Die Forschung in dieser Studie beschrieben durch einen National Science Foundation Grant (DEB-0805818), um WAF unterstützt wurde, AWS und ID Diese Studie wurde auch durch Zuschüsse IOS-0845847 bis AWS, IOS-0919855 bis AWS und ID-und IOS-0920720 unterstützt WAF

<html> 1. Aufzucht und Manipulation von Diät, um Unterschiede in Körpergröße und Flügel Größe produzieren Rational und Überblick. Der Ausdruck der Skalierung Beziehungen letztlich hängt die Entwicklung regulatorischen Prozesse, die Abweichungen zu produzieren in der letzten Orgel und Körpergröße. Diese Prozesse lassen sich am besten von der Arbeit aus ganz metamorphen (dh holometabolen) Insekten wie D. beschrieben melanogaster, wo Organe wachsen als undifferenzierte &#39;Imaginalscheiben &quot;im grub-like Larve 11,15-17. In Drosophila, sind endgültig Orgel und Körpergröße durch das Wachstum während der Larvenstadien geregelt; Larven durch die ersten und zweiten Larvenstadium wachsen, bis sie eine minimale lebensfähige Gewicht für eclosion (MVW E) erreichen gegenüber dem Beginn des dritten Larvenstadium 18. Hunger vor Erreichen des MVW E verhindert Erwachsenen Schlüpfen. Allerdings erzeugen Larven, die bei MVW E verhungert sind lebensfähig Erwachsenen, wenn auch auf eine sehr kleine Größe. Dies liegt daran, Ernährung während der Entwicklung reduziert reduziert endgültigen Körper und Orgel Größe, nicht nur in Fliegen, sondern in fast allen Tieren 19-21. Durch die Manipulation Verfügbarkeit von Nahrungsmitteln nach MVW E erreicht ist, aber vor der Verpuppung eintritt, ist es möglich, extreme phänotypische Plastizität in der Körpergröße, die sich stark überwiegt anderen Quellen der Variation (z. B. individuelle genetische Variation) zu induzieren. <ol><li> Die Eier werden von der Bevölkerung phänotypisiert werden gesammelt, eingeteilt in Partien von 50 und in Fläschchen mit 10ml von Standard-fly Essen. Da die Eiablage erfolgt kontinuierlich, sind Eier alle 24 Stunden für 3 Tage gesammelt und produziert drei Alterskohorten. </li><li> Als die älteste Kohorte der wandernden Stufe erreicht oder hat gerade erst begonnen sich zu verpuppen, ist die Ernährung Manipulation angewendet. An diesem Punkt, der ältesten Kohorte weit über die MVW E ist, ist die jüngste Kohorte sehr nahe an den MVW E schließen und die verbleibenden Kohorte ist irgendwo zwischen diesen Extremen. So wird Abnehmen von an dieser Stelle sehr große Erwachsene aus der ältesten Kohorte zu produzieren, sehr kleine Erwachsene aus der jüngsten Kohorte und mittelgroßen Erwachsenen aus den verbleibenden Kohorte. Zum Entfernen der Larven aus dem Fläschchen, ca. 5 ml 40% Saccharose-Lösung ist es, alle Fläschchen aufgenommen. Um kostenlos den Larven, das Essen ist für 15-20 Minuten auf einem Schüttler Tabelle zu einer mittleren Geschwindigkeit bewegt. </li><li> Schwimmende Larven sind aus der Saccharose-Lösung mit einer Geldstrafe (00) Pinsel, platziert in Fläschchen mit einem feuchten Wattebausch und erlaubte sich zu verpuppen entfernt. Alternativ könnte Larven auf einem unverdaulichen Lebensmittelzusatzstoff wie Methylcellulose 22 platziert werden. </li></ol> 2. Abschätzung der Körpergröße Rational und Übersicht. Frühere Studien zeigen, dass Thorax Länge weniger als ideal Proxy für die gesamte Körpergröße 22 ist. Stattdessen verwenden wir Puppenstadium Größe als Maß für die Körpergröße. Maximale Körpergröße ist bei der Einstellung der Fütterung, die Verpuppung vorausgeht fixiert. Als Ergebnis gibt es eine enge Korrelation zwischen Puppenstadium Größe und erwachsenen Körper Größe 23. <ol><li> Puppen sind Bauchseite angeordnet auf Objektträger aus Glas und aufgenommen mit einer digitalen Kamera, die an einem Binokular. Jedes Bild wird erfasst, eine eindeutige Identifizierung Code und übertragen auf einem Computer über einen Live-Feed Anschließen der Digitalkamera an den Computer. </li><li> Abgebildet Puppen sind auf die individuellen 2 ml epitubes enthält 1 ml essen fliegen, mit dem einzigartigen Code für die einzelnen markierten bewegt, und durchstach mit Luftlöchern, um den Gasaustausch zu ermöglichen. </li><li> Puppenstadium Größe ist als die Anzahl der Pixel des Puppenstadium Silhouette geschätzt. Andere Größen Metriken können auch verwendet werden. </li></ol> 3. Trait (Flügel) Größenabschätzung Rational und Übersicht. Um Bild-Flügel, verwenden wir ein &quot;Flügel-Grabber&quot; 24, die und zieht hält den Flügel eines leben, betäubt fliegen senkrecht zu ihrer Körper. Pressed zwischen zwei Glasscheiben, ermöglicht dies dem Flügel als ein zweidimensionales Objekt abgebildet werden. <ol><li> Fliegen sind betäubt leicht mit CO 2 und in Position gebracht in den Flügel-Grabber auf einem Binokular mit einer digitalen Kamera, die an einen Computer angeschlossen ist eingebaut. </li><li> Der Flügel ist abgebildet und unter dem einzigartigen Code für die einzelnen gespeichert. </li><li> Flügel Größe kann anhand der minimalen konvexen Polygon, das marginal festen Landmarken umschreibt oder als die Pixelzahl des Flügels Silhouette werden. </li></ol> 4. Scaling Beziehung Schätzung <ol><li> Die Daten werden über die Kohorten zusammengefasst, sondern getrennt nach Geschlecht und transformierten anmelden. </li><li> Scaling Beziehungen sind, um die Größe von Daten mit Typ II (dh reduzierte Hauptachse) Regression (siehe eine Übersicht in 12) und die Parameter für jede Gruppe geschätzt fit. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Zelt &quot;&gt; Unsere Ernährung Manipulation produziert ein breites Spektrum an Körpergrößen (Abbildung 1) und Trait Größen (Abbildung 2). Trägt man die Log-transformierten Merkmale gegeneinander verrät ihre Muster von Kovariation innerhalb einer bestimmten biologischen Gruppe und ermöglicht Montage der Skalierung Beziehung der Gruppe (Abbildung 3). Extraktion der Skalierung Beziehung Parameter, die beschreiben, wie Form Waagen mit Körpergröße ermöglicht den Vergleich, wie Form covaries mit einer Größe zwischen den Gruppen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig1.jpg" /> Abbildung 1. Pupa von Extremen der Größenverteilung über Ernährung Manipulation hergestellt nach Personen erreichen die MVW E. Actual Puppenstadium Bilder sind auf der linken Seite mit den entsprechenden Silhouetten für die Messung von Puppenstadium Größe auf der rechten Seite angezeigt. Skala bar beträgt 1mm. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig2.jpg" /> Abbildung 2. Flügel von den Extremen des Körpers Größenverteilung über Ernährung Manipulation hergestellt wurde, nach Personen zu erreichen die MVW E. Actual Flügel Bilder sind auf der linken Seite mit den entsprechenden Silhouetten für die Messung der Flügel Größe auf der rechten Seite gezeigten. Skala bar beträgt 1mm. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig3.jpg" /> Abbildung 3. Wing-Körpergröße-Skalierung für Drosophila melanogaster nach Geschlecht. Transformierten Login-Daten für Einzelpersonen beiderlei Geschlechts, die voll-fed (dunkle Kreise), verhungert ein (graue Kreise) oder zwei Tage (offene Kreise) als Larven wurden. Typ II Regressionsgerade ist für jedes Geschlecht dargestellt. Zwischen jeder Altersgruppe, Rückgang der durchschnittlichen Flügelfläche von ~ 0,1 mm (~ 7%) und ~ 0,2 mm (~ 8%) auf, die Erhöhung der Gesamtreichweite von Phänotypen beobachtet. Die Regressionen zeigen, dass Frauen etwas hypoallometric für diese Skalierung Beziehung (Steigung 0,96) sind, während Männer etwas hyperallometric (Steigung 1,06) sind.

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body-size+regulation:+Combining+genetics+and+physiology.">Body-size regulation: Combining genetics and physiology.</a> Curr. Biol. 15, 825-827 (2005).</li><li>Nijhout, H. F., Davidowitz, G., Roff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+the+mechanism+that+controls+body+size+in+Manduca+sexta.">A quantitative analysis of the mechanism that controls body size in Manduca sexta.</a> J. Biol. 5, 16.11-16.15 (2006).</li><li>Davidowitz, G., Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+basis+of+reaction+norms:+The+interaction+among+growth+rate,+the+duration+of+growth+and+body+size.">The physiological basis of reaction norms: The interaction among growth rate, the duration of growth and body size.</a> Integr. Comp. Biol. 44, 443-449 (2004).</li><li>Stieper, B. C., Kupershtok, M., Driscoll, M. V., Shingleton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+discs+regulate+developmental+timing+in+Drosophila+melanogaster.">Imaginal discs regulate developmental timing in Drosophila melanogaster.</a> Dev. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+model+of+static+allometry+in+holometabolous+insects.">Developmental model of static allometry in holometabolous insects.</a> Proc. R. Soc. B. 275, 1875-1885 (2008).</li><li>Stern, D. L., Emlen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+basis+of+allometry+in+insects.">The developmental basis of allometry in insects.</a> Development. 126, 1091-1101 (1999).</li><li>Emlen, D. J., Allen, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype+to+phenotype:+Physiological+control+of+trait+size+and+scaling+in+insects.">Genotype to phenotype: Physiological control of trait size and scaling in insects.</a> Integr. Comp. Biol. 43, 617-634 (2003).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Morphologische Skalierung ist Gegenstand intensiver Untersuchungen in der Evolutionsbiologie seit fast einem Jahrhundert. In jüngerer Zeit hat die unmittelbare Grundlage der Regulation des Wachstums und Skalierung zunehmend an Bedeutung in der Entwicklung, Physiologie und Genetik (siehe zB Beiträge in 12,15,23-25). Unsere Methodik ermöglicht Abschätzung der morphologischen Skalierung Beziehungen über das gesamte Spektrum der Zug-und Körpergrößen. Dies kann wichtig sein, wie trait Größe kann nicht linear mit der Körpergröße (zB 13,14). Dies kann jedoch nicht sichtbar sein, wenn die Tiere nur unter idealen Laborbedingungen aufgezogen werden. Obwohl unser Protokoll wurde ausdrücklich Schätzung der Flügel-Körper-Größe Skalierung Beziehung in Drosophila erlauben entwickelt, kann es mit Trait-spezifische Modifikation verwendet werden, um die Skalierung Beziehung für alle morphologischen Merkmals in Fliegen zu schätzen. Ebenso kann die Ernährung Manipulation wahrscheinlich benutzt, um das gesamte Spektrum der Zug-und Körpergrößen in anderen voll metamorphen Insekten produzieren; solche Anwendungen erfordern einfach wissen, wann der MVW E erreicht wird und die Anwendung der Manipulation an diesem Punkt in der Ontogenese.

experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in drosophila

Die Skalierung von Körperteilen ist ein zentrales Merkmal der tierischen Morphologie 1-7. Innerhalb der Arten und morphologischen Merkmale richtig, um den Körper für den Organismus zu funktionieren proportioniert müssen, größere Personen haben in der Regel größeren Körperteile und kleinere Individuen haben in der Regel kleineren Körperteilen, ist so dass sich insgesamt der Körperform einer ganzen Reihe von erwachsenen Körper Größen beibehalten. Die Forderung nach richtigen Proportionen bedeutet, dass Individuen innerhalb der Arten in der Regel eine geringe Variation der relativen Eigenschaft size. Im Gegensatz dazu relativ Merkmal Größe stark variieren zwischen den Arten und ist eine primäre Mechanismus, durch den morphologischen Vielfalt entsteht. Über ein Jahrhundert vergleichende Arbeit hat diese intra-und interspezifische Muster 3,4 etabliert. Vielleicht ist die am weitesten verbreitete Ansatz dieser Variation zu beschreiben, ist die Skalierung Beziehung zwischen der Größe von zwei morphologischen Merkmale mit der allometrischen Gleichung berechnen y = bxα, wobei x und y sind die Größe der beiden Merkmale, wie Orgel und Körper Größe 8 , 9. Diese Gleichung beschreibt die innerhalb der Gruppe (zB Arten, Bevölkerung) Skalierung Beziehung zwischen zwei Eigenschaften, da beide in der Größe variieren. Log-Transformation dieser Gleichung ergibt sich eine einfache lineare Gleichung, log (y) = log (b) + αlog (x) und log-log Parzellen von der Größe der verschiedenen Merkmale von Individuen der gleichen Art in der Regel zeigen lineare Skalierung mit einem Intercept von log (b) und einer Neigung von α, die so genannte &quot;allometrischen Koeffizient&quot; 9,10. Morphologische Unterschiede zwischen den Gruppen ist durch Unterschiede in der Skalierung Beziehung fängt oder Hängen für ein bestimmtes Merkmal Paar beschrieben. Folglich Variation der Parameter der allometrischen Gleichung (b und α) elegant beschreibt die Form Veränderung der Beziehung zwischen Orgel und Körpergröße innerhalb und zwischen biologischen Gruppen (siehe 11,12) erfasst. Nicht alle Züge linear mit einander oder mit der Körpergröße (zB 13,14) sind also morphologische Skalierung Beziehungen sehr informativ, wenn die Daten aus dem gesamten Spektrum von trait Größen getroffen werden. Hier beschreiben wir, wie einfach experimentelle Manipulation der Ernährung verwendet werden, um das gesamte Spektrum der Körpergröße bei Insekten produzieren. Dies erlaubt eine Abschätzung der vollen Skalierung Beziehung für einen bestimmten Paar von Merkmalen, so dass eine vollständige Beschreibung der Form covaries mit einer Größe und einer robusten Vergleich der Skalierung Beziehung Parameter unter biologischen Gruppen. Obwohl wir uns auf Drosophila, sollte unsere Methodik werden für nahezu alle voll metamorphen Insekten.

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Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

Morphologische Skalierung Zusammenhänge erfassen und beschreiben organismal Form. Wir präsentieren eine Methode zur morphologischen Skalierung Beziehungen über das natürliche Verbreitungsgebiet der Körpergrößen in vollem Umfang metamorphen Insekten zu messen. Mit einer einfachen Diät Manipulation erhöhen wir die Verteilung der Zug Größen ermöglichen die genaue Beschreibung der Form und Größe co-variieren.

Experimentelle Manipulation von Körpergröße zu morphologischen Scaling Relationships in Estimate Drosophila</em

The scaling of body parts is a central feature of animal morphology1-7. Within species, morphological traits need to be correctly proportioned to the body ...

experimental-manipulation-body-size-to-estimate-morphological-scaling

Research

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Biology

Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

13.7K Aufrufe.  University of Houston. Morphologische Skalierung Zusammenhänge erfassen und beschreiben organismal Form. Wir präsentieren eine Methode zur morphologischen Skalierung Beziehungen über das natürliche Verbreitungsgebiet der Körpergrößen in vollem Umfang metamorphen Insekten zu messen. Mit einer einfachen Diät Manipulation erhöhen wir die Verteilung der Zug Größen ermöglichen die genaue Beschreibung der Form und Größe co-variieren.

Serie: Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Experimentelle Ansätze zur Tissue Engineering

Forschung

Biologie

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Eine innovative Methode zur Quantifizierung und Exosom Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

Experimentelles Protokoll für die Verwendung von Drosophila als ein Wirbellosen Modellsystem für Toxizitätstests im Labor

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

Nicht-invasive Überwachung der Größe der Läsion in einer heterologen Mausmodell der Endometriose

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the executor for most of the liver functions, primary hepatocytes have limited proliferating capacity. This requires the establishment of ex vivo hepatocyte expansion models for liver physiological and pathological research. Here, we isolated murine hepatocytes by two steps of collagenase perfusion and established a 3D organoid culture as the 'mini-liver' to recapitulate cell-cell interactions and physical functions. The organoids consist of heterogeneous cell populations including progenitors and mature hepatocytes. We introduce the process in detailed to isolate and culture the murine hepatocytes or fetal hepatocyte to form organoids within 2-3 weeks and show how to passage them by mechanically pipetting up and down. In addition, we will also introduce how to digest the organoids into single cells for lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering. The organoids can be used for drug screens, disease modelling, and basic liver research by modeling liver biology and pathobiology.

A long-term ex vitro 3D organoid culture system was established from mouse hepatocytes. These organoids can be passaged and genetically manipulated by lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering.

Etablierung und genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Sezieren, Fixieren und Visualisieren der Drosophila pupal notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is a typical autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by inflammatory infiltration, demyelination, and axonal damage. Currently, there are no measures to cure MS completely, but multiple disease-modifying therapies (DMT) are available to control and mitigate disease progression. There are significant similarities between the CNS pathological features of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and MS patients. EAE has been widely used as a representative model to determine MS drugs' efficacy and explore the development of new therapies for MS disease. Active induction of EAE in mice has a stable and reproducible effect and is particularly suitable for studying the effects of drugs or genes on autoimmune neuroinflammation. The method of immunizing C57BL/6J mice with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) and the daily assessment of disease symptoms using a clinical scoring system is mainly shared. Given the complex etiology of MS with diverse clinical manifestations, the existing clinical scoring system can't satisfy the assessment of disease treatment. To avoid the shortcomings of a single intervention, new indicators to assess EAE based on clinical manifestations of anxiety-like moods and osteoporosis in MS patients are created to provide a more comprehensive assessment of MS treatment.

The present protocol describes the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in a mouse model using myelin oligodendrocyte glycoprotein and monitoring the disease process using a clinical scoring system. Experimental autoimmune encephalomyelitis-related symptoms are analyzed using mouse femur micro-computed tomography analysis and open field test to assess the disease process comprehensively.

Induktion und diverse Bewertungsindikatoren der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is a typical autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by inflammatory infiltration, demyelination, and ...