La investigación descrita en este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencias (DEB-0805818) de WAF, AWS y la identificación de este estudio también fue apoyado por subvenciones del IOS-0845847 para AWS, IOS-0919855 de AWS y la identificación y IOS-0920720 para WAF

<html> 1. Crianza y manipulación de la dieta para producir una variación en el tamaño corporal y el tamaño del ala Racional y general. La expresión de las relaciones de escala en última instancia depende de los procesos de desarrollo normativo que producen variación en el órgano final y el tamaño del cuerpo. Estos procesos se describen mejor en el trabajo de insectos totalmente metamórficas (es decir, holometábolos), como D. melanogaster, donde los órganos crecer como indiferenciada &quot;discos imaginales&quot; en el grub-como larva 11,15-17. En Drosophila, el órgano final y el tamaño del cuerpo son regulados por el crecimiento durante la fase larvaria, las larvas crecen a través del estadio larval primera y la segunda hasta que alcancen un peso mínimo viable para la eclosión (MVW E) hacia el comienzo del tercer estadio larval de 18 años. Hambre antes de alcanzar MVW E impide la eclosión de adultos. Sin embargo, las larvas que están muertos de hambre en MVW E generar adultos viable, aunque a un tamaño muy pequeño. Esto se debe a reducción de la nutrición durante el desarrollo del cuerpo reduce el final y el tamaño del órgano, no sólo en las moscas, pero en casi todos los animales 19-21. Mediante la manipulación de la disponibilidad de alimentos después de MVW E se alcanza, pero antes de la pupación ocurre, es posible inducir la extrema plasticidad fenotípica en el tamaño corporal que es mucho más importante otras fuentes de variación (por ejemplo, la variación genética individual). <ol><li> Los huevos son recogidos de la población a ser fenotipo, dividido en lotes de 50 y se colocan en frascos que contienen 10 ml de alimentos marcha estándar. Debido a la oviposición ocurre continuamente, los huevos se recogen cada 24 horas durante tres días, la producción de tres grupos de edad. </li><li> Cuando la cohorte de más edad llega a la etapa errante o acaba de empezar para pupar, la manipulación de la dieta se aplica. En este punto, la cohorte de más edad es mucho más allá de la E MVW, la cohorte más joven está muy cerca de la E MVW y la cohorte restante está en algún lugar entre estos extremos. Por lo tanto, la eliminación de alimentos en este momento se producen los adultos de gran tamaño de la cohorte de más edad, los adultos muy pequeños de la cohorte más joven y los adultos de tamaño intermedio de la cohorte restante. Para eliminar las larvas de los viales, de aproximadamente 5 ml de solución de sacarosa al 40% se agrega a todos los viales. Para liberar a las larvas, los alimentos se agita durante 15-20 minutos sobre una mesa vibradora conjunto a una velocidad intermedia. </li><li> Las larvas flotantes se eliminan de la solución de sacarosa con una multa (00) pincel, se colocan en frascos que contienen un tapón de algodón mojado y se permite que se convierten en crisálidas. Por otra parte, las larvas pueden ser colocados sobre un aditivo alimentario no digerible como metilcelulosa 22. </li></ol> 2. Estimación del tamaño corporal Racional y general. Estudios previos indican que la longitud del tórax es una representación menor que el tamaño ideal para el total del cuerpo 22. En su lugar, utilizar el tamaño de pupa como una medida del tamaño del cuerpo. Tamaño corporal máximo se fija en el cese de la alimentación que precede a la fase de pupa. Como resultado, existe una estrecha correlación entre el tamaño de las pupas y el tamaño corporal adulto de 23. <ol><li> Las pupas están dispuestas lado ventral hacia arriba en el portaobjetos de vidrio y fotografiado con una cámara digital conectada a un microscopio de disección. Cada imagen es capturada, le asigna un código de identificación único y transferir al ordenador a través de una transmisión en vivo de conectar la cámara digital a la computadora. </li><li> Imágenes pupas se mueven al individuo 2 ml que contiene 1 ml epitubes de alimentos volar, etiquetados con el código único para ese individuo, y se punza con respiraderos para permitir el intercambio de gases. </li><li> Tamaño de las pupas se estima como el número de píxeles de la silueta de pupa. Otros indicadores de tamaño también puede ser utilizado. </li></ol> 3. Rasgo (ala) estimación del tamaño Racional y general. A las alas de la imagen, se utiliza un ala de grabber &quot;24, que atrae y mantiene el ala de un perpendicular vivir, volar anestesiado a su cuerpo. Presionado entre dos piezas de vidrio, esto permite que el ala para ser captado como un objeto de dos dimensiones. <ol><li> Las moscas son anestesiados con un poco de CO 2 y se coloca en la posición de la pinza de mariposa en un microscopio de disección provisto de una cámara digital que se conecta a un ordenador. </li><li> El ala se crea una imagen y se guarda bajo el código único para cada individuo. </li><li> Tamaño de las alas se puede calcular utilizando el polígono convexo mínimo que circunscribe marginal referencias fijas o como el número de píxeles de la silueta de las alas. </li></ol> 4. Escala de estimación relación <ol><li> Los datos se agrupan en las cohortes, pero separados por sexo y transformación logarítmica. </li><li> Relaciones de escala se ajuste a los datos de tamaño con el Tipo II (es decir, el eje mayor reducido) de regresión (ver revisión en 12) y los parámetros estimados para cada grupo. </li></ol> 5. Los resultados representativos: tienda de campaña &quot;&gt; Nuestros manipulación de la dieta se produce una amplia gama de tamaños de cuerpo (figura 1) y los tamaños de característica (Figura 2). Representación de los rasgos de registro se transformó uno contra el otro revela su patrón de covariación dentro de un determinado grupo biológico y permite colocar la relación de escala al grupo (Figura 3). Extracción de los parámetros de escala relación que describen cómo las escalas de forma con el tamaño corporal permite la comparación de la forma cómo covaría con el tamaño de los grupos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig1.jpg" /> Figura 1. Pupa de los extremos de la distribución del tamaño producido a través de la manipulación de la dieta después de los individuos a alcanzar la E MVW. Real de las imágenes de pupa se muestra a la izquierda con su silueta correspondiente a la medición del tamaño de pupa a la derecha. Barra de escala es de 1 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig2.jpg" /> Alas de la figura 2. Tomada de los extremos de la distribución del tamaño corporal producido por la manipulación de la dieta después de los individuos a alcanzar la E MVW. Las imágenes reales del ala se muestran a la izquierda con su silueta correspondiente a la medición del tamaño de las alas de la derecha. Barra de escala es de 1 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig3.jpg" /> Figura 3. Wing-cuerpo escala de tamaño de Drosophila melanogaster por sexo. Los datos log-transformados para los individuos de cada sexo que fueron totalmente alimentado (ojeras), un muerto de hambre (círculos grises) o dos días (círculos abiertos) en forma de larvas. Tipo de línea de regresión II se muestra para cada sexo. Entre cada grupo de edad, la disminución de superficie alar promedio de ~ 0,1 mm (~ 7%) y ~ 0,2 mm (~ 8%) se produce, el aumento de la gama total de fenotipos observados. Las regresiones muestran que las hembras son ligeramente hypoallometric para esta relación de escala (pendiente de 0,96) mientras que los machos son ligeramente hyperallometric (pendiente 1,06).

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body-size+regulation:+Combining+genetics+and+physiology.">Body-size regulation: Combining genetics and physiology.</a> Curr. Biol. 15, 825-827 (2005).</li><li>Nijhout, H. F., Davidowitz, G., Roff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+the+mechanism+that+controls+body+size+in+Manduca+sexta.">A quantitative analysis of the mechanism that controls body size in Manduca sexta.</a> J. Biol. 5, 16.11-16.15 (2006).</li><li>Davidowitz, G., Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+basis+of+reaction+norms:+The+interaction+among+growth+rate,+the+duration+of+growth+and+body+size.">The physiological basis of reaction norms: The interaction among growth rate, the duration of growth and body size.</a> Integr. Comp. Biol. 44, 443-449 (2004).</li><li>Stieper, B. C., Kupershtok, M., Driscoll, M. V., Shingleton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+discs+regulate+developmental+timing+in+Drosophila+melanogaster.">Imaginal discs regulate developmental timing in Drosophila melanogaster.</a> Dev. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+model+of+static+allometry+in+holometabolous+insects.">Developmental model of static allometry in holometabolous insects.</a> Proc. R. Soc. B. 275, 1875-1885 (2008).</li><li>Stern, D. L., Emlen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+basis+of+allometry+in+insects.">The developmental basis of allometry in insects.</a> Development. 126, 1091-1101 (1999).</li><li>Emlen, D. J., Allen, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype+to+phenotype:+Physiological+control+of+trait+size+and+scaling+in+insects.">Genotype to phenotype: Physiological control of trait size and scaling in insects.</a> Integr. Comp. 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No hay conflictos de interés declarado.

Escala morfológica ha sido objeto de intenso estudio de la biología evolutiva durante casi un siglo. Más recientemente, la base inmediata de la regulación del crecimiento y la ampliación se ha convertido cada vez más importante en el desarrollo, la fisiología y la genética (por ejemplo, ver en comentarios 12,15,23-25). Nuestra metodología permite la estimación de las relaciones de escala morfológica en toda la gama de rasgos y tamaños corporales. Esto puede ser importante, como el tamaño del rasgo no puede escalar de manera lineal con el tamaño del cuerpo (por ejemplo, 13,14). Sin embargo, esto puede no ser evidente cuando los animales se crían sólo en condiciones de laboratorio ideal. Aunque el protocolo ha sido desarrollado expresamente para permitir la estimación de la relación de tamaño de las alas del cuerpo de escala en Drosophila, que puede ser utilizado con el rasgo específico de modificación para estimar la relación de escala para cualquier rasgo morfológico de las moscas. Del mismo modo, la manipulación de la dieta probablemente puede ser utilizada para producir toda la gama de tamaños de los rasgos y cuerpo metamórfico de otros insectos en su totalidad; aplicaciones sólo requieren saber cuando el E MVW se logra y la aplicación de la manipulación en ese momento en la ontogenia.

experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in drosophila

La escala de las partes del cuerpo es una característica central de la morfología de los animales 7.1. Dentro de las especies, las características morfológicas deben ser correctamente proporcionada al cuerpo para que el organismo funcione, las personas mayores suelen tener más partes del cuerpo y los individuos más pequeños por lo general más pequeñas partes del cuerpo, de tal manera que la forma del cuerpo en general se mantiene en un rango de tamaños de cuerpo de un adulto. El requisito de que las proporciones correctas significa que los individuos dentro de cada especie por lo general presentan poca variación en el tamaño de carácter familiar. En contraste, el tamaño de rasgo familiar puede variar enormemente entre las especies y es un mecanismo principal por el cual se produce la diversidad morfológica. Más de un siglo de trabajo comparativo ha establecido estas intra e interespecíficas patrones de 3,4. Quizás el método más ampliamente utilizado para describir esta variación es calcular la relación de escala entre el tamaño de dos rasgos morfológicos mediante la ecuación alométrica y = bxα, donde x e y son del tamaño de los dos rasgos, como el órgano y el tamaño corporal 8 , 9. Esta ecuación describe la intra-grupo (por ejemplo, las especies, la población) relación de escala entre los dos rasgos que ambos varían en tamaño. Transformación logarítmica de esta ecuación produce una simple ecuación lineal, log (y) = log (b) + αlog (x) y log-log parcelas del tamaño de los rasgos diferentes entre los individuos de la misma especie suelen revelar la escala lineal con un intercepto de log (b) y una pendiente de α, denominado &quot;coeficiente alométrico&quot; 9,10. La variación morfológica entre los grupos se describe por las diferencias en intercepta relación de escala o pistas para un par determinado rasgo. En consecuencia, la variación en los parámetros de la ecuación alométrica (b y α) elegantemente describe la variación de la forma capturado en la relación entre el órgano y el tamaño del cuerpo dentro y entre los grupos biológicos (ver 11,12). No todos los rasgos de escala linealmente entre sí o con el tamaño del cuerpo (por ejemplo, 13,14) Por lo tanto, las relaciones morfológicas de escala son más informativos que los datos son tomados de la amplia gama de tamaños de rasgo. Aquí se describe cómo una simple manipulación experimental de la dieta puede ser utilizada para producir toda la gama del tamaño del cuerpo de los insectos. Esto permite una estimación de la relación de escala completa de dos determinados rasgos, lo que permite una descripción completa de la forma cómo covaría con un tamaño y una comparación robusta de los parámetros de relación de escala entre los grupos biológicos. Aunque nos centramos en Drosophila, la metodología debe ser aplicable a casi cualquier insecto totalmente metamórficas.

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Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

Relaciones morfológicas escala capturar y describir la forma del organismo. Se presenta un método para medir las relaciones morfológicas de escala a través del área de distribución natural de los tamaños de cuerpo de los insectos totalmente metamórficas. Utilizando una sencilla manipulación de la dieta se aumenta la distribución de tamaños de característica, que permite la descripción exacta de cómo la forma y el tamaño de co-varían.

La manipulación experimental del tamaño del cuerpo para la estimación de las relaciones morfológicas de escala en Drosophila</em

The scaling of body parts is a central feature of animal morphology1-7. Within species, morphological traits need to be correctly proportioned to the body ...

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Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

13.7K vistas.  University of Houston. Relaciones morfológicas escala capturar y describir la forma del organismo. Se presenta un método para medir las relaciones morfológicas de escala a través del área de distribución natural de los tamaños de cuerpo de los insectos totalmente metamórficas. Utilizando una sencilla manipulación de la dieta se aumenta la distribución de tamaños de característica, que permite la descripción exacta de cómo la forma y el tamaño de co-varían.

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Experimental Approaches to Tissue Engineering

Métodos experimentales para la Ingeniería de Tejidos

Investigación

Biología

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

El uso de ARN de interferencia mediada estrategia de alimentación para la detección de genes implicados en la regulación del cuerpo Tamaño del nematodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Un método innovador para exosome cuantificación y medición de tamaño

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

Protocolo experimental para el uso de Drosophila como sistema modelo de invertebrado para ensayos de toxicidad en el laboratorio

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the executor for most of the liver functions, primary hepatocytes have limited proliferating capacity. This requires the establishment of ex vivo hepatocyte expansion models for liver physiological and pathological research. Here, we isolated murine hepatocytes by two steps of collagenase perfusion and established a 3D organoid culture as the 'mini-liver' to recapitulate cell-cell interactions and physical functions. The organoids consist of heterogeneous cell populations including progenitors and mature hepatocytes. We introduce the process in detailed to isolate and culture the murine hepatocytes or fetal hepatocyte to form organoids within 2-3 weeks and show how to passage them by mechanically pipetting up and down. In addition, we will also introduce how to digest the organoids into single cells for lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering. The organoids can be used for drug screens, disease modelling, and basic liver research by modeling liver biology and pathobiology.

A long-term ex vitro 3D organoid culture system was established from mouse hepatocytes. These organoids can be passaged and genetically manipulated by lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering.

Establecimiento y manipulación genética de organoides hepatocitos murinos

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Disección, fijación y visualización del Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is a typical autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by inflammatory infiltration, demyelination, and axonal damage. Currently, there are no measures to cure MS completely, but multiple disease-modifying therapies (DMT) are available to control and mitigate disease progression. There are significant similarities between the CNS pathological features of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and MS patients. EAE has been widely used as a representative model to determine MS drugs' efficacy and explore the development of new therapies for MS disease. Active induction of EAE in mice has a stable and reproducible effect and is particularly suitable for studying the effects of drugs or genes on autoimmune neuroinflammation. The method of immunizing C57BL/6J mice with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) and the daily assessment of disease symptoms using a clinical scoring system is mainly shared. Given the complex etiology of MS with diverse clinical manifestations, the existing clinical scoring system can't satisfy the assessment of disease treatment. To avoid the shortcomings of a single intervention, new indicators to assess EAE based on clinical manifestations of anxiety-like moods and osteoporosis in MS patients are created to provide a more comprehensive assessment of MS treatment.

The present protocol describes the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in a mouse model using myelin oligodendrocyte glycoprotein and monitoring the disease process using a clinical scoring system. Experimental autoimmune encephalomyelitis-related symptoms are analyzed using mouse femur micro-computed tomography analysis and open field test to assess the disease process comprehensively.

Inducción y diversos indicadores de evaluación de la encefalomielitis autoinmune experimental

Multiple sclerosis (MS) is a typical autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by inflammatory infiltration, demyelination, and ...