This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

.1 הכנת ריאגנטים לאטקס בבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שנאגרו מלוח גליצין (GBS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 גליצין גרם, נתרן כלורי 11.7 גרם ושל מים מזוקקים 100 מ&quot;ל לכוס זכוכית 200 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים להמסה באמצעות stirrer מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התערובת ל500 מ&quot;ל מדידת צילינדר ולהוסיף מים מזוקקים כדי להפוך כולל של 200 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון בחזרה לכוס 200 מ&quot;ל, לבדוק את רמת החומציות ולהתאים ל8.2 עם הידרוקסיד 5 M נתרן. הערה: הידרוקסיד הנתרן הוא מאכל, ללבוש ציוד מגן אישי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר את הפתרון באמצעות 0.22 מיקרומטר מסננים וכמה 60 מ&quot;ל מזרקים לתוך בקבוק זכוכית מ&quot;ל preautoclaved בורג כתרים 250. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחסן ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של GBS עם 0.2% אלבומין בסרום שור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.2 גרם של אלבומין בסרום שור אבקה (BSA) ושל GBS 100 מ&quot;ל לכוס זכוכית 200 מ&quot;ל ולערבב לפזר באמצעות stirrer מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנןלעקר את הפתרון באמצעות 0.22 מיקרומטר מסננים באמצעות מספר מזרקים 60 מ&quot;ל לבקבוק זכוכית כתרים מ&quot;ל preautoclaved בורג 250. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב 4 ° C.. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה מגיב לאטקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל 2 מ&quot;ל עגול צינור microfuge תחתון. הערה: סיבוב צינורות תחתון משמשות כדי למזער יישוב חלקיקים אשר עשוי להשפיע קובץ מצורף נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה P1000 עם טיפים סטרילי להוסיף 975 μl של GBS לתוך צינור microfuge, ולאחר מכן להוסיף 25 μl של antiserum דלקת ריאות המתאים עבור מגיב הלטקס שמכין (כלומר, בריכה, קבוצה, סוג או גורם). הפוך חמש פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל חלקיקי לטקס פוליסטירן 01:10 ידי הוספת 120 μl של חלקיקי לטקס ל1,080 μl של תמיסת מלח פיסיולוגי סטרילי. הערה: זה יכול להתבצע בכמויות גדולות יותר, אבל צריך להיעשות טרי בכל פעם ריאגנטים הלטקס מיוצרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1,000 μl של ההשעיה 01:10 לטקס (מוכנה בשלב 1.3.3) ל1,השעיה 000 μl 01:40 antiserum (מוכן בשלב 1.3.2). הפוך חמש פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C על גלגל מסתובב לאט (לדוגמא, 4 סל&quot;ד גלגל בקוטר 38.5 סנטימטר) עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ל15 דקות ב 1,100 x גרם. בטל supernatant ועדינות resuspend גלולה ב2 מ&quot;ל של תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ל15 דקות ב 1,100 x גרם. בטל supernatant ולהוסיף 1 מ&quot;ל של GBS ובעדינות resuspend גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ההשעיה הלטקס לתוך 5 מ&quot;ל שכותרתו בורג כתרים צינור. הוסף 1 מ&quot;ל נוסף של GBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של GBS מכיל 0.2 BSA% (w / v) (pH 8.2) (מוכן בשלב 1.2). הוסף 40 μl של 10% (w / v) פתרון של אזיד הנתרן כחומר משמר. הערה: יזיד הנתרן הוא מסוכן אם בשאיפה, והוא גירוי עור ועיניים. רצוי לרכוש פתרון 10% מוכנים ולא צורת האבקה, כמו זה ממזער את הסיכון של חשיפת משאיפת. ציוד מגן אישי (כולל כפפותמשקפי סנסציה ד) צריכים להיות משוחק בעת הטיפול מגיב זה. עיין בגיליון נתוני בטיחות של חומרים לפרטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים לטקס חנות ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של מגיב לטקס ביקורת שלילית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל 2 מ&quot;ל עגול צינור microfuge תחתון. הערה: סיבוב צינורות תחתון משמשות כדי למזער יישוב חלקיקים אשר עשוי להשפיע קובץ מצורף נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה P1000 עם טיפים סטרילי להוסיף 975 μl של GBS לתוך צינור microfuge, ולאחר מכן להוסיף 25 μl antiserum ארנב הרגיל. הפוך חמש פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך כמו בשלבי 1.3.3 ל1.3.10 לעיל </li></ol></li></ol> .2 בקרת איכות (QC) של ריאגנטים לאטקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא מגיב לטקס לRT. מייד לפני השימוש, לערבב בעדינות מגיב לטקס על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק מגיב לautoagglutination ידי pipetting 15 μl לשקופית מיקרוסקופ זכוכית והמשך כבצעדים 4.7 ו4.8 להלן. לא צריך להיות שוםgglutination של חלקיקי הלטקס. מגיב אמורה להופיע לבן וחלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המגיב נגד פנל של בידודי דלקת ריאות מעבר נמוך. השתמש בתרבויות טריות גדלו מוכנות כמו בשלב 3 הפנל של בידודים צריך לכלול נגזרות של סרוטיפ &#39;היעד&#39; (סרוטיפ הספציפי למגיב נבדק) וזנים אל &#39;אינו יעד &quot;(נגזרות של סרוטיפים אחרים שלא צריך בדרך כלל לעבור מגיב עם המגיב). כולל בודד לפחות אחד מכל סוג סרוטיפ יעד ולא יעד עבור כל מגיב לטקס עובר QC. אם יש רק אחד יעד או serotype אינו היעד, בדיקת שני בידודים שונים של סרוטיפ המסוים. הערה: פנל הבדיקה צריך לכלול מספר בידודים של כל serotype, שחלקם נדירים במחלה פולשנית ו / או אוספי תרבות סוג. עדיף לכלול כמה מרכבה מבודדת, כפי שהם לעתים קרובות יותר תובעניים לסרוטיפ (מידע לא מוצג), ובכך בודקים את o הקיבולת נוספתf ריאגנטים ולהבטיח כי חומרים כימיים עשויים מסוגלים serotyping שני פולשנית וכרכרה מבודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך בבדיקות של חומרים כימיים לטקס עם יעד ודלקת ריאות שאינם יעד מבודד לפי השיטה המתוארת בשלבי 3 ו -4 להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים בקרת איכות בזמן ייצור ולאחר מכן לפחות אחת לשנה לאחר מכן. הערה: אם מגיב לא עובר QC, אצווה חייב להיות מושלך והכנה חדשה שנעשתה. במקרה של כישלון QC חוזר אנו ממליצים על חומרים כימיים שמיוצרים תוך שימוש בשיטות החלופיות שמתוארות בOrtika et al. 2013 8 ובדיון שלהלן. </li></ol> .3 הכנת תרבויות דלקת ריאות לSerotyping <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות לולאת סטרילי לבחור מושבה אחת של דלקת הריאות לבודד ופס זה החוצה אל אגר דם לא סלקטיבי מוצק, כך שהבידוד העיקרי מכסה כשליש ממשטח הצלחת. Streak למושבות אחת. הערה: לוחות שהוכנו מסוס defibrinated או דם כבשים מתאימים; אבל צלחות דם מוכנות עם דם אדם או דם של בעלי החיים citrated אינן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה O הצלחת / N על 37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לצמיחה על הצלחת לטוהר ולהעריך שיש צמיחה מספיק לserotyping. הערה: תרבות טהורה של בודד דלקת הריאות נדרשת לserotyping. מהניסיון, ומחוברות, או בסמוך מחוברות הצמיחה שלנו מכסה כשליש ממשטח הצלחת הוא בדרך כלל מספיק על מנת להשלים serotyping. כתרבויות דלקת ריאות עלולות להיות מועדות לautolysis, תרבויות מוכנות לserotyping צריכה להיבדק בתוך 24 שעות של תת תרבות. אל תיקח את צלחת התרבות מחוץ לחממה יותר מ 15 עד 20 דקות לפני serotyping מתחיל. </li></ol> .4 Serotyping אטקס התלכדות ניצוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל חומרים כימיים הלטקס ממקרר ולאפשר להם לחמם לRT למשך כimately 30 דקות. מייד לפני השימוש, בעדינות להפוך את הצינורות כדי לערבב את חומרים כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 15 μl של מגיב לטקס שליטה שלילי לשקופית מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות μl 1 לולאה חד פעמית סטרילי לקחת תנופה של תרבות דלקת הריאות, כך שהלולאה היא כמחצית מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למרוח הבידוד על פני השטח של השקופיות קרובות לירידה של מגיב לטקס ביקורת שלילי. הבידוד צריך להיות גלוי בשקופית הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות וביסודיות לערבב הבידוד למגיב לטקס שליטה השלילי באמצעות הלולאה. ודא כי הירידה אינה מתפשטת עוד יותר מאשר הגודל ההתחלתי שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את השקופית, מחזיקים אותו בשני הקצוות. רוק השקופיות קדימה ואחורה דקות 1. תשמור על עצמך כדי לשמור על הנוזל נע באיטיות, ולהבטיח שהגודל של הירידה לא להגדיל. הערה: לחלופין להשתמש בכיסא נדנדה צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב להתלכדות מקרוסקופית (כלומר, על ידיבעין בלתי מזוינת) וסליקה של ההשעיה על רקע שחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מגיב לטקס ביקורת השלילי לא מראה התלכדות או סליקה להמשיך בדיקות התרבות, החלפת חומרים כימיים לטקס מבחן למגיב לטקס שליטה השלילי בצעדי 4.1-4.8 לעיל. לולאה טרי יש להשתמש בכל פעם. להמשיך בבדיקות של חומרים כימיים לטקס מתחילים עם הבריכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כל אחד מהחומרים הכימיים &#39;הבריכה&#39; לטקס ברציפות עד בדיקה חיובית מתקבלת. הערה:. סדר הבדיקה של הבריכות ניתן לעשות זאת ב&#39;סיבובים &#39;כדי לשקף את השכיחות המקומית של זנים אל מסוימים (למשל, על ידי בדיקת שלוש בריכות ככל הנראה בשקופית הראשונה אם תגובה חיובית ולא התקבל, לאחר מכן מבחן הבא שלוש הסיכוי הטוב ביותר של הבריכות שנותרו בשקופית השנייה, וכן הלאה עד שתגובה חיובית מתקבלת). הדבר מבטיח כי קפסיד הנפוצים ביותר נבדקים ראשון, צמצום הזמן וריאגנטים צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">באמצעות המקש של יצרן antisera לקבוע איזה פרט antisera מיוצג בבריכה החיובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן כל אחת מהקבוצות או הסוגים הכלולים בבריכה החיובית בנפרד כדי לקבוע את &quot;הקבוצה&quot; או &quot;סוג&quot; כמו בשלבים 4.1-4.8 לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את התוצאה על ידי התייחסות למפתח של יצרן antisera. אם &#39;סוג&#39; נקבע (לדוגמא, סרוטיפ 5), אז אין בדיקות נוספות נחוצה ותוצאה זה נרשמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם &quot;קבוצה&quot; נקבעה (לדוגמא, קבוצה 19), ולאחר מכן עיין במפתח היצרנים כדי לקבוע את הגורמים להיבדק. המשך בדיקות עם חומרים כימיים &quot;גורם&quot; לטקס האישיים ולקבוע את סרוטיפ הסופי (למשל, 19B סרוטיפ). </li></ol>

<ol>
	<li>Rudan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+etiology+of+childhood+pneumonia+in+2010:+estimates+of+incidence,+severe+morbidity,+mortality,+underlying+risk+factors+and+causative+pathogens+for+192+countries.">Epidemiology and etiology of childhood pneumonia in 2010: estimates of incidence, severe morbidity, mortality, underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries.</a> J Glob Health. 3 (10401), (2013).</li><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years:+global+estimates.">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li><li>Henrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+newly+recognized+types+of+Streptococcus+pneumoniae.">Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae.</a> J Clin Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).</li><li>Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+pneumococcal+serogroups+cause+the+most+invasive+disease:+implications+for+conjugate+vaccine+formulation+and+use,+part+I.">Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.</a> Clin Infect Dis. 30, 100-121 (2000).</li><li>Mulholland, K., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 379, 1388-1389 (2012).</li><li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378, 1962-1973 (2011).</li><li>Satzke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae:+Updated+recommendations+from+the+World+Health+Organization+Pneumococcal+Carriage+Working+Group.">Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group.</a> Vaccine. , (2013).</li><li>Ortika, B. D., Habib, M., Dunne, E. M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+latex+agglutination+reagents+for+pneumococcal+serotyping.">Production of latex agglutination reagents for pneumococcal serotyping.</a> BMC Res Notes. 6 (49), (2013).</li><li>Adegbola, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+and+antimicrobial+susceptibility+patterns+of+isolates+of+Streptococcus+pneumoniae+causing+invasive+disease+in+The+Gambia+1996-2003.">Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003.</a> Trop Med Int Health. 11, 1128-1135 (2006).</li><li>Slotved, H. C., Kaltoft, M., Skovsted, I. C., Kerrn, M. B., Espersen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+latex+agglutination+test+for+serotyping+of+pneumococci+(Pneumotest-Latex).">Simple, rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex).</a> J Clin Microbiol. 42, 2518-2522 (2004).</li><li>Turner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+detection+of+nasopharyngeal+cocolonization+by+multiple+pneumococcal+serotypes+by+use+of+latex+agglutination+or+molecular+serotyping+by+microarray.">Improved detection of nasopharyngeal cocolonization by multiple pneumococcal serotypes by use of latex agglutination or molecular serotyping by microarray.</a> J Clin Microbiol. 49, 1784-1789 (2011).</li><li>Mudany, M. A., Kikuchi, K., Totsuka, K., Uchiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+serotyping+kit+for+Streptococcus+pneumoniae.">Evaluation of a new serotyping kit for Streptococcus pneumoniae.</a> J Med Microbiol. 52, 975-980 (2003).</li><li>Lalitha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+by+agglutination+assays:+a+cost-effective+technique+for+developing+countries.">Serotyping of Streptococcus pneumoniae by agglutination assays: a cost-effective technique for developing countries.</a> Bull World Health Organ. 74, 387-390 (1996).</li><li>Shutt, C. K., Samore, M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Denka+Seiken+slide+agglutination+method+to+the+quellung+test+for+serogrouping+of+Streptococcus+pneumoniae+isolates.">Comparison of the Denka Seiken slide agglutination method to the quellung test for serogrouping of Streptococcus pneumoniae isolates.</a> J Clin Microbiol. 42, 1274-1276 (2004).</li><li>Gella, F., Serra, J., Gener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latex+agglutination+procedures+in+immunodiagnosis.">Latex agglutination procedures in immunodiagnosis.</a> Pure Appl Chem. 63, 1131-1134 (1991).</li><li>Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+using+the+Quellung+reaction.">Capsular serotyping of Streptococcus pneumoniae using the Quellung reaction.</a> J. Vis. Exp. (84), (2014).</li><li>Arai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antiserum-coated+latex+particles+for+serotyping+Streptococcus+pneumoniae.">Use of antiserum-coated latex particles for serotyping Streptococcus pneumoniae.</a> Microbiol Immunol. 45, 159-162 (2001).</li><li>Lafong, A. C., Crothers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+latex+agglutination+method+for+typing+pneumococci.">Simple latex agglutination method for typing pneumococci.</a> J Clin Pathol. 41, 230-231 (1988).</li><li>Ortega-Vinuesa, J. L., Bastos-Gonzalez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+factors+affecting+the+performances+of+latex+agglutination+tests.">A review of factors affecting the performances of latex agglutination tests.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 12, 379-408 (2001).</li><li>Yap, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+slide+latex+agglutination+test+for+rotavirus+antigen+detection.">Development of a slide latex agglutination test for rotavirus antigen detection.</a> Malays J Pathol. 16, 49-56 (1994).</li><li>Severin, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latex+agglutination+in+the+diagnosis+of+meningococcal+meningitis.">Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis.</a> J Clin Pathol. 25, 1079-1082 (1972).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

התלכדות לטקס היא שיטה פשוטה, מהירה וזולה לserotyping דלקת ריאות. ריאגנטים התלכדות לטקס דלקת ריאות מסחריים זמינים, אבל הם כרגע לא מבדילים כל דלקת הריאות הידועות קפסיד 10,12. עם זאת, ניתן לייצר חומרים כימיים התלכדות לטקס בקלות בתוך הבית באמצעות antisera נרכש הועלה נגד אנטיגנים קופסית דלקת ריאות ספציפיות. בשיטה המתוארת כאן, נוגדנים באופן פסיבי קשורים לחלקיקי לטקס כדי להפוך את קבוצה של חומרים כימיים התלכדות לטקס. תגובת לטקס חיובית מתרחשת כאשר נוגדנים ספציפיים קשורים לחלקיקי הלטקס לצרף לאנטיגנים בכמוסת פוליסכריד של דלקת הריאות לבודד 18,19. חלקיקי הלטקס צמודים לנוגדנים לאפשר תגובת הנוגדן אנטיגן הספציפית להיות דמיינו ללא הגדלה. התלכדות לטקס היא שיטה מתאימה למעבדות תפוקה גבוההגם ד להגדרות משאבים לעניים. יתרונות עיקריים של שיטת התלכדות הלטקס הם שאין צורך בציוד מיוחד כדי לבצע את הבדיקה, יש לי ריאגנטים חיי מדף של לפחות 2 שנים, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס 8, ושזה לא יקר, פשוט ומהיר לביצוע. Serotyping בודד דלקת ריאות על ידי התלכדות לטקס לוקח כ 10 דקות, וניתן לבדוק עד ארבעה חומרים כימיים לטקס במקביל בשקופית אחת. יתר על כן, אם השכיחות של זנים אל ידועה בהגדרה אפידמיולוגיים הרלוונטית, בדיקה יכולה להתבצע בסבבים החלו בבריכות המכילות את הזנים אל הנפוצים ביותר בדומה למבחן Quellung 17. גישה זו מצמצמת את מספר הבדיקות הדרושות כדי לקבוע את סרוטיפ. השיטה היא גם מאוד לשחזור בין מפעילים שונים (מידע לא מוצג). חסרון של serotyping התלכדות לטקס הוא שייצור חומרים כימיים הוא לצרוך זמן, לוקח כ 4 שעות; למרות ריאד מרובהבקלות יכול להיות מיוצר NTS במקביל. יתר על כן, כמה אנטיגנים משותפים לזנים אל דלקת ריאות שונים, וכתוצאה מכך לתגובות צולבות עם כמה antisera (למשל, סרוטיפ 29, 42 וקבוצת 35). עם זאת, תגובות הצולבות אלה גם מתאפיינים בעת שימוש antisera המסחרי (שהוא בדרך כלל preabsorbed להסיר את הנוגדנים מגיבים צולבים בעייתיים יותר) ושולחנות תגובה נוספים מסופקות על ידי היצרן כדי להבדיל בי סרוטיפ הוא הווה. ריאגנטים לאטקס יכול גם לחצות יגיבו אם הנוגדנים אינם מיושרים כהלכה על חלקיקי הלטקס; אלה מתגלים ככישלונות QC. מניסיוננו, QC הקפדני הוא מרכזי להצלחתה של שיטה זו, גם כאשר antisera זמין מסחרי המשמשים לייצור. QC לוקח כ 15 דקות לכל מגיב והוא מסתמך על סט של QC המתאים המבודד כפי שתואר לעיל. השיטה המתוארת כאן תוצאות בריאגנטים שנותנים wi גם תגובה חיוביתדק תקופת המבחן. מניסיוננו, תוצאות חיוביות שגויות הן נדירות בפועל (מידע לא מוצג). תגובות שליליות כוזבות מדי פעם הם נצפו; בדרך כלל אלה מתייחסים לבעיות ידועות עם antiserum מסוים (לדוגמא, serogroup 6 מבודדים עשויים שלא להגיב בB antiserum בריכה), או למטה רגולציה של ביטוי כמוסה ידי הבודד. השימוש בalgrorithm serotyping מסופק על ידי היצרן הוא גם חשוב, כמו ברוב המקרים תגובה חיובית או שלילית כוזבת תוביל לתוצאה &quot;סוף עיוור&quot;. במקרים אלה, וכאשר התגובות הן קשות לפרש, אנו ממליצים לחזור על בדיקה ו / או בדיקה על ידי שיטה חלופית כגון תגובת Quellung. פתרון בעיות מסוימים נדרשת מעת לעת כדי להפוך את חומרים כימיים לטקס משביע רצון. בשיטה המתוארת כאן, הנוגדן מחובר לחלקיקי לטקס באמצעות ספיחה פסיבית 15,19, כך משתנה קריטי הוא הריכוז של נוגדנים המשמש, שקובע עד כמהפני השטח של חלקיקי הלטקס מכוסה והיישור הבא של האתרים הפעילים נוגדן 15,20. כתוצאה מכך, אם נוגדן מספיק או עודף מחובר לחלקיקי הלטקס, תגובות נוגדן אנטיגן לא תהיינה אופטימליות, וריאגנטים בלתי מספקים עלולים להיווצר 15,20,21. כטיטר נוגדנים להשתנות בין המון השונים של antisera, קבוצה סטנדרטית של דילולים לא יכולה לייצר חומרים כימיים כי ביצועים טובים 8. נקודת התחלה שימושית היא להשתמש בדילול 01:40 של antiserum, ואם זה לא מוצלח, לדלל את antiserum נוסף. מניסיוננו זה בדרך כלל פותר את הבעיה 8. במספר קטן של מקרי ריאגנטים עשויים להראות התלכדות חלשה שאינו מלווה בסליקה של ההשעיה כאשר נבדקו עם היעד מבודד. במקרים אלה דילול antiserum אינו משפר את האיכות של המגיב, אבל בדרך כלל ניתן לייצר חומרים כימיים משביעות רצון על ידי השמטת צנטריפוגה ולשטוף צעדים 8,22 </sup&gt;. חלקיקי לטקס נוגדן מצופה נמצאים בשימוש נפוץ במיקרוביולוגיה אבחונים לגילוי, זיהוי או serotyping של חיידקים רבים ושונים 15,20. ככזה, השיטה המתוארת כאן עשויה להיות מתאימה להכנת ריאגנטים לטקס למטרות אחרות, antisera המתאים ובלבד זמין ונהלי QC נאותים יאומצו.

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) הוא אחד גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה בילדים מתחת לגיל חמש שנים ברחבי העולם, במיוחד בהגדרות משאבים לעניים 1,2. טווחי מחלה דלקת ריאות מפני זיהומים מקומיים לסכנת חיים בתנאים כגון דלקת ריאות, אלח דם ודלקת קרום מוח 1,2. יותר מ 90 קפסיד של pneumococci זוהו על בסיס הבדלים בפוליסכריד קופסית 3. חיסונים הנוכחיים למקד את פוליסכריד קופסית ולספק הגנה מפני הזנים אל העיקריים בגרימת מחלה פולשנית 4. Serotyping דלקת ריאות מבודדות הוא חשוב להערכת ההשפעה של חיסון על כרכרה ומחלה, כמו גם מתן מידע אפידמיולוגיים רחב יותר 5,6. השיטה הנוכחית &quot;תקן זהב&quot; לserotyping דלקת ריאות היא מבחן Quellung, אבל זה זמן רב ודורשת מיומנות מסוימת לperform 7. התלכדות לטקס היא שיטת serotyping חלופה המומלצת על ידי ארגון הבריאות העולמית 7. התלכדות לטקס היא מהירה וקלה לביצוע, והוא מועסק במעבדות רבות בעולם 8-11. חשוב לציין, התלכדות הלטקס הוכיחה דיוק דומה למבחן Quellung לserotyping דלקת הריאות 10,12-14. בסך הכל, שיטה זו היא אידיאלית עבור הגדרות משאבים לעניים, כמו גם מעבדות תפוקה גבוהה. ריאגנטים התלכדות לטקס (&#39;ריאגנטים לטקס&#39;) נוצרים על ידי ההתקשרות של נוגדנים לחלקיקי לטקס 15. בתגובה חיובית, חלקיקים אלה שכותרת agglutinate בנוכחות של אנטיגן הספציפי. ריאגנטים לטקס מסחריים זמינים לטווח מוגבל של סרוטיפים. ניתן גם מגיבים מוכנים לטקס בבית באמצעות מסחרי antisera זמין 10. תערובות של antisera (&quot;בריכות&quot;), כמו גם antisera הספציפי לים דלקת ריאותerogroups (למשל, קבוצה 19), זנים אל פרט (למשל, סרוטיפ 5), ולאנטיגנים ספציפיים (&#39;גורמים&#39;, למשל., 19c גורם הכרת 19A סרוטיפ) להגדרה נוספת קפסיד בתוך קבוצות זמינות 16. כתב יד זה מתאר את השלבים העיקריים בייצור של חומרים כימיים לטקס באמצעות קובץ מצורף פסיבי של antisera זמין המסחרית לחלקיקי לטקס. היבטי בקרת איכות (QC) של שיטה זו מתוארים, ופרוטוקול לשימוש בחומרים כימי לטקס לserotyping דלקת ריאות כלול.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1085">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:263px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:299px;">Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">65984-10 ml-F</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:180px;">Antibodies Australia&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NRS-1ml</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required, bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:299px;">Pneumococcus (Neufeld) antisera</td>
			<td style="width:180px;">SSI Diagnostica</td>
			<td style="width:127px;">Various</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:299px;">Sterile Bovine Albumin&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">A-4503</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Sodium azide 10% (v/v) solution&#160;</td>
			<td style="width:180px;">VWR International</td>
			<td style="width:127px;">ROAC3902/100ml</td>
			<td style="width:263px;">Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:127px;">0030 120.094</td>
			<td style="width:263px;">Round bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10241.AP</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">Calibrated disposable inoculating loops 1 &#181;l</td>
			<td style="width:180px;">Copan</td>
			<td style="width:127px;">CD175SO1</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:299px;">Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">LBS 2950RC</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">5 M NaOH</td>
			<td style="width:180px;">BDH</td>
			<td style="width:127px;">10252</td>
			<td style="width:263px;">Caution: highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glycine</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10119.05</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Horse Blood Agar (HBA) plates</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">PP2001</td>
			<td>Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Rotating wheel</td>
			<td style="width:180px;">Wyble Engineering Development Corporation</td>
			<td style="width:127px;">Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:299px;">Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td>
			<td style="width:180px;">Technoplas</td>
			<td style="width:127px;">S5016SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">60 ml syringes without needles</td>
			<td style="width:180px;">Terumo</td>
			<td style="width:127px;">SS-60L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:180px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:127px;">SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Brochure on Neufeld antisera</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>Key to determining serotypes 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Key to pneumococcal factor serum</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td align="right" style="width:127px;">18058</td>
			<td style="width:263px;">For determining serotype within Groups 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">*alternative sources are available for most materials</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

תגובת לטקס חיובית מתרחשת כאשר נוגדנים מסוג ספציפי שצורפו לחלקיקי הלטקס נקשר לכמוסה של pneumococcus, והתלכדות של חלקיקי הנוגדן שכותרתו מתפתחת 15. איור 1 א מציג תגובה חיובית המתאפיינת בהתלכדות וסליקה גלויות של הרקע השעיה. תגובה שלילית מאופיינת בהשעיה מגיב התלכדות לטקס שנותרה חלק ולבן (איור 1). ריאגנטים מותאמים כך שתגובה חיובית יש לשים לב לפני סוף המרווח דק &#39;פעם אחת (בדרך כלל להבחין בכ 20 שניות). אנחנו לא ממליצים לקרוא את תגובות אחרי פרק זמן 1 דקות. לעתים רחוקות, תגובות להציג התלכדות חלשה מסביב לקצה של הירידה שאינו מלווה על ידי ניקוי של ההשעיה הרקע, או להופיע &quot;סיבי&quot; ללא סליקת רקע (מידע לא מוצג). אלה הם רוב כמו<html> תגובות שליליות ly. במקרים כאלה, אנו ממליצים retesting ו / או חקירה נוספת בשיטה אחרת serotyping (לדוגמא תגובת Quellung 17). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> 1 תגובות איור חיוביות ושליליות התלכדות לטקס. תכשירים מדלקת ריאות לבודד מעורבים עם מגיב התלכדות הלטקס מראה תגובה חיובית () או תגובה שלילית (B). התלכדות מלווה בסליקה של הרקע נראית בתגובה החיובית () .There אין התלכדות גלויה עם מגיב לטקס ביקורת השלילי או בתגובה שלילית בדיקה (B). תמונות 8 בשימוש באישור.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; לוחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination at JoVE.com

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

בדיקות התלכדות לטקס היא שיטה פשוטה, מהירה וזולה לserotyping Streptococcus pneumoniae, וגם כבר מיושמות באופן נרחב במיקרוביולוגיה אבחון. כתב יד זה מתאר את הייצור של חומרים כימיים התלכדות לטקס, נהלי בקרת איכות ובבית היישום של טכניקה זו לserotyping דלקת ריאות.

קופסית Serotyping של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; על ידי לאטקס התלכדות

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

capsular-serotyping-of-streptococcus-pneumoniae-by-latex-agglutination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.7K Views.  Murdoch Childrens Research Institute.  בדיקות התלכדות לטקס היא שיטה פשוטה, מהירה וזולה לserotyping Streptococcus pneumoniae, וגם כבר מיושמות באופן נרחב במיקרוביולוגיה אבחון. כתב יד זה מתאר את הייצור של חומרים כימיים התלכדות לטקס, נהלי בקרת איכות ובבית היישום של טכניקה זו לserotyping דלקת ריאות. ...

Video: Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

התלכדות חלקיקים שיטת זיהוי poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

ניטור שינויים בממברנה קוטביות, ממברנה יושרה, וריכוזי יון תאיים ב<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש צבעי ניאון

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

קופסית Serotyping של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש תגובת Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteomic פרופיל של המקרופאגים על ידי 2D אלקטרופורזה

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

הדמיה לא פולשנית של התגובה החיסונית המולדת בדגם דג הזברה הזחל של<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; זיהום

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

מודל Murine של הקבוצה B<em&gt; סטרפטוקוקוס</em&gt; נרתיקי Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

מודל דלקת ריאות חזק במכרסמי immunocompetent להערכת יעילות אנטיבקטריאלי נגד<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. אינפלואנזה</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; או<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...