוגדנים לאפשר תגובת הנוגדן אנטיגן הספציפית להיות דמיינו ללא הגדלה. התלכדות לטקס היא שיטה מתאימה למעבדות תפוקה גבוההגם ד להגדרות משאבים לעניים. יתרונות עיקריים של שיטת התלכדות הלטקס הם שאין צורך בציוד מיוחד כדי לבצע את הבדיקה, יש לי ריאגנטים חיי מדף של לפחות 2 שנים, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס 8, ושזה לא יקר, פשוט ומהיר לביצוע. Serotyping בודד דלקת ריאות על ידי התלכדות לטקס לוקח כ 10 דקות, וניתן לבדוק עד ארבעה חומרים כימיים לטקס במקביל בשקופית אחת. יתר על כן, אם השכיחות של זנים אל ידועה בהגדרה אפידמיולוגיים הרלוונטית, בדיקה יכולה להתבצע בסבבים החלו בבריכות המכילות את הזנים אל הנפוצים ביותר בדומה למבחן Quellung 17. גישה זו מצמצמת את מספר הבדיקות הדרושות כדי לקבוע את סרוטיפ. השיטה היא גם מאוד לשחזור בין מפעילים שונים (מידע לא מוצג). חסרון של serotyping התלכדות לטקס הוא שייצור חומרים כימיים הוא לצרוך זמן, לוקח כ 4 שעות; למרות ריאד מרובהבקלות יכול להיות מיוצר NTS במקביל. יתר על כן, כמה אנטיגנים משותפים לזנים אל דלקת ריאות שונים, וכתוצאה מכך לתגובות צולבות עם כמה antisera (למשל, סרוטיפ 29, 42 וקבוצת 35). עם זאת, תגובות הצולבות אלה גם מתאפיינים בעת שימוש antisera המסחרי (שהוא בדרך כלל preabsorbed להסיר את הנוגדנים מגיבים צולבים בעייתיים יותר) ושולחנות תגובה נוספים מסופקות על ידי היצרן כדי להבדיל בי סרוטיפ הוא הווה. ריאגנטים לאטקס יכול גם לחצות יגיבו אם הנוגדנים אינם מיושרים כהלכה על חלקיקי הלטקס; אלה מתגלים ככישלונות QC. מניסיוננו, QC הקפדני הוא מרכזי להצלחתה של שיטה זו, גם כאשר antisera זמין מסחרי המשמשים לייצור. QC לוקח כ 15 דקות לכל מגיב והוא מסתמך על סט של QC המתאים המבודד כפי שתואר לעיל. השיטה המתוארת כאן תוצאות בריאגנטים שנותנים wi גם תגובה חיוביתדק תקופת המבחן. מניסיוננו, תוצאות חיוביות שגויות הן נדירות בפועל (מידע לא מוצג). תגובות שליליות כוזבות מדי פעם הם נצפו; בדרך כלל אלה מתייחסים לבעיות ידועות עם antiserum מסוים (לדוגמא, serogroup 6 מבודדים עשויים שלא להגיב בB antiserum בריכה), או למטה רגולציה של ביטוי כמוסה ידי הבודד. השימוש בalgrorithm serotyping מסופק על ידי היצרן הוא גם חשוב, כמו ברוב המקרים תגובה חיובית או שלילית כוזבת תוביל לתוצאה &quot;סוף עיוור&quot;. במקרים אלה, וכאשר התגובות הן קשות לפרש, אנו ממליצים לחזור על בדיקה ו / או בדיקה על ידי שיטה חלופית כגון תגובת Quellung. פתרון בעיות מסוימים נדרשת מעת לעת כדי להפוך את חומרים כימיים לטקס משביע רצון. בשיטה המתוארת כאן, הנוגדן מחובר לחלקיקי לטקס באמצעות ספיחה פסיבית 15,19, כך משתנה קריטי הוא הריכוז של נוגדנים המשמש, שקובע עד כמהפני השטח של חלקיקי הלטקס מכוסה והיישור הבא של האתרים הפעילים נוגדן 15,20. כתוצאה מכך, אם נוגדן מספיק או עודף מחובר לחלקיקי הלטקס, תגובות נוגדן אנטיגן לא תהיינה אופטימליות, וריאגנטים בלתי מספקים עלולים להיווצר 15,20,21. כטיטר נוגדנים להשתנות בין המון השונים של antisera, קבוצה סטנדרטית של דילולים לא יכולה לייצר חומרים כימיים כי ביצועים טובים 8. נקודת התחלה שימושית היא להשתמש בדילול 01:40 של antiserum, ואם זה לא מוצלח, לדלל את antiserum נוסף. מניסיוננו זה בדרך כלל פותר את הבעיה 8. במספר קטן של מקרי ריאגנטים עשויים להראות התלכדות חלשה שאינו מלווה בסליקה של ההשעיה כאשר נבדקו עם היעד מבודד. במקרים אלה דילול antiserum אינו משפר את האיכות של המגיב, אבל בדרך כלל ניתן לייצר חומרים כימיים משביעות רצון על ידי השמטת צנטריפוגה ולשטוף צעדים 8,22 </sup&gt;. חלקיקי לטקס נוגדן מצופה נמצאים בשימוש נפוץ במיקרוביולוגיה אבחונים לגילוי, זיהוי או serotyping של חיידקים רבים ושונים 15,20. ככזה, השיטה המתוארת כאן עשויה להיות מתאימה להכנת ריאגנטים לטקס למטרות אחרות, antisera המתאים ובלבד זמין ונהלי QC נאותים יאומצו.

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) הוא אחד גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה בילדים מתחת לגיל חמש שנים ברחבי העולם, במיוחד בהגדרות משאבים לעניים 1,2. טווחי מחלה דלקת ריאות מפני זיהומים מקומיים לסכנת חיים בתנאים כגון דלקת ריאות, אלח דם ודלקת קרום מוח 1,2. יותר מ 90 קפסיד של pneumococci זוהו על בסיס הבדלים בפוליסכריד קופסית 3. חיסונים הנוכחיים למקד את פוליסכריד קופסית ולספק הגנה מפני הזנים אל העיקריים בגרימת מחלה פולשנית 4. Serotyping דלקת ריאות מבודדות הוא חשוב להערכת ההשפעה של חיסון על כרכרה ומחלה, כמו גם מתן מידע אפידמיולוגיים רחב יותר 5,6. השיטה הנוכחית &quot;תקן זהב&quot; לserotyping דלקת ריאות היא מבחן Quellung, אבל זה זמן רב ודורשת מיומנות מסוימת לperform 7. התלכדות לטקס היא שיטת serotyping חלופה המומלצת על ידי ארגון הבריאות העולמית 7. התלכדות לטקס היא מהירה וקלה לביצוע, והוא מועסק במעבדות רבות בעולם 8-11. חשוב לציין, התלכדות הלטקס הוכיחה דיוק דומה למבחן Quellung לserotyping דלקת הריאות 10,12-14. בסך הכל, שיטה זו היא אידיאלית עבור הגדרות משאבים לעניים, כמו גם מעבדות תפוקה גבוהה. ריאגנטים התלכדות לטקס (&#39;ריאגנטים לטקס&#39;) נוצרים על ידי ההתקשרות של נוגדנים לחלקיקי לטקס 15. בתגובה חיובית, חלקיקים אלה שכותרת agglutinate בנוכחות של אנטיגן הספציפי. ריאגנטים לטקס מסחריים זמינים לטווח מוגבל של סרוטיפים. ניתן גם מגיבים מוכנים לטקס בבית באמצעות מסחרי antisera זמין 10. תערובות של antisera (&quot;בריכות&quot;), כמו גם antisera הספציפי לים דלקת ריאותerogroups (למשל, קבוצה 19), זנים אל פרט (למשל, סרוטיפ 5), ולאנטיגנים ספציפיים (&#39;גורמים&#39;, למשל., 19c גורם הכרת 19A סרוטיפ) להגדרה נוספת קפסיד בתוך קבוצות זמינות 16. כתב יד זה מתאר את השלבים העיקריים בייצור של חומרים כימיים לטקס באמצעות קובץ מצורף פסיבי של antisera זמין המסחרית לחלקיקי לטקס. היבטי בקרת איכות (QC) של שיטה זו מתוארים, ופרוטוקול לשימוש בחומרים כימי לטקס לserotyping דלקת ריאות כלול.

<table><tbody><tr><td>Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td><td>Sigma</td><td>65984-10 ml-F</td><td>Or other volumes as required</td></tr><tr><td>Normal rabbit serum</td><td>Antibodies Australia&amp;nbsp;</td><td>NRS-1ml</td><td>Or other volumes as required, bring to RT before use</td></tr><tr><td>Pneumococcus (Neufeld) antisera</td><td>SSI Diagnostica</td><td>Various</td><td>Bring to RT before use&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Sterile Bovine Albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A-4503</td><td>Bring to rRT before use</td></tr><tr><td>Sodium azide 10% (v/v) solution&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>ROAC3902/100ml</td><td>Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>Round bottom</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>10241.AP</td><td></td></tr><tr><td>Calibrated disposable inoculating loops 1 &amp;micro;l</td><td>Copan</td><td>CD175SO1</td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LBS 2950RC</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaOH</td><td>BDH</td><td>10252</td><td>Caution: highly corrosive</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Merck</td><td>10119.05</td><td></td></tr><tr><td>Horse Blood Agar (HBA) plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PP2001</td><td>Bring to RT before use&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.thermofisher.com.au/&quot;&gt;http://www.thermofisher.com.au&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Rotating wheel</td><td>Wyble Engineering Development Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td><td>Technoplas</td><td>S5016SU</td><td></td></tr><tr><td>60 ml syringes without needles</td><td>Terumo</td><td>SS-60L</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &amp;micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Brochure on Neufeld antisera</td><td>Statens Serum Institut</td><td></td><td>Key to determining serotypes&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Key to pneumococcal factor serum</td><td>Statens Serum Institut</td><td>18058</td><td>For determining serotype within Groups&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>*alternative sources are available for most materials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

תגובת לטקס חיובית מתרחשת כאשר נוגדנים מסוג ספציפי שצורפו לחלקיקי הלטקס נקשר לכמוסה של pneumococcus, והתלכדות של חלקיקי הנוגדן שכותרתו מתפתחת 15. איור 1 א מציג תגובה חיובית המתאפיינת בהתלכדות וסליקה גלויות של הרקע השעיה. תגובה שלילית מאופיינת בהשעיה מגיב התלכדות לטקס שנותרה חלק ולבן (איור 1). ריאגנטים מותאמים כך שתגובה חיובית יש לשים לב לפני סוף המרווח דק &#39;פעם אחת (בדרך כלל להבחין בכ 20 שניות). אנחנו לא ממליצים לקרוא את תגובות אחרי פרק זמן 1 דקות. לעתים רחוקות, תגובות להציג התלכדות חלשה מסביב לקצה של הירידה שאינו מלווה על ידי ניקוי של ההשעיה הרקע, או להופיע &quot;סיבי&quot; ללא סליקת רקע (מידע לא מוצג). אלה הם רוב כמו<html> תגובות שליליות ly. במקרים כאלה, אנו ממליצים retesting ו / או חקירה נוספת בשיטה אחרת serotyping (לדוגמא תגובת Quellung 17). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> 1 תגובות איור חיוביות ושליליות התלכדות לטקס. תכשירים מדלקת ריאות לבודד מעורבים עם מגיב התלכדות הלטקס מראה תגובה חיובית () או תגובה שלילית (B). התלכדות מלווה בסליקה של הרקע נראית בתגובה החיובית () .There אין התלכדות גלויה עם מגיב לטקס ביקורת השלילי או בתגובה שלילית בדיקה (B). תמונות 8 בשימוש באישור.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; לוחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination at JoVE.com

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

בדיקות התלכדות לטקס היא שיטה פשוטה, מהירה וזולה לserotyping Streptococcus pneumoniae, וגם כבר מיושמות באופן נרחב במיקרוביולוגיה אבחון. כתב יד זה מתאר את הייצור של חומרים כימיים התלכדות לטקס, נהלי בקרת איכות ובבית היישום של טכניקה זו לserotyping דלקת ריאות.

קופסית Serotyping של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; על ידי לאטקס התלכדות

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

capsular-serotyping-of-streptococcus-pneumoniae-by-latex-agglutination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.8K Views.  Murdoch Childrens Research Institute.  בדיקות התלכדות לטקס היא שיטה פשוטה, מהירה וזולה לserotyping Streptococcus pneumoniae, וגם כבר מיושמות באופן נרחב במיקרוביולוגיה אבחון. כתב יד זה מתאר את הייצור של חומרים כימיים התלכדות לטקס, נהלי בקרת איכות ובבית היישום של טכניקה זו לserotyping דלקת ריאות. ...

Video: Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

התלכדות חלקיקים שיטת זיהוי poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Biochemistry

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

תובלת pneumococcal אנוש ניסויית

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Medicine

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

קופסית Serotyping של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש תגובת Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled microscopic lesions (microlesions) that are remarkable due to the absence of infiltrating immune cells. Due to their release of cardiotoxic products, S. pneumoniae within microlesions are thought to contribute to the heart failure that is frequently observed during fulminate invasive pneumococcal disease in adults. Herein is demonstrated a protocol for experimental mouse infection that leads to reproducible cardiac microlesion formation within 30 hr. Instruction is provided on microlesion identification in hematoxylin &#38; eosin stained heart sections and the morphological distinctions between early and late microlesions are highlighted. Instruction is provided on a protocol for verification of S. pneumoniae within microlesions using antibodies against pneumococcal capsular polysaccharide and immunofluorescent microscopy. Last, a protocol for antibiotic intervention that rescues infected mice and for the detection and assessment of scar formation in the hearts of convalescent mice is provided. Together, these protocols will facilitate the investigation of the molecular mechanisms underlying pneumococcal cardiac invasion, cardiomyocyte death, cardiac remodeling as a result of exposure to S. pneumoniae, and the immune response to the pneumococci in the heart.

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

ויזואליזציה של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; בתוך Microlesions הלב וRemodeling לב לאחר

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new protein functions or to have access to protein conjugates. Stop codon suppression, in particular amber codon suppression, has emerged as the most popular method to genetically introduce UAAs at defined positions. This methodology is herein applied to the preparation of a carrier protein containing an UAA harboring a bioorthogonal functional group. This reactive handle can next be used to specifically and efficiently graft a synthetic oligosaccharide hapten to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine. The protocol is limited to the synthesis of glycoconjugates in a 1:1 carbohydrate hapten/carrier protein ratio but amenable to numerous pairs of biorthogonal functional groups. Glycococonjugate vaccine homogeneity is an important criterion to ensure complete physico-chemical characterization, thereby, satisfying more and more demanding drug regulatory agency recommendations, a criterion which is unmet by classical conjugation strategies. Moreover, this protocol makes it possible to finely tune the structure of the actual conjugate vaccine, giving rise to tools to address structure-immunogenicity relationships.

Genetic code expansion is applied for the introduction of an unnatural amino acid bearing a biorthogonal functional group on a carrier protein at a defined site. The biorthogonal function is further used for the site-selective coupling of a carbohydrate antigen to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine.

גליקוקוג'גייט הומוגני המיוצר על ידי התאגדות חומצת אמינו לא טבעית משולבת וכימיה לחץ למטרות חיסון

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

Bioengineering

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is requisite to phagocytosis and killing, the assay is an alternative method to&#160;opsono-phagocytic killing assays. An advantage of the opsono-adherence&#160;assay is the option of using inactivated pathogens and mammalian cell lines, which allows standardization across multiple experiments. The use of an inactivated pathogen in the assay also facilitates work with biosafety level 3 infectious agents and other virulent pathogens. In our work, the opsono-adherence assay was used to assess the functional ability of antibodies, from sera of animals immunized with an anthrax capsule-based vaccine, to induce adherence of fixed Bacillus anthracis to a mouse macrophage cell line, RAW 264.7. Automated fluorescence microscopy was used to capture images of bacilli adhering to macrophages. Increased adherence was correlated with the presence of anti-capsule antibodies in the serum. Non-human primates that exhibited high serum anti-capsule antibody concentrations were protected from anthrax challenge. Thus, the opsono-adherence assay can be used to elucidate the biological functions of antigen specific antibodies in sera, to evaluate the efficacy of vaccine candidates and other therapeutics, and to serve as a possible correlate of immunity.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is an alternative method to the opsono-phagocytic killing assay to evaluate the opsonic functions of antibodies in vaccine development.

Opsono-דבקות Assay כדי להעריך נוגדנים תפקודיים בפיתוח חיסונים נגד אנתרקיס Bacillus ופתוגנים אנקפסולציה אחרים

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, studies in this serotype have been hindered by the lack of genetic tools to modify it. In this study, we describe a method to genetically modify a serotype 1 clinical isolate (strain 519/43). Interestingly, this was achieved by exploiting the Pneumococcus&#8217; ability to naturally acquire DNA. However, unlike most pneumococci, the use of linear DNA was not successful; to mutate this important strain, a suicide plasmid had to be used. This methodology has provided the means for a deeper understanding of this elusive serotype, both in terms of its biology and pathogenicity. To validate the method, the major known pneumococcal toxin, pneumolysin, was mutated because it has a well-known and easy to follow phenotype. We showed that the mutant, as expected, lost its ability to lyse red blood cells. By being able to mutate an important gene in the serotype of interest, we were able to observe different phenotypes for loss of function mutants upon intraperitoneal and intranasal infections from the ones observed for other serotypes. In summary, this study proves that strain 519/43 (serotype 1) can be genetically modified.

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Here, we describe a S. pneumoniae serotype 1 strain 519/43 that can be genetically modified by using its ability to naturally acquire DNA and a suicide-plasmid. As proof of principle, an isogenic mutant in the pneumolysin (ply) gene was made.

בניית מוטנטים בסרוטיפ 1 סטרפטוקוקוס דלקת ריאות זן 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

קופסית Serotyping של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video