Die Finanzierung wurde durch die NIH / NIAID gewähren RO1-AI-63457 und ARRA gewähren ergänzen RO1-AI-63457 S1 zur Verfügung gestellt. Wir erkennen die Beiträge aller aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Labors Gruppe und Mitarbeiter.

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	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+of+leprosy+for+control+programmes.">Chemotherapy of leprosy for control programmes.</a> Technical Report Series. 675, 18-22 (1982).</li><li>Cole, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+gene+decay+in+the+leprosy+bacillus.">Massive gene decay in the leprosy bacillus.</a> Nature. 409, 1007-1011 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leproma+Web+Server.">Leproma Web Server.</a> Leproma Web Server [Internet]. , (2004).</li><li>Groathouse, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Polymorphic+Loci+for+Molecular+Typing+of+Strains+of+Mycobacterium+leprae.">Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 42, 1666-1672 (2004).</li><li>Young, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Short+Tandem+Repeat+Sequences+to+Study+Mycobacterium+leprae+in+Leprosy+Patients+in+Malawi+and+India.">Use of Short Tandem Repeat Sequences to Study Mycobacterium leprae in Leprosy Patients in Malawi and India.</a> Public Library of Science: Neglected Tropical Diseases. 2, E214-E214 (2008).</li><li>Monot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Variable-Number+Tandem+Repeats+Appropriate+for+Genotyping+Mycobacterium+leprae.">Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 46, 2291-2297 (2008).</li><li>Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Variable+Number+Tandem-Repeat+Genotyping+for+Mycobacterium+leprae+Clinical+Specimens.">Rapid Variable Number Tandem-Repeat Genotyping for Mycobacterium leprae Clinical Specimens.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 1757-1766 (2009).</li><li>Weng, X. i. a. o. m. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Distribution+of+Mycobacterium+leprae+Genotypes+in+a+Region+of+High+Leprosy+Prevalence+in+China:+a+3-Year+Molecular+Epidemiological+Study.">Identification and Distribution of Mycobacterium leprae Genotypes in a Region of High Leprosy Prevalence in China: a 3-Year Molecular Epidemiological Study.</a> J. of Clinical Microbiology. 45, 1728-1734 (2007).</li><li>Weng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+leprosy+in+Qiubei+County,+Yunnan,+China:+Insights+from+an+eight+year+molecular+epidemiology+investigation.">Transmission of leprosy in Qiubei County, Yunnan, China: Insights from an eight year molecular epidemiology investigation.</a> Infection, Genetics and Evolution. , (2010).</li><li>Sakamuri, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-Based+Molecular+Epidemiology+of+Leprosy+in+Cebu,+Philippines.">Population-Based Molecular Epidemiology of Leprosy in Cebu, Philippines.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 2844-2854 (2009).</li><li>Fontes, A. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+of+Mycobacterium+leprae+isolates+from+Brazilian+leprosy+patients.">Genetic diversity of Mycobacterium leprae isolates from Brazilian leprosy patients.</a> Leprosy Review. 80, 302-315 (2009).</li></ol>

Die Sammlung von Hautproben von Lepra-Patienten erfordert qualifizierte Ärzte oder Techniker arbeiten an Hautkliniken. Labormitarbeiter Umgang mit diesen Proben müssen mit großer Sorgfalt zu Laborkittel, Schutzhandschuhe und Schutzbrille tragen zu tragen und in einem Bio-Sicherheitsschrank Arbeit beim Umgang mit infizierten Proben menschlichen oder Gürteltier Gewebe. Desinfektion von Oberflächen und Tools ist ebenfalls entscheidend. Arbeiten in einem sauberen, sterilen biologisch sichere Schrank ist zur Vermeidung von Kontamination von DNA-Proben wichtig. DNA-Extraktion hat sich relativ einfach durch die Entwicklung der Extraktion Kits von Firmen wie Qiagen. Anfahrt müssen unbedingt beachtet werden. Alle Proben sollten kühl gehalten werden, wenn nicht in Gebrauch ist. Vermeiden Sie wiederholte, extreme Temperaturschwankungen für die Proben. DNA-Primer in dieser Arbeit verwendet werden kann aus verschiedenen Unternehmen, die in der Liste der Literaturangaben wurden am Ende dieses Beitrags zitiert bestellt werden. Es ist darauf zu mit Primern in einem DNA-freien Umgebung zu arbeiten, um eine Kontamination zu vermeiden. Primer kommen als trockenes Pulver und muss mit TE gemischt und verdünnt, um eine 100 &amp;mgr; Konzentration, dann in kleineren Mengen (Abbildung 2a) getrennt. Working-Lösungen von Primer sind weiter auf 10 um Konzentrationen verdünnt. Auch hier verwenden Sie keine DNA-Proben in den Bereichen / Hauben wo Primer verwendet und sind bereit. PCR-Produkte sollten auch gehalten, wenn nicht in Gebrauch ist kalt. Eine 3% Agarosegel Vorbereitung wird eine bessere DNA-Bande Trennung, dauert aber länger zu laufen. Für rein qualitative Zwecke, 2% in der Regel ausreichend. Ethidiumbromidlösung zur Färbung der DNA in Agarosegelen verwendet ist ein hochaktiver genotoxische Wirkung, die durch die Haut absorbiert wird. Handle dieser Lösung und Gele mit ihm mit großer Sorgfalt und stets sicher, dass das Tragen von Handschuhen gefärbt. Waschen Sie Ihre Hände nach dem Umgang mit allen DNA-Proben oder Ethidiumbromid Materialien. Entsorgen Ethidiumbromidfärbung Lösung, waschen und Gele nach den Richtlinien des Instituts. Gele werden nicht routinemäßig erforderlich, kann dieser Schritt entfallen, sobald FLA-Methoden festgelegt wurden. Es ist Zeit und Reagenzien verbraucht. Die Formamidlösung in Vorbereitung der Proben für die FLA verwendet wird, auch sehr giftig und sollte mit Sorgfalt behandelt werden. Waschen Sie Ihre Hände nach dem Gebrauch. Entsorgen Sie folgende Richtlinien des Instituts. Beim Lesen der Ergebnisse der FLA mit Peak-Scanner-Software kann eine Herausforderung sein. Eine Reihe grundlegender Allel Anrufe (Anzahl der Tandem-Repeats) hat der CSU (Tabellen 4-7) entwickelt worden. (Anzumerken ist, dass Tabellen 4-7 nicht all inclusive sein. Wie auch andere Stämme von M. leprae studiert werden, Allele mit Kopie Zahlen außerhalb der Bereiche aufgeführt gefunden werden kann.) Eine besondere Herausforderung besteht darin, &#39;stottern&#39; Gipfel. Dies sind Familien von Gipfeln, vor allem von Verdachtsanzeigen, die nur um 2-3 Basenpaare wiederholt, wie (TA) 10. Manchmal Auswahl der richtigen Höhepunkt zu lesen ist schwierig (Abbildung 7). In dieser Abbildung ist der Höhepunkt in der positiven Kontrolle bei 190 bp der Hauptpeak. Peaks geringer Höhe, die 2 sind, 4 oder sogar 6 Basenpaare größer oder kleiner als der Hauptgipfel heißen &quot;stottern Gipfel.&quot; A-Tailing kann auch zu Verwechslungen führen. A-Tailing ist bereits im Text und in Abbildung 8 beschrieben. Schließlich, wenn PCR-Produkte sehr häufig in den Proben sind, kann Peaks mit einer Doppel-Spitze erscheinen. In diesem Fall lesen Sie die Mitte des Peaks zu bilden. (Siehe Abbildung 6, Patient 6). Datenmanagement kann eine gewaltige Aufgabe für diese Art von Arbeit sein. Es ist wichtig, alle relevanten Informationen für alle Experimente wie Rekord: Datum einer Aufgabe oder eines Verfahrens, Betreiber, Streifen / Platte Karten, FLA Bestellungen, PCR-Bedingungen und Rezepte, Termine von Gelen und Fotografien, Lagertemperaturen, DNA-Template Verdünnungen, FLA elektronische Datei Lagerorte, etc. Eine gute Organisation und Datenverwaltung, kann Ihnen Stunden Zeit damit verbracht, auf der Suche nach spezifischen Informationen in die Zukunft. Das Labor hier beschriebenen Arbeiten hat schon seit mehreren Jahren an der Colorado State University und an anderen Orten auf der ganzen Welt. Das große Bild von dem, was all der gesammelten Daten bedeutet und wie es bezüglich der künftigen Nutzung ist im Entstehen begriffen. 10A und 10B zeigen, wie diese DNA-Fingerprints verwendet werden, um verschiedene M. zu unterscheiden leprae Stämme zwischen den Ländern (10A) oder auch zwischen Familien (10B). Familie und Gemeinschaft verbunden Fällen hat sich gezeigt, M. tragen leprae von ähnlichen oder identischen VNTR Belastung Typen. Die Hoffnung ist, dass es möglich sein, weitere Einblicke in die Wirkungsweise (n) der Lepra Übertragung zu gewinnen, so dass eine Früherkennung von Übertragungsnetzen für jene Leute mos entwickelt werden könnent in Gefahr, und das heilende medikamentöse Therapie beginnen kann, bevor bleibende neurologische und dermatologische Schaden entsteht.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> DNeasy Blood and Tissue Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td> Multiplex PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> DNA-Primer </td><td> Verschiedene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose Gel </td><td> Verschiedene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5x oder 6x Gel-Ladepuffer </td><td> New England Biolabs </td><td> B7021S </td><td> Rezepte zur Verfügung, um Ihre eigenen * machen </td></tr><tr><td> Ethidiumbromid-Lösung </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Verdünnen von con. </td></tr><tr><td> Hallo-Di Formamidlösung </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> Gene Scan -500 LIZ </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th> Ausstattung </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> 2 Kühlschränke </td><td> 4 ° C: 1 für die DNA-Proben, 1 für Grundierungen und Multiplex-Reagenzien </td></tr><tr><td> 1 Mikrowellenherd </td><td> Oder geeigneter Weise für Heizung und Wasser Agarose Gele machen </td></tr><tr><td> 1-Autoklaven </td><td> Oder Dampfkochtopf für die Sterilisation Materialien </td></tr><tr><td> PCR-Maschine </td><td> Thermocycler </td></tr><tr><td> 2 Sätze von Pipetten </td><td> 0,5-10 ul, 10-100 ul, 20-200 ul, 1000 ul 1 Satz für Primer, 1 Satz für DNA </td></tr><tr><td> Submarine Gelelektrophorese box </td><td> Mit Formen und Kämme für Herstellung von Gelen. </td></tr><tr><td> Elektrophorese-Netzteil </td><td> Mit Kabel für den Anschluss an Gel-Box </td></tr><tr><td> Heizblock </td><td> Für Eppendorf-Röhrchen </td></tr><tr><td> Zentrifuge </td><td> Für Eppendorf-Röhrchen / Streifen </td></tr><tr><td> Kapillarelektrophorese-System (Genetic Analyzer) </td><td> Oder um eine Institution, die diese Analyse durchzuführen zugreifen können </td></tr><tr><td> Plastics </td><td> Einweg-Aerosol-Pipettenspitzen, Eppendorf-Röhrchen, 8-Well-Streifen, 96-Well-Platten, einige optische Qualität </td></tr><tr><td> Computer mit Internet-Anschluss </td><td></td></tr></tbody></table>

dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)

Das Studium der Übertragung von Lepra ist besonders schwierig, da der Erreger, Mycobacterium leprae, kann nicht im Labor kultiviert werden. Die einzige Quelle für die Bakterien sind Lepra-Patienten und experimentell infizierten Gürteltiere und Nacktmäuse. So sind viele der Methoden in der modernen Epidemiologie verwendet werden, nicht für das Studium der Lepra zur Verfügung. Trotz einer umfangreichen weltweiten medikamentösen Behandlung Programm für die Lepra durch die WHO 1 implementiert, bleibt Lepra endemisch in vielen Ländern mit rund 250.000 Neuerkrankungen pro Jahr. 2 Die gesamte M. leprae Genom wurde 3,4 abgebildet und viele Loci identifiziert worden, die haben Segmenten von 2 oder mehr Basenpaare wiederholt (so genannte Mikro-und Minisatelliten). 5 Klinische Stämme von M. leprae kann in der Anzahl der Tandem wiederholte Segmente (short tandem repeats, STR) auf vielen dieser Loci variieren. 5,6,7 Variable Anzahl Tandem-Repeat (VNTR) 5 Analyse verwendet wurde, um verschiedene Stämme des Lepra-Bazillen zu unterscheiden. Einige der loci scheinen stabiler zu sein als andere, zeigen weniger Schwankungen in wiederholen Zahlen, während andere sich schneller ändern, manchmal in den gleichen Patienten zu sein scheinen. Während die Variabilität bestimmter VNTRs hat Fragen hinsichtlich ihrer Eignung für Stammtypisierung 7,8,9 brachte, legen die Schwellenländer Daten, die Analyse mehrerer Loci, die vielfältig in ihrer Stabilität sind, können als wertvolle epidemiologische Instrument verwendet werden. Multiple locus VNTR-Analyse (MLVA) 10 wurde verwendet, um die Lepra Entwicklung und Übertragung in mehreren Ländern, darunter China 11,12, Malawi 8, auf den Philippinen 10,13 und Brasilien 14 studierst. MLVA umfasst mehrere Schritte. Erstens ist die bakterielle DNA zusammen mit Wirtsgewebe DNA aus klinischen Biopsien oder Schlitz Haut schmiert (SSS) extrahiert. 10 Die gewünschte loci dann aus der extrahierten DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Fluoreszenzmarkierten Primer für 4-5 verschiedene Loci pro Reaktion eingesetzt, mit 18 Loci in insgesamt vier Reaktionen verstärkt. 10 Die PCR-Produkte auf Agarose-Gelelektrophorese unterworfen werden können, um das Vorhandensein des gewünschten DNA-Abschnitte zu überprüfen, und dann eingereicht für Leuchtstofflampen-Fragment-Längen-Analyse (FLA) mittels Kapillarelektrophorese. DNA aus Gürteltier passagiert Bakterien mit einer bekannten Anzahl von wiederholten Kopien für jeden Locus wird als positive Kontrolle verwendet. Die FLA-Chromatogramme werden dann unter Verwendung Peak-Scanner-Software-und Fragment-Länge ist auf die Anzahl der VNTR Kopien (Allel) umgewandelt. Schließlich werden die VNTR Haplotypen nach Mustern analysiert und, wenn sie mit Patienten klinische Daten kombiniert werden verwendet, um Verteilung der Belastung Arten zu verfolgen.

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DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

Lepra, verursacht durch<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt;, Ist immer noch in vielen Orten endemisch. Um über die Verbreitung und Art der Übertragung der Lepra zu lernen, ist es wichtig zu ermitteln, welche Belastung der<em&gt; M. leprae</em&gt; Hat ein Patient infiziert. Variable Anzahl von Tandem Repeats (VNTR-Typisierung) ist eine solche Methode.

DNA Fingerprinting von Mycobacterium leprae Die Stämme mit variablen Anzahl Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory.  ...

dna-fingerprinting-mycobacterium-leprae-strains-using-variable-number

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

26.9K Aufrufe.  Colorado State University. Lepra, verursacht durch Mycobacterium leprae, Ist immer noch in vielen Orten endemisch. Um über die Verbreitung und Art der Übertragung der Lepra zu lernen, ist es wichtig zu ermitteln, welche Belastung der M. leprae Hat ein Patient infiziert. Variable Anzahl von Tandem Repeats (VNTR-Typisierung) ist eine solche Methode.