זהו הפרוטוקול הראשון המאפשר לרקמת השד האנושית להישמר בחיים ex vivo לפרקי זמן ממושכים המאפשר ישירות את חקר האינטראקציות בין רקמת השד האנושית לסרטן השד האנושי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחתיכות מקרוסקופיות של רקמת השד האנושית כולל אדיפוציטים בשד, תאים חיסוניים, מבני כלי דם, מבני צינור ומטריצה חוץ תאית להישמר בחיים ex vivo. טכניקה זו יש השלכות משמעותיות על מספר תחומים של מחקר סרטן השד כולל רפואה מותאמת אישית, פיתוח תרופות ואת הפתופיזיולוגיה של ייזום הגידול ותהליכי סרטן שד איטיים יותר כגון פיברוזיס ושיפוץ מטריצה חוץ תאית.
הוכחת הליך זה הם קתרין Hebert, סטודנט לתואר שני טוליין ורקש גורלה סטודנט לרפואה טוליין מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להמיס את הפתרון ג'לטין מוכן באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה סרולוגית חמישה או 10 מיליליטר לוותר על 2.5 מיליליטר של פתרון זה על כל בוכנה עבור בארות של צלחת שש באר.
לאחר ג'לטין התגבש, להעביר את לוחות ASC מקודד pNIPAAm לארון ביו בטיחות. בעדינות למקם את הבוכנות לתוך הבארות של צלחות אלה, כך ג'לטין יוצר קשר עם ASCs. מניחים מכונת כביסה מתכת על הבוכנה כדי לשקול אותו, כך ג'לטין נמצא במגע ישיר עם גיליון ASC במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
מעבירים בעדינות את הצלחת עם הבוכנות לתיבה הסטרילית בארון הבטיחות הביולוגי ומניחים עליה את המכסה. מעבירים את הקופסה למקרר של ארבע מעלות או מניחים את הצלחת על קרח ודלי קרח בארון הבטיחות הביולוגי למשך 30 דקות. בארון ביו-בטיחות, לשטוף את רקמת השד האנושית שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של PBS סטרילי.
השתמש מלקחיים סטריליים סכין גילוח כדי לטחון גס את BC-MPS ולנסות להסיר כמה שיותר fascia ורקמת חיבור ככל האפשר. לאחר רקמת החיבור הוסר להשתמש סכין גילוח סטרילי סוף סוף לרכך את הרקמה עד שיש לו עקביות נוזלי הומוגנית. חותכים את הקצה של קצה פיפטה P1000 כדי לסייע בצנרת הרקמה הטחונית.
בצינור של 1.5 מיליליטר, שלבו את רקמת הטחון, את קווי התאים הסרטנים ואת המדיה BC-MPS כמתואר בכתב היד של הטקסט. להעביר את לוחית ACS שישמש עבור גיליון התא התחתון מן החממה לארון ביו בטיחות לשאוף את התקשורת מהצלחת. פיפטה תערובת רקמת השד מוכן למרכז הבאר של צלחת ACS התחתון באמצעות קצה פיפטה לחתוך, להזיז את התיבה המכילה את צלחת ACS העליון עם בוכנות לארון ביו בטיחות.
מוציאים בעדינות את הבוכנות הג'לטין מהצלחת המצופה pNIPAAm ומניחים אותן על גבי תערובת הרקמות. הוסיפו את מדיית BC-MPS לבאר והזיזו בזהירות את לוחות ה-ACS התחתונים עם תערובת BC-MPS ובוכנות לתיבת הפלסטיק הסטרילית. מניחים את המכסה של התיבה על תחבורה, דואגים למנוע זיהום של התרבות.
דגירה את הצלחת התחתונה בתיבה ואת החממה 37 מעלות צלזיוס עד ג'לטין נמס ואת שכבת ACS העליון החלה לדבוק בשכבה התחתונה. לאחר מכן להעביר את התיבה עם הצלחות לארון ביו בטיחות, בעדינות להסיר את הבוכנות מן הצלחות התחתונות כדי להתבונן ברקמה עם תאים סרטניים מעוגנים לתחתית הבאר. מניחים את המכסה של צלחת שש באר בחזרה על הצלחת התחתונה ואת הדגירה ב 37 מעלות כדי להמיס לחלוטין את הג'לטין ולאפשר את השכבה העליונה לעגון לשכבה התחתונה.
בעדינות להעביר את הצלחות לארון ביו בטיחות לשאוף את התקשורת מקצה הבאר עם פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר. הוסף שני מיליליטר של מדיה טרייה על קצה כל באר כדי למנוע עקירת הרקמה. לשמור על BC-MPS ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני למשך הזמן הרצוי.
לשנות את התקשורת כל יומיים-שלושה. להעביר את הצלחת לארון ביו בטיחות כאשר BC-MPS מוכן לניתוח. הסר מדיה עם פיפטה סרולוגית כדי למנוע עקירה מקרית של כל רקמה.
הוסף אמצעי אחסון אחד של PBS לכל באר. לאחר מכן הסר את PBS עם פיפטה סרולוגית. הוסף מיליליטר אחד של פתרון ניתוק התא לכל באר והזז את הצלחת בחזרה לאינקובטור במשך חמש דקות כדי לאפשר לתאים אלה להתנתק.
לאחר הדגירה, השתמש במגרד תאים כדי לנתק לחלוטין את התאים ואת הרקמה מלוח התרבות בארון ביו-בטיחות. להעביר את הפתרון עם הרקמה צינור חרוט 15 מיליליטר ולאסוף את כל התאים הנותרים על ידי הוספת שני מיליליטר של PBS. לעטוף את הצינור עם רדיד אלומיניום אם התאים הם פלואורסצנטיים.
דגירה הצינור ב 37 מעלות תחת תסיסה מתמדת בשייקר מסלולית בבת אחת G במשך 10 עד 20 דקות כדי לנתק לחלוטין את התאים מהרקמה. בארון ביו-בטיחות, השתמש בפיפטה סרולוגית כדי לשבש את כל גושי התאים שנותרו בצינור. ולסנן את הדגימה דרך מסננת רקמת 250 מיקרו מטר לצינור חדש של 15 מיליליטר.
לשטוף את מסננת עם מיליליטר אחד של PBS כדי לאסוף את כל התאים הנותרים. צנטריפוגה הדגימות ב 500 פעמים g בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי להפריד את adipocytes אשר יהיה צף בשכבה העליונה מן התאים הסרטניים ASCs מעורבב יחד גלולה. מעבירים את שכבת האדיפוציטים לצינור חדש בעזרת קצה פיפטה קהה.
צנטריפוגה המדגם שוב ולהשתמש מזרק ומחט כדי להסיר את הפתרון הנותר מתחת adipocytes. לשאוף את הפתרון הנותר מן הצינור המכיל את ASCs ותאים סרטניים מבלי לשבש את גלולת התא. להשעות מחדש את גלולה במדיה PBS או BC-MPS ולהשתמש cytometry זרימה כדי למיין את התאים בהתבסס על פלואורסצנטיות.
התבנית בסיוע stri של גיליון ASC confluent מוצג כאן. רקמת השד האנושית המציפה עדיין הייתה יציבה מעוגנת על ידי יריעות התאים של ASC לתחתית הבאר לאחר 14 ימים של תרבות. תמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות מדגימות את היציבות של ה- BC-MPS עם MDA-MB-231 המבטאות קווי תאים RFP לאחר 14 יום ועם גידול שלילי משולש explant PDX לפחות שישה ימים.
BC-MPS המכיל רקמת שד היה תרבית במבחנה במשך 14 ימים, מוכתם ותמונה כדי להדגים את האלמנטים הילידים של הרקמה ב 100X ו 20X הגדלה. הכתמת סמני המקרופאג' שימשה לשימור מקרופאגים ראשוניים לאחר שלושה ושבעה ימים בתרבות. ניתוח cytometry זרימה של תאים מוכתמים בודיפי MDA-MB-231 לאחר 14 ימים מצביעים על הצטברות שומנים מינימלית בתרבות 2D הצטברות שומנים נרחבת BC-MPS.
שיעור תאי MDA-MB-231 חיוביים השומנים היה גדול פי 26.2 ב- BC-MPS מתרבות דו-ממדית. תאים בתרבית BC-MPS הציגו טיפות שומנים להגדיל בהשוואה לתאים בתרבית בתרבות דו-מימדית סטנדרטית. תמונות לשגות זמן של RFP שכותרתו BC-MPS עם MDA-MB-231 תאים הראו תנועה אמובואידית של 231 תאים עם תרמילים מדומים ותנועתיות גבוהה.
רקמת השד חייבת להיות טחון קטן מספיק ומופרד מספיק כדי להיות מופץ על פני החלק התחתון של הבאר. רקמת השד היא מאוד ציפה ואם החלקים גדולים מדי או מקובצים קרוב מדי זה לזה, גיליונות התא ASC לא יוכלו לעגן את רקמת השד לתחתית הבאר. סרטן רקמת השד וכתוצאה מכך מבנים יכולים לעבור עיכול אנזימטי כדי לבודד סוגי תאים מסוימים של עניין.
זה יאפשר לענות על שאלות מפתח כגון כיצד תאים סרטניים ברקמת השד מגיבים באופן שונה לכימותרפיה בהשוואה לתרבות דו-מימדית מסורתית או אורגנואידים.
