המחקר המתואר במחקר זה נתמך על ידי מענק קרן המדע הלאומית (DEB-0805818) כדי WAF, AWS ומזהה מחקר זה נתמך גם על ידי מענקים IOS-0845847 אל AWS, IOS-0919855 אל AWS לבין הזהות IOS-0920720 ל WAF

<html> 1. גידול ומניפולציה של דיאטה כדי לייצר וריאציה בגודל הגוף כנף גודל Rational סקירת. הביטוי של יחסים דרוג בסופו של דבר תלוי תהליכי הרגולציה התפתחותי המייצרים וריאציה באיבר הסופי לגודל הגוף. תהליכים אלה מתוארים הטובה ביותר על חרקים מותמרים מלא (כלומר, holometabolous) כגון ד מהעבודה melanogaster, שם איברים לגדול מובחן כ &#39;דיסקים דמותי &quot;בתוך grub-כמו זחל 11,15-17. ב תסיסנית, האיבר הסופי לגודל הגוף מוסדרים על ידי צמיחה בשלבי הזחל, זחלים לגדול באמצעות instar הזחל הראשונה והשניה עד שהם מגיעים למשקל קיימא מינימלי eclosion (MVW E) לקראת תחילת השלישי הזחל instar 18. רעב לפני השגת MVW E מונע eclosion מבוגר. עם זאת, זחלים, כי הם מורעבים בבית MVW E לייצר למבוגרים קיימא, אם כי גודל קטן מאוד. זה מצטמצם בגלל תזונה במהלך הפיתוח מקטין הגוף הסופי גודל האיבר, לא רק זבובים, אבל כמעט בכל בעלי החיים 19-21. על ידי מניפולציה זמינות המזון לאחר MVW E מושגת, אבל לפני התגלמות מתרחשת, אפשר להשרות פלסטיות פנוטיפי קיצוניים בגודל הגוף עולה מאד מקורות אחרים של שונות (למשל, וריאציה גנטית בודדים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים הן שנאספו מהאוכלוסייה להיות phenotyped, מחולק המון 50 והושמו בקבוקונים המכילים 10 מ&quot;ל של אוכל לטוס סטנדרטי. בגלל ההטלה מתרחשת ברציפות, ביצים נאספים מדי 24 שעות במשך שלושה ימים, ייצור three קבוצות הגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הדור הוותיק מגיע שלב הנדודים או החלה רק כדי pupate, מניפולציה דיאטה מוחל. בשלב זה, המחזור הגדול הוא הרבה מעבר E MVW, את הדור הצעיר קרוב מאוד E MVW ואת עוקבה שנותר הוא איפשהו בין הקצוות האלה. לכן, הסרת מזון בשלב זה תייצר מבוגרים גדול מאוד מן הדור הוותיק, מבוגרים קטן מאוד מן הדור הצעיר בגודל בינוני מבוגרים מקבוצה הנותר. כדי להסיר את הזחלים מן בקבוקונים, 5 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז כ 40% מתווסף כל צלוחיות. כדי לשחרר את הזחלים, האוכל הוא נסער במשך 15-20 דקות על שולחן שייקר להגדיר מהירות ביניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזחלים הצף יוסרו מן הפתרון סוכרוז עם מכחול (00) בסדר, להציב לתוך צלוחיות המכיל תוסף גפן רטוב מותר pupate. לחלופין, זחלים יכול להיות ממוקם על תוסף הלא לעיכול מזון כגון מתיל צלולוזה 22. </li></ol> 2. הערכת גודל הגוף Rational סקירת. מחקרים קודמים מצביעים על כך בהרחבה בית החזה הוא פחות אידיאלי עבור proxy גודל הגוף הכולל 22. במקום זאת, אנו משתמשים בגודל גלמי כמדד לגודל הגוף. גודל מקסימלי גוף קבוע בכל הפסקת האכלה שקודם התגלמות. כתוצאה מכך, קיים קשר הדוק בין גודל גלמי הגוף המבוגר גודל 23. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלמים מסודרים בצד הגחון על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית הדמיה בעזרת המצלמה הדיגיטלית מחוברת למיקרוסקופ לנתח. כל תמונה היא בשבי, מוקצה קוד זיהוי ייחודי מועבר למחשב באמצעות שידור חי חיבור המצלמה הדיגיטלית למחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלמים צילמו מועברים 2 epitubes הפרט מ&quot;ל המכיל 1ml של אוכל לעוף, שכותרתו עם קוד ייחודי עבור הפרט הזה, ניקב עם airholes כדי לאפשר חילוף הגזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גודל גלמי מוערך כמספר הפיקסלים של צללית גלמי. מדדי גודל אחרים יכול לשמש גם. </li></ol> 3. (כנף) תכונה גודל אמידה Rational סקירת. כדי כנפיים תמונה, אנו משתמשים &quot;כנף חוטף&quot; 24, אשר מושך ומחזיק את הכנף של הניצב, לחיות לטוס הרדים לגוף שלה. לחוץ בין שתי חתיכות זכוכית, זה מאפשר את האגף להיות צילמו כאובייקט דו מימדי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זבובים מורדמים קלות עם ה-CO 2 ו להציב עמדה חוטף את הכנף על מיקרוסקופ לנתח מצויד במצלמה דיגיטלית המחוברת למחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כנף היא הדמיה ונשמר תחת קוד ייחודי עבור הפרט הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גודל כנף ניתן לאמוד באמצעות מצולע קמור המינימום ציוני דרך לעקוף קבוע שולית או לספור את פיקסל צללית של האגף. </li></ol> 4. היחסים קנה מידה להערכת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הם אספו נתונים על פני הקבוצות אבל מופרדים לפי מין יומן שינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יחסים דרוג מתאימים לנתונים באמצעות Type II בגודל (כלומר, ציר מרכזי מופחתת) רגרסיה (ראה סקירה ב 12) ואת הפרמטרים המשוער עבור כל קבוצה. </li></ol> 5. נציג תוצאות: אוהל &quot;&gt; מניפולציה הדיאטה שלנו יהיה לייצר מגוון רחב של מידות הגוף (איור 1) וגדלים תכונה (איור 2). שרטוט התכונות יומן שינה אחד נגד השני מגלה דפוס שלהם covariation בתוך קבוצה ביולוגי נתון היתרי הולם את מערכת היחסים דרוג לקבוצה (איור 3). מיצוי של הפרמטרים יחסים דרוג המתארים כיצד קשקשים צורה עם גודל הגוף מאפשר השוואה בין כמה covaries צורה עם גודל בקבוצות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig1.jpg" /> באיור 1. פופה מן הקצוות של התפלגות גודל המיוצר באמצעות מניפולציה דיאטה אחרי אנשים להשיג את ה MVW. תמונות גלמי בפועל מוצגים בצד שמאל עם צלליות המתאימים למדידת גודל גלמי בצד ימין. בר סולם הוא 1mm. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig2.jpg" /> כנפיים באיור 2. שנלקחו הקצוות של התפלגות גודל הגוף המיוצר באמצעות מניפולציה דיאטה אחרי אנשים להשיג את ה MVW. תמונות האגף בפועל מוצגים בצד שמאל עם צלליות המתאימים למדידת גודל כנף המוצג בצד ימין. בר סולם הוא 1mm. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig3.jpg" /> איור 3. כנף גוף דרוג גודל תסיסנית melanogaster לפי מין. נתונים Log-הפכו ליחידים של כל מין שהיו לגמרי שניזונו (עיגולים כהים), מורעבים אחד (עיגולים אפורים) או יומיים (עיגולים פתוח) כמו זחלים. סוג II קו רגרסיה מוצג בכל מין בנפרד. בין עוקבה כל גיל, ירידות באזור הכנף הממוצע של ~ 0.1mm (~ 7%) ו ~ 0.2mm (~ 8%) מתרחש, הגדלת מגוון הכולל של פנוטיפים ציין. רגרסיה עולה כי הנקבות הן hypoallometric מעט עבור הקשר הזה דרוג (שיפוע 0.96) ואילו הזכרים הם hyperallometric מעט (מדרון 1.06).

<ol>
	<li>Schmidt-Nielsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Scaling: Why is animal size so important. , (1984).</li><li>Calder, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Size, function and life history. , (1984).</li><li>Huxley, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Problems of relative growth. , (1932).</li><li>Gould, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allometry+and+size+in+ontogeny+and+phylogeny.">Allometry and size in ontogeny and phylogeny.</a> Biol. Rev. 41, 587-640 (1966).</li><li>Alberch, P., Gould, S. J., Oster, G. F., Wake, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+in+ontogeny+and+phylogeny.">Size and shape in ontogeny and phylogeny.</a> Paleobiology. 5, 296-317 (1979).</li><li>Thompson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> On growth and form. , (1917).</li><li>Klingenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochrony+and+allometry:+The+analysis+of+evolutionary+change+in+ontogeny.">Heterochrony and allometry: The analysis of evolutionary change in ontogeny.</a> Biol. Rev. 73, 79-123 (1998).</li><li>Dubois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sur+le+rapport+de+l'enc&#233;phale+avec+la+grandeur+du+corps+chez+les+Mammiferes.">Sur le rapport de l'enc&#233;phale avec la grandeur du corps chez les Mammiferes.</a> Bull. Soc. Anthropol. 8, 337-374 .</li><li>Huxley, J. S., Teissier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology+of+relative+growth.">Terminology of relative growth.</a> Nature. 137, 780-781 (1936).</li><li>Huxley, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constant+differential+growth-ratios+and+their+significance.">Constant differential growth-ratios and their significance.</a> Nature. 114, 895-896 (1924).</li><li>Shingleton, A. W., Frankino, W. A., Flatt, T., Nijhout, H. F., Emlen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape:+The+developmental+regulation+of+static+allometry+in+insects.">Size and shape: The developmental regulation of static allometry in insects.</a> BioEssays. 29, 536-548 (2007).</li><li>Frankino, W. A., Emlen, D., Shingleton, A. W., Garland, T., Rose, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+approaches+to+studying+the+evolution+of+morphological+allometries:+The+shape+of+things+to+come.">Experimental approaches to studying the evolution of morphological allometries: The shape of things to come.</a> Experimental evolution: Concepts, methods, and applications. , (2009).</li><li>Emlen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+selection+on+horn+length-body+size+allometry+in+the+horned+beetle+Onthophagus+acuminatus.">Artificial selection on horn length-body size allometry in the horned beetle Onthophagus acuminatus.</a> Evolution. 50, (1996).</li><li>Emlen, D. J., Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+evolution+of+exaggerated+morphologies+in+insects.">The development and evolution of exaggerated morphologies in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 45, 661-708 (2000).</li><li>Shingleton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body-size+regulation:+Combining+genetics+and+physiology.">Body-size regulation: Combining genetics and physiology.</a> Curr. Biol. 15, 825-827 (2005).</li><li>Nijhout, H. F., Davidowitz, G., Roff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+the+mechanism+that+controls+body+size+in+Manduca+sexta.">A quantitative analysis of the mechanism that controls body size in Manduca sexta.</a> J. Biol. 5, 16.11-16.15 (2006).</li><li>Davidowitz, G., Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+basis+of+reaction+norms:+The+interaction+among+growth+rate,+the+duration+of+growth+and+body+size.">The physiological basis of reaction norms: The interaction among growth rate, the duration of growth and body size.</a> Integr. Comp. Biol. 44, 443-449 (2004).</li><li>Stieper, B. C., Kupershtok, M., Driscoll, M. V., Shingleton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+discs+regulate+developmental+timing+in+Drosophila+melanogaster.">Imaginal discs regulate developmental timing in Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 321, 18-26 (2008).</li><li>Colombani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nutrient+sensor+mechanism+controls+Drosophila+growth.">A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth.</a> Cell. 114, 739-749 (2003).</li><li>Mirth, C. K., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+assessment+and+growth+control:+How+adult+size+is+determined+in+insects.">Size assessment and growth control: How adult size is determined in insects.</a> BioEssays. 29, 344-355 (2007).</li><li>Thissen, J. P., Ketelslegers, J. M., Underwood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+regulation+of+the+insulin-like+growth+factors.">Nutritional regulation of the insulin-like growth factors.</a> Endocr. Rev. 15, 80-101 (1994).</li><li>Boots, M., Begon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resource+limitation+and+the+lethal+and+sublethal+effects+of+a+viral+pathogen+in+the+Indian+meal+moth,+Plodia+interpunctella.">Resource limitation and the lethal and sublethal effects of a viral pathogen in the Indian meal moth, Plodia interpunctella.</a> Ecol. Entomol. 19, 319-326 (1994).</li><li>Shingleton, A. W., Mirth, C. K., Bates, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+model+of+static+allometry+in+holometabolous+insects.">Developmental model of static allometry in holometabolous insects.</a> Proc. R. Soc. B. 275, 1875-1885 (2008).</li><li>Stern, D. L., Emlen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+basis+of+allometry+in+insects.">The developmental basis of allometry in insects.</a> Development. 126, 1091-1101 (1999).</li><li>Emlen, D. J., Allen, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype+to+phenotype:+Physiological+control+of+trait+size+and+scaling+in+insects.">Genotype to phenotype: Physiological control of trait size and scaling in insects.</a> Integr. Comp. Biol. 43, 617-634 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

דרוג מורפולוגי כבר את הנושא של לימוד אינטנסיבי בביולוגיה אבולוציונית במשך קרוב למאה שנה. לאחרונה, בסיס סמוך של התקנה של צמיחה דרוג הפך חשוב יותר ויותר בפיתוח, פיזיולוגיה וגנטיקה (למשל, לראות ביקורות על 12,15,23-25). המתודולוגיה שלנו מאפשר אמידה של יחסים דרוג מורפולוגית פני טווח שלם של תכונה וגדלים הגוף. זה יכול להיות חשוב, כמו גודל תכונה אולי לא בקנה מידה ליניארי עם גודל הגוף (למשל, 13,14). עם זאת, זה לא יכול להיות ברור אם בעלי חיים שגדלו רק בתנאי מעבדה אידיאלית. אף על פי פרוטוקול שלנו פותחה במפורש כדי לאפשר הערכה של הקשר כנף גוף בגודל דרוג ב תסיסנית, ניתן להשתמש בו עם שינוי, תכונה מסוימת כדי לאמוד את הקשר דרוג עבור כל תכונה מורפולוגיים זבובים. כמו כן, דיאטה יכולה מניפולציה סביר לשמש כדי להפיק את מלוא טווח הגדלים תכונה גוף אחרים חרקים מותמרים מלא; יישומים כאלה פשוט דורשות לדעת מתי E MVW מושגת וליישם את המניפולציה בנקודת ontogeny.

אין.

experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in drosophila

קנה המידה של חלקי גוף היא תכונה מרכזית של מורפולוגיה חיים 1-7. בתוך מינים, תכונות מורפולוגיות צריך להיות בפרופורציות נכונה לגוף עבור האורגניזם לתפקד; אנשים גדולים יש בדרך כלל חלקי גוף גדולים ואנשים קטנים בדרך כלל יש חלקי גוף קטנים יותר, כגון צורה הגוף הכולל נשמר על פני מגוון של גדלים בגוף הבוגר. הדרישה הפרופורציות הנכונות אומר כי אנשים בדרך כלל בתוך מין וריאציה התערוכה נמוך בגודל תכונה יחסית. לעומת זאת, גודל תכונה יחסית יכולים להשתנות באופן דרמטי בין המינים היא המנגנון העיקרי שבאמצעותו המגוון הצורני הוא מיוצר. במהלך המאה עבודה השוואתי הקימה אלה תוך דפוסי interspecific 3,4. אולי הגישה הנפוצה ביותר כדי לתאר את זה הוא וריאציה על מנת לחשב את היחס בין גודל דרוג של שני מאפיינים מורפולוגיים באמצעות המשוואה y = allometric bxα, כאשר x ו-y הם בגודל של שתי תכונות, כגון גודל איבר בגוף 8 , 9. משוואה זו מתארת ​​בתוך קבוצה (למשל, מינים, האוכלוסייה) דרוג היחסים בין שתי תכונות כמו שני משתנים בגודלם. התחבר שינוי של המשוואה הזאת מייצרת משוואה ליניארית פשוטה, log (y) = log (b) + αlog (x) ו - log-log מגרשים בגודל של תכונות שונות בין פרטים מאותו מין בדרך כלל לחשוף דרוג ליניארית עם ליירט של יומן (ב) ו מדרון של α, נקרא &quot;מקדם allometric &#39;9,10. וריאציה מורפולוגי בין קבוצות מתואר על ידי ההבדלים ביחס מיירט דרוג מדרונות זוג או תכונה מסוימת. כתוצאה מכך, וריאציה של פרמטרים של המשוואה allometric (ב ו - α) באלגנטיות מתאר את השינוי צורה בשבי הקשר בין גודל איבר בגוף בתוך ובין קבוצות ביולוגיות (ראה 11,12). לא כל התכונות בקנה מידה ליניארי אחד עם השני או עם גודל הגוף (למשל, 13,14) לפיכך, יחסים דרוג מורפולוגית הם אינפורמטיבי ביותר כאשר הנתונים לקוחים מתוך מגוון רחב של גדלים תכונה. כאן אנו מתארים כיצד מניפולציה פשוטה של ​​הניסוי בתזונה יכול לשמש כדי להפיק את מלוא טווח גודל הגוף חרקים. זה מאפשר הערכה של היחסים דרוג מלא עבור זוג נתון של תכונות, המאפשר תיאור מלא של איך covaries צורה עם גודל השוואה החזקה של יחסים בין קבוצות דרוג פרמטרים ביולוגיים. למרות שאנו מתמקדים תסיסנית, המתודולוגיה שלנו צריכה להיות ישימה לכל חרק מותמרים כמעט במלואה.

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila at JoVE.com

Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

יחסים דרוג מורפולוגי ללכוד ולתאר בצורה האורגניזם. אנו מציגים שיטה למדידת יחסים דרוג מורפולוגיים במגוון הטבעי של הגוף גדלים חרקים מותמרים מלא. בעזרת מניפולציה פשוטה דיאטה נגדיל את התפלגות הגדלים תכונה, המתיר תיאור מדויק של כיצד הצורה והגודל שיתוף להשתנות.

מניפולציה ניסויית של גודל הגוף על הערכת יחסי דרוג מורפולוגי ב תסיסנית</em

The scaling of body parts is a central feature of animal morphology1-7. Within species, morphological traits need to be correctly proportioned to the body ...

experimental-manipulation-body-size-to-estimate-morphological-scaling

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

13.7K Views.  University of Houston. יחסים דרוג מורפולוגי ללכוד ולתאר בצורה האורגניזם. אנו מציגים שיטה למדידת יחסים דרוג מורפולוגיים במגוון הטבעי של הגוף גדלים חרקים מותמרים מלא. בעזרת מניפולציה פשוטה דיאטה נגדיל את התפלגות הגדלים תכונה, המתיר תיאור מדויק של כיצד הצורה והגודל שיתוף להשתנות.

Video: Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

Experimental Approaches to Tissue Engineering

גישות ניסויית כדי הנדסת רקמות

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

שיטה חדשנית לExosome כימות ומדידה גודל

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

נסיוני באמצעות דרוזופילה כמערכת מודל הגעה לבדיקת רעילות במעבדה

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the executor for most of the liver functions, primary hepatocytes have limited proliferating capacity. This requires the establishment of ex vivo hepatocyte expansion models for liver physiological and pathological research. Here, we isolated murine hepatocytes by two steps of collagenase perfusion and established a 3D organoid culture as the 'mini-liver' to recapitulate cell-cell interactions and physical functions. The organoids consist of heterogeneous cell populations including progenitors and mature hepatocytes. We introduce the process in detailed to isolate and culture the murine hepatocytes or fetal hepatocyte to form organoids within 2-3 weeks and show how to passage them by mechanically pipetting up and down. In addition, we will also introduce how to digest the organoids into single cells for lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering. The organoids can be used for drug screens, disease modelling, and basic liver research by modeling liver biology and pathobiology.

A long-term ex vitro 3D organoid culture system was established from mouse hepatocytes. These organoids can be passaged and genetically manipulated by lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering.

מניפולציה ממסדית וגנטית של אורגנוידים של מורין הפטוציט

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

ניתוח, תיקון והדמיה של ה-Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is a typical autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by inflammatory infiltration, demyelination, and axonal damage. Currently, there are no measures to cure MS completely, but multiple disease-modifying therapies (DMT) are available to control and mitigate disease progression. There are significant similarities between the CNS pathological features of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and MS patients. EAE has been widely used as a representative model to determine MS drugs' efficacy and explore the development of new therapies for MS disease. Active induction of EAE in mice has a stable and reproducible effect and is particularly suitable for studying the effects of drugs or genes on autoimmune neuroinflammation. The method of immunizing C57BL/6J mice with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) and the daily assessment of disease symptoms using a clinical scoring system is mainly shared. Given the complex etiology of MS with diverse clinical manifestations, the existing clinical scoring system can't satisfy the assessment of disease treatment. To avoid the shortcomings of a single intervention, new indicators to assess EAE based on clinical manifestations of anxiety-like moods and osteoporosis in MS patients are created to provide a more comprehensive assessment of MS treatment.

The present protocol describes the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in a mouse model using myelin oligodendrocyte glycoprotein and monitoring the disease process using a clinical scoring system. Experimental autoimmune encephalomyelitis-related symptoms are analyzed using mouse femur micro-computed tomography analysis and open field test to assess the disease process comprehensively.

אינדוקציה ומדדי הערכה מגוונים של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

Multiple sclerosis (MS) is a typical autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by inflammatory infiltration, demyelination, and ...