המימון ניתן על ידי NIH / NIAID מענק RO1-AI-63457 ו ערה להעניק תוספת RO1-AI-63457 S1. אנו מכירים את התרומה של כל חברי בעבר ובהווה של הקבוצה מעבדה ומשתפי פעולה.

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+of+leprosy+for+control+programmes.">Chemotherapy of leprosy for control programmes.</a> Technical Report Series. 675, 18-22 (1982).</li><li>Cole, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+gene+decay+in+the+leprosy+bacillus.">Massive gene decay in the leprosy bacillus.</a> Nature. 409, 1007-1011 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leproma+Web+Server.">Leproma Web Server.</a> Leproma Web Server [Internet]. , (2004).</li><li>Groathouse, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Polymorphic+Loci+for+Molecular+Typing+of+Strains+of+Mycobacterium+leprae.">Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 42, 1666-1672 (2004).</li><li>Young, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Short+Tandem+Repeat+Sequences+to+Study+Mycobacterium+leprae+in+Leprosy+Patients+in+Malawi+and+India.">Use of Short Tandem Repeat Sequences to Study Mycobacterium leprae in Leprosy Patients in Malawi and India.</a> Public Library of Science: Neglected Tropical Diseases. 2, E214-E214 (2008).</li><li>Monot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Variable-Number+Tandem+Repeats+Appropriate+for+Genotyping+Mycobacterium+leprae.">Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 46, 2291-2297 (2008).</li><li>Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Variable+Number+Tandem-Repeat+Genotyping+for+Mycobacterium+leprae+Clinical+Specimens.">Rapid Variable Number Tandem-Repeat Genotyping for Mycobacterium leprae Clinical Specimens.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 1757-1766 (2009).</li><li>Weng, X. i. a. o. m. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Distribution+of+Mycobacterium+leprae+Genotypes+in+a+Region+of+High+Leprosy+Prevalence+in+China:+a+3-Year+Molecular+Epidemiological+Study.">Identification and Distribution of Mycobacterium leprae Genotypes in a Region of High Leprosy Prevalence in China: a 3-Year Molecular Epidemiological Study.</a> J. of Clinical Microbiology. 45, 1728-1734 (2007).</li><li>Weng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+leprosy+in+Qiubei+County,+Yunnan,+China:+Insights+from+an+eight+year+molecular+epidemiology+investigation.">Transmission of leprosy in Qiubei County, Yunnan, China: Insights from an eight year molecular epidemiology investigation.</a> Infection, Genetics and Evolution. , (2010).</li><li>Sakamuri, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-Based+Molecular+Epidemiology+of+Leprosy+in+Cebu,+Philippines.">Population-Based Molecular Epidemiology of Leprosy in Cebu, Philippines.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 2844-2854 (2009).</li><li>Fontes, A. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+of+Mycobacterium+leprae+isolates+from+Brazilian+leprosy+patients.">Genetic diversity of Mycobacterium leprae isolates from Brazilian leprosy patients.</a> Leprosy Review. 80, 302-315 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אוסף דגימות עור מחולים צרעת דורש רופאים מיומנים או טכנאים עובדים במרפאות העור. עובדי המעבדה טיפול דגימות אלה צריכים להקפיד ללבוש חלוקי מעבדה, כפפות ללבוש עין מגן לעבודה בארון ביו בטיחות בעת הטיפול בדגימות של רקמות נגועות אדם או ארמדיל. חיטוי של משטחים וכלים גם קריטי. עבודה ממשלה נקייה, ביו בטוח סטרילי חשוב למניעת זיהום של דגימות DNA. מיצוי DNA הפכה קלה יחסית הודות לפיתוח של ערכות חילוץ מחברות כמו Qiagen. כיווני חייב להיות אחריו בזהירות. כל הדגימות צריך להישמר קר כאשר אינו בשימוש. הימנע חוזרות ונשנות, שינויי טמפרטורה קיצוניים של הדגימות. Primers DNA המשמשים בעבודה זו ניתן להזמין מחברות שונות אשר צוטטו ברשימת הפניות ספרות בסוף מאמר זה. יש להקפיד לעבוד עם primers בסביבת ה-DNA בחינם על מנת למנוע זיהום. Primers לבוא כמו אבקה יבשה והוא חייב להיות מעורב עם TE ו מדולל לריכוז 100μM, מופרדים מכן לתוך כמויות קטנות (איור 2 א). פתרונות עבודה של primers הם מדולל יותר לריכוזים 10μM. שוב, אין להשתמש דגימות DNA באזורים / ברדסים שם primers משמשים ומוכן. מוצרי ה-PCR צריך גם להישמר קר כאשר אינו בשימוש. הכנה 3% agarose ג&#39;ל ייתן יותר הלהקה ההפרדה DNA, אבל לוקח יותר זמן לרוץ. לענין איכותי בלבד, 2% מספיקה בדרך כלל. פתרון Ethidium ברומיד המשמש מכתים את ה-DNA בשנת agarose ג&#39;ל הוא genotoxin פעיל מאוד, כי הוא נספג דרך העור. טפל זה הפתרון ג&#39;ל מוכתם אותו באמצעות בזהירות רבה, ותמיד להיות בטוח ללבוש כפפות. לשטוף ידיים ביסודיות לאחר כל טיפול דגימות DNA או חומרים ברומיד ethidium. השלך פתרון מכתים ethidium ברומיד, לרחוץ ג&#39;לים בהתאם להנחיות מוסדיים. ג&#39;ל אינם נדרשים באופן שגרתי; שלב זה אפשר לחסל אחת השיטות FLA הוקמו. זה זמן רב מגיב. הפתרון לפוראמיד המשמשים להכנת דגימות FLA הוא גם רעיל מאוד ויש לטפל בזהירות. רחצו ידיים לאחר השימוש בו. השלך אותו בעקבות הנחיות מוסדיים. קריאת התוצאות של FLA באמצעות תוכנת סורק שיא יכול להיות מאתגר. סט בסיסי של שיחות האלל (מספר חזרות טנדם) פותחה על CSU (לוחות 4-7). (יצוין כי לוחות 4-7 לא יכול להיות הכל כלול. כמו זנים אחרים של M. leprae נלמדים, אללים עם מספרים להעתיק מחוץ טווחי הרשומים ניתן למצוא.) אתגר אחד מסוים כרוך פסגות &quot;לגמגם&quot;. אלו הן משפחות של פסגות, במיוחד של STRs כי רק לערב 2-3 זוג בסיס חוזר, כגון (ת&quot;א) 10. לפעמים בחירה נכונה שיא לקרוא קשה (איור 7). באיור זה, שיא שליטה חיובית 190 נ&quot;ב הוא שיא הראשי. פיקס נמוך בגובה כי הם 2, 4 או אפילו 6 זוגות בסיסים גדולים יותר או קטנים יותר מאשר השיא העיקריים הם בשם &quot;פסגות לגמגם.&quot; A-עוקב יכול גם לגרום לבלבול. A-עוקב מתואר בתחילת הטקסט באיור 8. לבסוף, אם PCR מוצרים נפוצים מאוד הדגימות, פסגות עשויה להופיע עם ספייק כפול. במקרה זה, לקרוא למרכז של הטופס שיא. (ראה תרשים 6, החולה 6.) ניהול נתונים יכולה להיות משימה קשה עבור סוג זה של עבודה. חשוב לתעד כל מידע רלוונטי עבור כל הניסויים, כגון: תאריך של משימה או נוהל, מפעיל, רצועה / צלחת מפות, הזמנות FLA, תנאי PCR ומתכונים, תאריכי ג&#39;לים תצלומים, טמפרטורות האחסון, דילולים תבנית ה-DNA, FLA אחסון קבצים אלקטרוניים מיקומים, וכו &#39;ארגון טוב וניהול נתונים יכול לחסוך שעות של זמן בילה מחפש חלקים מסוימים של מידע בעתיד. העבודה במעבדה המתואר כאן נמשך כבר מספר שנים באוניברסיטת קולורדו ו במקומות אחרים ברחבי העולם. תמונה גדולה של מה כל הנתונים שנאספו באמצעות ואיך זה יכול להיות שימוש עתידי מתחיל להתגלות. איורים 10A ו - 10B להדגים כיצד אלה טביעות DNA יכול לשמש כדי להבדיל מ שונות leprae זנים בין המדינות (10A) או אפילו בין משפחות (10 ב). המשפחה והקהילה המקרים קשור הוכחו נושאים מ leprae סוגי זן דומה או זהה VNTR. התקווה היא כי זה עשוי להיות אפשרי להשיג תובנה נוספת במצב (ים) של שידור צרעת כך מערכת לגילוי מוקדם של רשתות שידור עשוי להיות מפותח עבור אותם אנשים חודשלא בסיכון, וכי טיפול תרופתי מרפא יכולים להתחיל לפני נזק נוירולוגי קבוע עור נעשה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> דם DNeasy וקיט רקמות </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td> Multiplex PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> ה-DNA primers </td><td> שונים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose ג&#39;ל </td><td> שונים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> או 5x 6x טוען ג&#39;ל הצפת </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> B7021S </td><td> זמין כדי להפוך * משלך מתכונים </td></tr><tr><td> Ethidium פתרון ברומיד </td><td> שונים </td><td></td><td> מדולל של קון. </td></tr><tr><td> Hi-Di לפוראמיד פתרון </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> ג&#39;ין סריקה -500 ליז </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> ציוד </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> 2 מקררים </td><td> 4 ° C: 1 עבור דגימות DNA, 1 עבור primers ו ריאגנטים Multiplex </td></tr><tr><td> 1 מיקרוגל </td><td> או דרך מתאים לחימום agarose ומים כדי להפוך ג&#39;לים </td></tr><tr><td> 1 החיטוי </td><td> או סיר לחץ לעיקור חומרים </td></tr><tr><td> מכונת ה-PCR </td><td> Thermocycler </td></tr><tr><td> 2 סטים של pipettes </td><td> 0.5-10 μl, 10-100 μl, 20-200 μl, 1000 להגדיר μl 1 עבור primers, 1 להגדיר עבור ה-DNA </td></tr><tr><td> ג&#39;ל אלקטרופורזה תיבת הצוללת </td><td> עם טפסים מסרקים עבור הכנת ג&#39;ל. </td></tr><tr><td> אספקת החשמל אלקטרופורזה </td><td> עם כבלים לחיבור תיבת ג&#39;ל </td></tr><tr><td> מחממים לחסום </td><td> עבור Eppendorf צינורות </td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> עבור צינורות Eppendorf / רצועות </td></tr><tr><td> אלקטרופורזה מערכת נימית (מנתח גנטי) </td><td> או גישה למוסד כי ניתן לבצע את הניתוח הזה </td></tr><tr><td> פלסטיקה </td><td> פנויה אירוסול פיפטה טיפים, Eppendorf צינורות, רצועות 8-היטב, צלחות 96-טוב, כמה איכות אופטית </td></tr><tr><td> מחשב עם חיבור לאינטרנט </td><td></td></tr></tbody></table>

dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)

המחקר של השידור של הצרעת הוא קשה במיוחד מאחר הסוכן סיבתי, Mycobacterium leprae, לא יכול להיות מתורבת במעבדה. המקורות רק של חיידקים הם מטופלים צרעת, ארמדילים נגוע בניסוי ועכברים בעירום. לכן, רבים מן השיטות באפידמיולוגיה מודרנית אינם זמינים עבור המחקר של צרעת. למרות תוכנית התרופה נרחב העולמי לטיפול בצרעת מיושם על ידי ארגון הבריאות העולמי 1, צרעת נשאר אנדמי במדינות רבות עם כ 250,000 מקרים חדשים בכל שנה. 2 מ &#39;שלמה leprae הגנום כבר ממופה 3,4 ו לוקוסים רבים זוהו חזרו מקטעים של 2 או יותר זוגות בסיסים (נקרא מיקרו minisatellites). 5 זנים קלינית של מ &#39; leprae עשוי להשתנות במספר מגזרים טנדם חוזרות ונשנות (חזרות טנדם קצרות, STR) בשעה שרבים לוקוסים אלו. 5,6,7 מספר משתנה במקביל לחזור (VNTR) 5 ניתוח נעשה שימוש כדי להבחין בין זנים שונים של החיידקים הצרעת. חלק מהאתרים נראים יציבים יותר מאחרים, מראה וריאציה פחות במספרים חוזרים, בעוד אחרים נראים לשנות במהירות רבה יותר, לפעמים באותו חולה. למרות ההשתנות של VNTRs מסוים הביא את שאלות לגבי התאמתם הקלדה זן 7,8,9, הנתונים מראים כי ניתוח המתעוררים לוקוסים מרובים, שהם מגוונים היציבות שלהם, יכול לשמש ככלי אפידמיולוגי יקר. מספר מוקד VNTR ניתוח (MLVA) 10 נעשה שימוש כדי ללמוד את תורת האבולוציה צרעת והעברת במספר מדינות כולל סין 11,12, 8 מלאווי, פיליפינים 10,13, 14 ו ברזיל. MLVA כרוך שלבים מרובים. ראשית, ה-DNA חיידקי מופק יחד עם ה-DNA המארח רקמה ביופסיות עור קליני או חריץ מריחות (SSS). 10 לוקוסים הרצוי ואז הם מוגבר באמצעות תגובת שרשרת פולימרז (PCR) מ-DNA המחולץ. Primers fluorescently שכותרתו עבור לוקוסים שונים 4-5 משמשים לכל תגובה, עם 18 לוקוסים להיות מוגבר בסך של ארבע תגובות. 10 המוצרים PCR עשוי להיות נתון ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose כדי לוודא את נוכחותו של המגזרים ה-DNA הרצוי, ולאחר מכן הגישה לניתוח פלורסנט אורך קטע (FLA) באמצעות אלקטרופורזה נימי. דנ&quot;א ארמדיל passaged חיידקים עם מספר ידוע של עותקים חוזרים עבור כל מוקד משמש כביקורת חיובית. Chromatograms FLA נבחנים אז באמצעות תוכנה סורק שיא אורך קטע מומר מספר העותקים VNTR (אלל). לבסוף, haplotypes VNTR מנותחים על דפוסים בשילוב עם נתונים קליניים המטופל יכול לשמש כדי לעקוב אחר התפלגות סוגי המתח.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA at JoVE.com

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

צרעת, הנגרמת על ידי<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt;, היא עדיין אנדמית במקומות רבים. על מנת ללמוד על התפשטות ומצב של שידור של צרעת, חשוב לקבוע איזה זן של<em&gt; מ leprae</em&gt; נגוע חולה. מספר משתנה של חזרות טנדם (VNTR) הקלדה היא שיטה אחת כזו.

טביעת אצבעות של DNA Mycobacterium leprae מתחים באמצעות מספר משתנה טנדם חזור (VNTR) - אורך ניתוח שבר (FLA)

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory.  ...

dna-fingerprinting-mycobacterium-leprae-strains-using-variable-number

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

26.9K Views.  Colorado State University. צרעת, הנגרמת על ידי Mycobacterium leprae, היא עדיין אנדמית במקומות רבים. על מנת ללמוד על התפשטות ומצב של שידור של צרעת, חשוב לקבוע איזה זן של מ leprae נגוע חולה. מספר משתנה של חזרות טנדם (VNTR) הקלדה היא שיטה אחת כזו.

Video: DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

ההפרדה של ה-DNA חד גדילי, פעמיים תקועים DNA ו-RNA מהקהילה ויראלי הסביבה באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. There are currently no known methods for growing M. leprae in vitro, presenting a major obstacle in the study of this pathogen in the laboratory. Therefore, the maintenance and growth of M. leprae strains are preferably performed in athymic nude mice (NU-Foxn1nu). The laboratory conditions for using mice are readily available, easy to perform, and allow standardization and development of protocols for achieving reproducible results. In the present report, we describe a simple protocol for purification of bacilli from nude mouse footpads using trypsin, which yields a suspension with minimum cell debris and with high bacterial viability index, as determined by fluorescent microscopy. A modification to the standard method for bacillary counting by Ziehl-Neelsen staining and light microscopy is also demonstrated. Additionally, we describe a protocol for freezing and thawing bacillary stocks as an alternative protocol for maintenance and storage of M. leprae strains.

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Mycobacterium leprae, the causative agent of leprosy, does not grow in vitro. We describe an easy to follow protocol to prepare a bacillary suspension to ensure the maintenance of large quantities of M. leprae for a variety of applications. Protocols for propagation by mouse footpad inoculation, evaluation of viability, freezing and thawing bacillary stock are described in detail.

פרוטוקולים אופטימליים עבור<em&gt; Leprae Mycobacterium</em&gt; ניהול הזנים: קפוא במלאי שימור ותחזוקה בעכברים בעירום athymic

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

הוכחת סמים רבים עמידים<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; Microarray ההגברה

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

ניתוח של 18FDG PET/CT הדמיה ככלי לימודי שחפת Mycobacterium זיהום וטיפול פרימטים לא אנושית

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...