פרויקט זה מומן על ידי מענק 1R03MH08127-01 ו7R03MH08127-02 מ-NIH לש לי, ועל ידי קרנות IMPACT ממחלקה לרפואה ב UAB לש לי. תמיכה מקרן Molette ואוניברסיטת אובורן זוכה להערכה. אנו מודים גם assistances הטכני מהגב &#39;Pulin צ&#39;ה ומר ולדימיר Musiienko במהלך העבודה.

1. תאים, וירוסים והתרכובות אנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים ב.ס. ר, נגזרת של כליות אוגר תינוק תאים (BHK) 10, במדיום של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) המכילה 5% עוברי עגל בסרום (FCS), פניצילין 100U/ml ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שלושת מבחני, תאי צלחת בDMEM עם FCS 1%, פניצילין 100U/ml ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, כמותאמים בעבר 5. בינוני זה התייחס כמדיום assay לכל שלושת מבחני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל התאים בחממה על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 ולחות 80-95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאק-לטהר ולהפיץ את הסוג 10 BTV (BTV-10) כפי שתואר לעיל 8. לדלל BTV-10 במדיום assay עבור כל מבחני מיועדים לכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את כל חומרי הבדיקה בDMSO כדי ליצור מניות עם ריכוז ב10 מ&quot;מ. אחסן את המניות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרכובות לריכוזים רצויים באמצעות מדיום assay ללייעדמבחני ד 2. </li></ol> 2. Assay מבוסס CPE באמצעות ערכת CTG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע ב.ס. ר לmicroplate 384 גם (שחור; פורמט ידי 16 x 24) באמצעות מתקן בחר MicroFlo. צפיפות הזריעה היא 5,000 תאים / היטב, וזריעת הנפח 20 μl לניתוח יעילות אנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים למשך 2-3 שעות עד שתאים מקבלים חסיד אל הצלחת ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת מתחם אנטי עם ריכוז סופי של 10 מיקרומטר היטב כל אחד. לערבב אותו לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל BTV לכייל רצוי ולהוסיף 5 BTV μl עם משרד הפנים מסומנים היטב כל אחד. לשליטה טובה, להוסיף 5 μl של תקשורת assay. דגירה התאים הנגועים ל72 שעות על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 ולחות 80-95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב72 HPI, הפשרה ולאזן חיץ CTG ומצע CTG lyophilized לטמפרטורת חדר לפני השימוש. מחדש את הפתרון מגיב CTG הומוגנית על ידי ערבוב של האנזים / מצע lyophilized ומגיב חיץ על פי ההוראות יצרן דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את צלחות assay לטמפרטורת חדר במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה (25 μl) של חומרים כימיים CTG היטב כל אחד על ידי מתקן. לאחר דוגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר בחושך, למדוד אותות הארה באמצעות קורא מצב מרובה עם זמן אינטגרציה של 0.1 שניות. </li></ol> 3. Assay מנת התגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע ב.ס. ר לmicroplate 384 גם (שחור; פורמט ידי 16 x 24) באמצעות מתקן, עם צפיפות זריעה של 5,000 תאים / גם בזריעת נפח 20 μl עבור assay יעילות אנטי ו25 μl עבור assay cytotoxicity, בהתאמה . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים למשך 2-3 שעות על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 ולחות 80-95% עד תאים המחוברים היטב לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> assay תהליך באזור רבע מהצלחת 384 גם לכל מתחם (שווה ערך לצלחת 96 היטב), כפי שמוצג בטבלה 1. להקצות שמונה חזרות לכל ריכוזבassay אחד. הקצה את העמודה הראשונה כביקורת החיובית מבלי להוסיף מתחם ווירוס, והעמודה האחרונה (ה 12) כביקורת שלילית על ידי הוספת וירוס רק בלי תרכובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרכובות 50 מיקרומטר במדיום assay ולהוסיף לעמודה 2 nd ב20 μl / גם עבור assay יעילות אנטי. מערבבים את המתחם חמש פעמים באמצעות פיפטה חצי האוטומטית 8 ערוצים לריכוז של 25 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה חצי אוטומטית 8 ערוצים, להעביר 20 תערובת μl ב2 nd עמודה לעמודה הבאה (3 rd), ומערבב היטב כדי ליצור ריכוז של 12.5 מיקרומטר. חזור על תהליך זה על ידי העברת 20 תערובת μl מעמודת 3 ​​rd לעמודה הבאה (4 th) לצורה אחרת דילול כפול עם ריכוז של 6.25 מיקרומטר. חזור על הפעולה דילול סדרה כפול זה עד עמודת -11. לשאוב ולזרוק 20 μl של התערובת בעמודת ה 11 לאחר הוספת וערבוב compound. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת BTV-10, המבוסס על משרד הפנים של 0.01, לכל אחד גם מעמודה 2 לעמודה 11 בהיקף של 5 μl / טוב. לאחר הוספת הווירוס, ריכוז התרכובת הסופי בכל עמודה צריך להיות: 20 מיקרומטר בעמודה 2, 10 מיקרומטר בעמודה 3, והמשיך בדילול כפול למטה לעמודת 11 עם ריכוז סופי של 0.04 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של מדיום לעמודה 1 כתא שליטה בלבד (חיובית) וμl 5 / היטב BTV לעמודה 12 כזיהום BTV רק שליטה (שלילית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרכובות לריכוז ראשוני של 200 מיקרומטר עבור assay cytotoxicity. בדומה לכך, להוסיף 25 μl / טוב של מתחם לעמודה 2 ומעורב 5x עם פיפטה חצי אוטומטית 8 ערוצים לריכוז של 100 מיקרומטר. אל תוסיף BTV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את דילול הסדרה הכפול על ידי aspirating 25 μl מעמודה 2 לעמודה 3 השכן, ונמשך עד העמודה האחרונה (ה 12). בעמודה 12, לאחר הערבוב, לשאוב ולזרוק 25 μl של מ &#39;ixture. הריכוז הסופי בעמודה 2 צריך להיות 100 מיקרומטר ועמודת ה 12 צריכה להיות ב0.2 מיקרומטר. עמודת 1 היא השליטה היחידה בתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שני מבחני יעילות ורעילים לתאי נגיפים, דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 ולחות 80-95% ל72 לאחר טיפול שעה. למדוד כדאיות תא באמצעות ערכת CTG כפי שתואר לעיל (פרוטוקול הצעדים 2.5-2.7). </li></ol> 4. בזמן של תוספת Assay (TOA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הזרע ב.ס. ר מהעמודה 1-24 בmicroplate 384 גם (שחור; פורמט ידי 16 x 24) באמצעות מתקן ב5,000 תאים / היטב וזריעת הנפח 15 μl / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל מתחם, לנצל את כל העשרים והארבע עמודות עם שמונה העתקים לכל נקודת זמן במחצית של צלחת 384 גם (טבלה 2). הקצה עמודת 1 כשליטה רק תאים על ידי הוספת 10 μl / גם מדיום assay. מארק עמודה 24 כזיהום BTV רק שליטה (בקרה שלילית) על ידי הוספה בינונית 5 μl / גם assayוירוס ד 5 μl / גם במשרד הפנים של 0.01 לנפח סופי של 25 μl / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את העמודות הזוגיות מעמודת 2-22 עמודת הערכת יעילות אנטי כבשעות שלאחר זיהום שונה (HPI). בטורים אלה, להדביק תאים עם 5 μl / טוב BTV במשרד הפנים של 0.01. בHPI שונה, גם להוסיף 5 μl / מתחם מדולל היטב היטב כל אחד כדי ליצור נפח סופי של 25 μl / טוב. למסומן -2 ו -1 HPI להוסיף מתחם לתאים ב.ס. ר לפני הדבקת BTV. ל0 HPI, להוסיף את המתחם וBTV לתרבות בו זמנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, לייעד את עמודות אי זוגיות מעמודת 3-23 כמתחם שולט בלבד, מתוכם מתחם נוספו בזמן נקודות שונות כמיועד (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 HPI). בטורים אלה, להוסיף 5 μl בינוני / טוב assay ו5 μl / מדולל היטב מתחם כדי ליצור נפח סופי של 25 μl / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טיפול, דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% לחות 2 עם 80-95% CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע כדאיות תא ב72 HPI באמצעות ערכת CellTiter-Glo כפי שתואר לעיל (פרוטוקול הצעדים 2.5-2.7). </li></ol> 5. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את כל הנתונים הראשונים באמצעות תוכנה מתאימה בבית תוך שימוש באיתותים זורח הושגו באמצעות הקורא במצב מרובה. קבע את הערך הממוצע (הממוצע), סטיית תקן (STDEV) עבור כל טיפול, כמו גם וריאציות המקדם (CV), המחייב את ערך שאינו עולה על 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הנתונים המעובדים מהתוכנה הנ&quot;ל לכלי תוכנת biostatic והגרפי. לבצע את ניתוח רגרסיה שאינו ליניארי כדי לקבוע את הערכים של EC 50 ו50 CC. </li></ol>

<ol>
	<li>Hemati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bluetongue+virus+targets+conventional+dendritic+cells+in+skin+lymph.">Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph.</a> J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Virostatic+Agents+against+Bluetongue+Virus.">Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus.</a> PLoS ONE. 7, e43341 (2012).</li><li>Meiswinkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2006+outbreak+of+bluetongue+in+northern+Europe--the+entomological+perspective.">The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective.</a> Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).</li><li>Szmaragd, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+and+case+fatality+during+the+recurrence+of+BTV-8+in+northern+Europe+in+2007.">Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007.</a> Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).</li><li>Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+and+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Bluetongue+virus.">Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus.</a> Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).</li><li>Noah, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+luminescence+assay+is+effective+for+high-throughput+screening+of+potential+influenza+antivirals.">A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals.</a> Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).</li><li>Che, P., Wang, L., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+optimization+and+validation+of+an+assay+for+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Dengue+virus.">The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).</li><li>Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aedes+albopictus+inhibitor+of+apoptosis+1+gene+protects+vertebrate+cells+from+bluetongue+virus-induced+apoptosis.">The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis.</a> Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).</li><li>Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+MTT+and+ATP-based+assays+for+the+measurement+of+viable+cell+number.">Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number.</a> J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li><li>Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+human+rhinovirus+infectivity+cell-based+assay+for+identifying+antiviral+compounds.">Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds.</a> J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).</li><li>Harvey, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline-inducible+packaging+cell+line+for+production+of+flavivirus+replicon+particles.">Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles.</a> J. Virol. 78, 531-538 (2004).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triaryl+pyrazoline+compound+inhibits+flavivirus+RNA+replication.">Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+protection+against+the+highly+pathogenic+H5N1+influenza+virus+by+an+antisense+phosphorothioate+oligonucleotide.">In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide.</a> Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).</li><li>Ray, D., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+flavivirus+antiviral+drug+discovery+and+vaccine+development.">Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development.</a> Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).</li><li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+100,000-compound+library+for+inhibitors+of+influenza+A+virus+(H3N2).">High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2).</a> J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).</li><li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+high-throughput+screen+for+inhibitors+of+SARS+CoV+and+its+application+in+screening+of+a+100,000-compound+library.">Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library.</a> J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).</li><li>Bolken, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+potent+small+molecule+inhibitor+of+hemorrhagic+fever+New+World+arenaviruses.">Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses.</a> Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).</li><li>Van Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+cellular+screening+assay+for+the+discovery+of+HIV-1+integrase+inhibitors.">A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors.</a> J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).</li><li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses.">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li><li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques.">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

לזיהוי הראשוני של להיטים אנטי, אחד הצעדים המרכזיים לגילוי תרופות אנטי ופיתוח הוא לפתח מבחני חזקים, הכולל בחירת סמן לכימות, פיתוח פרוטוקול פשוט, קבלת אותות מספיקים וקורות חיים פחות מ -10%. רוב המסכים ביוכימי או מבוסס תאים נועדו לספק נקודת התחלה כימית המבוססת על assay חזק ביותר, הפשוט וזול, בשל שחזור נדרש בתהליך המיון והמספר פוטנציאלי הגדול של מולקולות שיוקרנו. Assay מבוסס CPE היה מיועד כדי לעמוד בדרישות אלה כדי לזהות להיטים יעילים מספריית מתחם גדולה. CPE מתייחס להשפעה השלילית על התאים בתרבית הקשורים להכפלה של וירוסים. מבחני שונים זמינים לשימוש מחוון CPE באמצעות מדידת מגוון רחב של סמנים שונים המציינים את מספר התאים המתים (cytotoxicity), מספרם של תאי חיים (כדאיות), והמנגנוןשל מוות של תאים (אפופטוזיס). ריאגנטים מסחריים עבור assay מבוסס CPE זמינים עם פרוטוקול assay פשוט. לדוגמא, ערכת CTG כוללת את הצעד &quot;לערבב ולמדוד&quot; אחת וכבר בשימוש נרחב לכמת CPE וירוס מושרה. עם זאת, assay מבוסס CPE מוגבל לוירוסים שיכולים לגרום לCPE המהיר. לוירוסים שלא לגרום CPE המהיר, מבחני שונים פותחו. לדוגמא, מבוסס assay replicon באמצעות שורת תאי מחסה-replicon מאפשר הקרנה למעכבים של שכפול נגיפי, כוללים תרגום, עיבוד polyprotein, ומינוס ופלוס גדיל סינתזה RNA 12-14. אסטרטגיות RNA antisense וההקרנה וירטואלית של ספריות מולקולה קטנה יכולים לשמש גם כדי לזהות antivirals האפשרי 15,16. עם זאת, זה קריטי, כי היעילות של תרופה אנטי להיות מאומתת בassay מבוסס תאים במבחנה המאפשר ההערכה של יעילות אנטי נגד מחזור החיים הנגיפי השלם. מבוסס CPEassay הותאם בהצלחה לפורמט תפוקה גבוהה, והוא אחד של assay אמין ויציב ביותר להקרנה של ספריות מתחם גדולות, כוללים הקרנות HTS נעשו לאחרונה נגד נגיף שפעת 6,17, קורונה תסמונת החמורה חריפה בדרכי הנשימה (SARS-COV) 18 , Arenaviruses 19, וreovirus (וירוס Bluetongue) 5. Assay מנת התגובה היה מיועד כדי לאמת עוד יותר את היעילות אנטי של הנפילות באמצעות assay מבוסס CPE המנה הבודד, בדרך כלל לאחר הקרנת ספריית מתחם גדולה. הלהיטים הללו, למרות שהיו מזוהים עם פעילות אנטי, צריכים אישור נוסף כדי לחשוף את הפוטנציאל שלהם להפוך לתרופה. יעילות אנטי של מתחם יכולה להתגלות דרך הניתוח באמצעות 50 EC, 50 CC וערך SI 50 באמצעות ניתוח התגובה במינון. בינתיים, יצאתי מחוץ ליעד או חיובי שגוי יהיה מזוהה, ומספר comp הראשיounds יכול להיות הצטמצם. באמצעות ניתוח זה, בסדר הגודל של חוזקי מתחם ורעילים יכול להיות מדורג לכוון גילוי תרופות אנטי עתיד, במיוחד עבור הקשר בין מבנה לפעילות (SAR) ניתוח ושינוי כימיה רפואית בעתיד. למעשה, מתחם C052 היה נגזר של C003 מתחם, הקשורים במאפיינים כמו סמים טובים הן במבחנה in vivo. כדי לעמוד בדרישות לסמים, הוא חייב לקבוע משרד החקלאות שלה, כלומר לאפיין את האינטראקציה של מתחם עם היעד שלה בריכוזים פיסיולוגיים. מבחני שונים פותחו של antivirals המסוים, כלומר לעכב לא רק היעד, אלא יש לי מסיסות מקובלת, חדירות, חלבון פרופילים מחייבים, סלקטיביות, חילוף חומרים ורעילות. מאז מחקרי משרד החקלאות היו assay נמוך התפוקה צורך מאמצים מייגע, רק כמה מולקולות שנבחרו, עם 50 EC החזק, גבוה CC 50 ושעותigh SI 50 ערך, יכול להיות מנותח בקלות. הבנת משרד החקלאות של מתחם, בשלב זה ניתן להוסיף עומק לפרשנות של פעילות תאית או היעדרה. מחקר TOA מיועד כדי לצמצם את השלב שבו נגיפים אינטראקציה עם מטרות נגיפיות או מארח. ידיעת מתחם היא תחרותית עם מצע בשלב מחזור חיים נגיפי מסוים יכול לספק כיוון מיידי לניתוח משרד חקלאות נוסף. לחלופין, assay תא חזק יותר מבוסס עם מנגנון ידוע, כולל assay ישירות למסך למעכבי אינטגראז HIV-1 20, עיכוב וירוס מחייב אל פני השטח חלבון 21 יכולים לשמש אשר מספקים משרד חקלאות ידוע לפני הקרנות בפועל 22. בעוד להיטים מהקרנה אלה עשויים להיות קשורים היטב למשרד החקלאות המיועד, יש למעשה משרד חקלאות עשויה גם צריכה להכפיף לTOA ומנגנון אחר של מחקרי פעולה. לסיכום, באמצעות שלושה מבחני שדווחו כאן, יש לנו הוקרנו בהצלחה וזוהוכמה תרופות אנטי חזקות נגד BTV, כולל C003 וC052 2. בפרט, SI 50 (של C052 היה עד ב306, אשר הציע כי C052 הוא מאוד סלקטיבית נגד BTV. ויה TOA ומחקרי משרד חקלאות אחרות שהוצגו בנייר המקורי, שהצענו כי C052 יכול להיות סוכן אנטי פוטנציאל אינטראקציה עם מארח מכונות autophagy, יכולה להיות מפותחות לתרופה נגד BTV.

BTV הוא וירוס RNA כפול גדילי אב טיפוס בסוג Orbivirus, משפחת Reoviridae. BTV הוא אחת המחלות החשובות ביותר של בעלי חיים מקומיים, ובם כבשים, עז, בקר וחיות בית אחרות, עם אובדן 3000000000 $ / שנה ברחבי העולם 1,2. סרוטיפ BTV האקזוטי הוא פתוגן בעלי חיים חשוב מופיע בסעיף &#39;פתוגנים משק החי התוצאה USDA גבוהה &quot;. לאחרונה, מחדש מתפתח של BTV גרם להתפרצות גדולה של מחלה בבקר וצאן במספר המדינות באירופה הצפונית 3,4. כתוצאה מהמשמעות הכלכלית שלה כמערכת מודל, BTV כבר את הנושא של מחקרים מולקולריים, גנטיים ומבניים נרחבים, ומספר חיסונים פותחו. עם זאת, בשל המחסור במבחנים ראויים לגילוי תרופות אנטי, אין antivirals זמין נגד BTV. בהקרנת תפוקה גבוהה לאחרונה במסע פרסום (HTS) תוך שימוש BTV כמערכת המודל, אנחנו דeveloped, מותאם ומאומתים assay מבוסס CPE לזהות antivirals ספקטרום רחב הפוטנציאלי נגד arboviruses 5. assay מבוסס CPE הוא assay מוכר היטב כי כבר בשימוש בגילוי תרופות אנטי נגד מספר הווירוסים שנגרם CPE / אפופטוזיס המהיר והנצפה 5-7. במערכת שלנו, זיהום BTV הודעה, CPE בא לידי ביטוי בתאים בעלי חוליות, כוללים הלה, ב.ס. ר, וHEK 293T 8. CPE-Induced BTV יכול להיות במעקב ולכמת באמצעות שיטות זיהוי כדאיות תא שונות, כוללים ערכת CellTiter Glo מגיב כדאיות תא (ערכת CTG) 9. ערכה זו קובע את מספר תאי קיימא בתרבות המבוססת על quantitation של ה-ATP הסלולרי הוצג, מה שמסמן את נוכחותם של תאי חיים פעילים מטבולית. בתנאים אופטימליים, מבוסס assay CPE מוצג כאן הראה ההיתכנות שלה עם הפרוטוקול &quot;לערבב ולמדוד&quot; צעד אחד, וגמישות עם אותות זורח יציבים. בינתיים, Redu תרכובות רעילותcing כדאיות תא לא ייכללו בassay מבוסס CPE זה. Assay מבוסס CPE הראה עמיד ואמין לגילוי תרופה אנטי נגד BTV שלה, ומאז משמש למסך NIH הספריות מולקולריות המולקולה קטנה Repository (MLSMR), מה שמוביל לזיהוי של שישה אשכול רומן של מתחם להוביל אנטי פוטנציאלי (ים &#39;) 5. כאשר תרכובת אנטי פוטנציאלית זוהתה באמצעות assay מבוסס CPE, זה יהיה צריך להיות חשוף לassay מנת תגובת עשר הריכוז כדי לקבוע את טווח היעילות וcytotoxicity 2 אנטי. היעילות אנטי, מיוצג כ50% הריכוז המעכב (50 IC) או 50% הריכוז היעיל (50 EC), היא הריכוז של תרופה אשר מעכבת באמצע הדרך CPE-induced וירוס בין קו הבסיס והמקסימום. Cytotoxicity של antivirals, כלומר ריכוז 50% cytotoxicity (CC 50), הוא הריכוזשל תרופת גרימת 50% מcytotoxicity בין קו הבסיס והמקסימום. המדד סלקטיבית (SI), מסומן כ50% SI (50 SI) מחושב מCC 50 / IC 50 הקובע את הספציפיות של נגיפים נגד CPE-induced וירוס. IC 50 (או 50 EC), CC 50 וSI 50 ערכים הם צעדים קריטיים כדי לקבוע אם תרכובת אנטי היא חזקה ובררנית לפיתוח תרופות נוסף. כאשר נגיפים לא הראו כל רעילות גלויה במבחנה, אך וירוס מנע מושרה CPE ומחזור החיים הנגיפי היעיל, חשוב לאפיין משרד החקלאות שלה 2. אנחנו יזמנו אפיון כזה על ידי ביצוע assay TOA כדי לקבוע את הצעד האפשרי (ים) של מחזור החיים נגיפי שמושפע אנטי. באופן כללי, מתחם אנטי נוספו לתאים בזמנים שונים מראש או זיהום שלאחר וירוס. אם antivirals נוספו לתאים הנגועים לפרסם ליעד שלהTEP במהלך ההדבקה, הוא יביא לפעילות נמוכה יותר בהשוואה לזו שהתווסף לפני הצעד. לכן, מחקר TOA הוא קריטי לקביעת היעילות אנטי של מתחם, והיעד הפוטנציאלי שלו, או על מחזור החיים הנגיפי או מכונות המארח מעורבות במחזור החיים הנגיפי. לכל שלושת מבחני, כדאיות תא נקבעה באמצעות ערכת CTG בעקבות ההוראה של היצרן 5. מערכת זיהוי זה פלטי אותות הארה הולמים שיכול להיות מנותח באמצעות תוכנות שונות בבית. כל assay קבל תוקף ומתבצע לפחות בשלושה העתקים עם שמונה העתקים. לכל הנתונים שהתקבלו, שלושה פרמטרים, כולל ערך ממוצע (AVE), סטיית תקן (STDEV), ווריאצית שיתוף יעיל (CV) נותחו על מנת לקבוע את החוסן של assay. ברגע שהחוסן של assay נקבע, הנתונים ינותחו נוספים וזממו באמצעות יוסטאטיקה וgraphi שוניםכלים ג 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1134218</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1000185</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gbico</td>
			<td>1049769</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>TB288</td>
			<td>For cell viability measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Diluted from 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiviral huashilcompounds</td>
			<td>NIH MLSMR and de novo synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTV-10</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSR cell</td>
			<td>Developed in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For luminescent signal reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo select dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Adding cells, virus, and reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom microplate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>28908031</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen. 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 5</td>
			<td>For biostatic analysis and plot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus

לזהות antivirals הפוטנציאלי נגד BTV, פיתחנו, מותאם ומאומתים שלושה מבחני שהוצגו כאן. Assay מבוסס CPE היה assay הראשון שפותח כדי להעריך אם מתחם הראה שום יעילות אנטי ושמש למסך ספריית מתחם גדולה. בינתיים, cytotoxicity של antivirals יכול גם להיות מוערך באמצעות assay מבוסס CPE. Assay מנת התגובה נועד לקבוע את טווח היעילות לנגיפים שנבחרו, כלומר 50% ריכוז מעכב (IC 50) או ריכוז יעיל (50 EC), כמו גם מגוון של cytotoxicity (CC 50). Assay TOA הועסק ללימוד משרד החקלאות הראשוני כדי לקבוע את המנגנון הבסיסי של antivirals הרומן במהלך מחזור חיים נגיפיים BTV או ההשפעה האפשרית על מנגנון תאי מארח. מבחני אלה הם חיוניים להערכת יעילות אנטי במערכת תרבית תאים, והיה בשימוש במשך המחקרים האחרונים שלנו להובילing לזיהוי של מספר התרופות אנטי רומן נגד BTV.

1. יעילות אנטי של מתחם Assay CPE מבוסס התאים פותח, מותאם ותוקף במבחנה באמצעות ערכת CTG מבוסס זורח לזהות antivirals רומן נגד BTV כפי שתואר לעיל 2,5. Assay התגובה עשרה המינון הועסק כדי לשקף את היעילות ורעילה לתאי נגיפים של מתחם להוביל זוהה על ידי מדידת מספר תאי קיימא מטבולית בתרבות המבוססת על quantitation של ה-ATP הסלולרי הוצגה בתאים חיים 5,11. בדו&quot;ח הקודם שלנו, מספר התרכובות אנטי פוטנציאל הוערכו, כולל תרכובות מכל אשכול שזוהו באמצעות HTS נגד BTV 5, ונגזרים שלהם באמצעות דה נובו סינתזה 2. בהתבסס על EC 50, CC 50 ו50 SI, כמה תרכובות יתרון מבטיחות זוהו עם יעילות רבת עוצמה אנטי, רעילות נמוכה וסלקטיביות גבוהה. לדוגמא, compound052 (C052)היה נחוש בדעה יש לי EC 50 של 0.27 ± 0.12 מיקרומטר (איור 1) 2 ו CC 50 של 82.69 מיקרומטר, שני עקומות רגרסיביות טיפוסיות מראים מתחת לרגרסיה שאינה ליניארי מנתח 2. SI 50 של C052 נקבע ב306 מבוסס על EC 50 וCC 50 ערכיה. היעילות בקנה מידה nanomolar אנטי, רעילות נמוכה, וכתוצאה מכך גבוהים SI 50 ציינו כי C052 עשוי להיות אנטי חזק וסלקטיבית נגד BTV. 2. משרד חקלאות פוטנציאל למתחם אנטי Assay TOA נועד כדי לקבוע במה האפשרית (ות) של מחזור החיים נגיפי הממוקד על ידי תרכובות. בעת הוספת C052 בשעה 1 או 2 לפני הדבקת BTV, כלומר -1 ו -2 HPI, efficacies אנטי נשאר בקנה מידת nanomolar (איור 2) 2, המציין כי C052 עלול לפעול מעבר לשלב המוקדם של מחזור החיים נגיפי, כגון כניסת וירוס. Furthermore, היעילות אנטי נותרה ללא שינוי עד C052 התווסף לתאים נגועים כמאוחר יותר כ24 HPI. כאשר נוספו ב32 HPI, אחוז תאי קיימא ירד בתאי טיפול C052, המציין כי C052 היה פחות מגונן בשלב זה של מחזור החיים נגיפי. כאשר נוספו ב48 HPI, לא הייתה שום הגנה לתאים ב.ס. ר מCPE-Induced BTV. מאז המחזור של שכפול הנגיפי BTV בדרך כלל סיים בתאים נגועים בתוך 24 HPI הראשון, התוצאות שלנו הציעו שC052 עלולה לפעול בשלבים המאוחרים של מחזור החיים נגיפי BTV, כמו שכפול של נגיף, אריזה, התבגרות ויציאה. בינתיים, אפשר גם שC052 עשויה לפעול במנגנונים תאיים מארח שהיו מעורבים במהלך מחזור החיים נגיפי מאוחר 2. <img alt="טבלת 1" src="/files/ftp_upload/50820/50820table1.jpg" /> טבלת 1. פריסת הצלחת עבור assay מנת התגובה. היעילות אנטי של C052 הייתה להעריך<html> ד בהיקף 96 היטב בתוך הצלחת 384 גם. כל טיפול, כולל זיהום BTV תוספת ריכוזי C052 שונים, בוצע עם שמונה העתקים. ב72 HPI, כדאיות תא נקבעו באמצעות ערכת CTG. <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/50820/50820table2.jpg" /> שולחן. 2 פריסת הצלחת עבור assay בזמן של תוספת (TOA). Assay TOA של C052 הוערך בצלחת 384 גם כפי שצוין בפריסה. כל טיפול, כולל זיהום BTV בתוספת זמן של הוספת C052, בוצע בשמונה העתקים. HPI -2 ו -1 מצביע על כך שC052 התווסף לתאים לפני זיהום BTV. ב 0 HPI, BTV וC052 נוספו בו זמנית. ב72 HPI, כדאיות תא נקבעו באמצעות ערכת CTG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50820/50820table2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לקבלת לוח.</a> ithin-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/50820/50820fig1.jpg" /> איור 1. היעילות אנטי של C052. תאים היו נגועה בBTV במשרד הפנים של 0.01 בנוכחות של עשרה ריכוזים שונים של C052, כפי שצוינה באיור. כדאיות תא נקבעו ב72 HPI, שימוש בערכת CTG. כל נקודת נתונים מייצגת אמצעים וSD מחמש חזרות. נתון זה שונה מהגו et al. 2012 2. <img alt="איור 2" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/50820/50820fig2.jpg" /> איור 2. Assay הזמן של בנוסף לC052. C052 ב2.5 מ&quot;מ ו0.27 מ&quot;מ, בהתאמה, התווסף לתאי BTV נגועים בHPI שונה כפי שצוין, וההגנה של C052 נגד CPE BTV המושרה, או כדאיות תא, נמדדה באמצעות ערכת CTG ב72 HPI כל נקודות נתונים מיוצגות הערך הממוצעs ו-SD משל שמונה חזרות עצמאיות. נתון זה שונה מהגו et al. 2012 2.

Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus at JoVE.com

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

שלושה מבחני, כולל השפעת cytopathic (CPE) מבוססת assay, assay מנת התגובה וassay בזמן של תוספת (TOA) פותחו, אופטימיזציה, תוקף ומנוצל כדי לזהות antivirals רומן נגד וירוס Bluetongue (BTV), כמו גם כדי לקבוע את הפעולה מנגנון-of-האפשרית (משרד חקלאות) לantivirals זיהה לאחרונה.

מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

assays-for-identification-novel-antivirals-against-bluetongue

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.9K Views.  University of Alabama at Birmingham.  שלושה מבחני, כולל השפעת cytopathic (CPE) מבוססת assay, assay מנת התגובה וassay בזמן של תוספת (TOA) פותחו, אופטימיזציה, תוקף ומנוצל כדי לזהות antivirals רומן נגד וירוס Bluetongue (BTV), כמו גם כדי לקבוע את הפעולה מנגנון-of-האפשרית (משרד חקלאות) לantivirals זיהה לאחרונה. 

Video: Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

קביעת ריכוז נגיפית באמצעות לוחית מבחני: מערכות כיסוי שימוש מסורתיות וחדשני

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Immunofluorescence לפקח על הספיגה הסלולארית של לקטופרין האדם והפעילות הקשורה אנטי נגד וירוס הצהבת מסוג C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

פיתוח זיהוי של subpopulation רומן של אדם נויטרופילים הנגזר הענק Phagocytes<em&gt; במבחנה</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

קרינה המבוססת Assay Neuraminidase העיכוב להעריך את הרגישות של שפעת וירוסים אל Neuraminidase המונע המחלקה של תרופות אנטי-ויראליות

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

הקרנת מבחני לאפיין הרגולטורים אנדותל הרומן מעורבים בתגובה דלקתית

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

זיהוי של קידוד ללא קידוד RNA מחלקות לידי ביטוי החזירים דם מלא

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...