עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם הקרן הלאומית למדע (מענק מספר MCB-0447750).

<ol>
	<li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+(Ice-Cap+2.0).">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li><li>Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis.">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li><li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era.">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li><li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis.">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li><li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration.">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li><li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis.">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis.">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single-nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li><li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics.">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיטת הקרח יתר המוצגים כאן מאפשרת מדען כדי לאסוף דגימות רקמה מתוך מאות או אפילו אלפים, של צמחים בודדים ביום אחד וביעילות לחלץ הדנ&quot;א הגנומי ממדגמים אלה לשימוש התגובות genotyping. על ידי מתן מדען הפרט את היכולת גנוטיפ אלפי שתילים בתקופה קצרה של זמן, את שיטת הקרח יתר יש פוטנציאל להקל על מספר ניסויים גנטיים שאחרת לא להיות מעשיים לביצוע. דוגמאות אחדות מוצגים להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיפוי גנטי. פיין בקנה מידה מיפוי גנטי יכול להיות מהיר אם החוקר הוא מסוגל לזהות אירועי רקומבינציה בתוך מרווח מסוים לאורך כרומוזום 3. אם מרווח זה כרוך מרחק גנטי קצר מאוד, אז האירועים רקומבינציה תהיה נדירה יחסית באוכלוסייה מיפוי segregating. מסיבה זו, ייתכן שיהיה צורך לאלפי מסך של צמחים בודדים כדי למצוא מחדש את הרצויאנשים combinant. תהליך זה יכול להיות מהיר מאוד על ידי שימוש יתר קרח. גם בעידן של סידור מחדש הגנום כולו, הוא עדיין צריך להוכיח ישירות מוטציה נתון הוא אחראי ישירות הפנוטיפ של עניין. במקרים אלה, יהיה צורך להפריד את המוטציה עניין הרחק מוטציות קשר הדוק אחרים כדי להוכיח מוטציה מועמד היא בעצם סיבתי. במצבים כאלה, קרח יתר יספק שיטה יעילה לשבירת הקשר בין זוג של מוטציות קשור קשר הדוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Multi-מוטנטים. זה הפך להיות משותף לחוקרים ללמוד ארבידופסיס לשלב אללים מוטנטים שונים של לוקוסים מספר לתוך אדם אחד כדי להתגבר על יתירות תפקודית 4-6. כדוגמה, לשקול מקרה שבו אדם רוצה לשלב אללים מוטנטים מארבע לוקוסים שונים לתוך הצמח יחיד דרך מעבר גנטית. עבור פרויקט זה, יהיה צורך ליצורn אדם אשר הטרוזיגוטיים על ארבעת לוקוסים כחלק מתוכנית המעבר. כאשר הזרע הזה מרובעת-heterozygote קובע, הומוזיגוטי מרובעת צפוי להיות נוכח בשיעור של אחד מתוך 256 באוכלוסייה כתוצאה של הצאצאים. הקרנת לאדם זה נדיר על ידי שיטות מסורתיות יהיה מאוד עבודה אינטנסיבית. לשם השוואה, באמצעות קרח יתר עבור פרויקט זה יספק את המדען עם אסטרטגיה יעילה לזיהוי הומוזיגוטי מרובעת נדיר בדור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> iTILLING. במעבדה שלנו לאחרונה תיאר גישה חדשנית סינון עבור נוכחות של מוטציות בגנים המושרה עניין 7 ארבידופסיס. שיטה זו היא וריאציה על טכניקה ממוסדת בשם חורש המשמש למצוא מוטציות הורה אוכלוסיות של אנשים שטופלו mutagen כימיים 8-10. יש לנו שם השיטה שלנו iTILLING כי הוא גרסה אישית של חורש המאפשר indמדען ividual להשיג משהו שיש לו חובה מסורתי צוות מחקר גדול להשלים. Ice יתר מהווה חלק בלתי נפרד של השיטה iTILLING 7, כמתואר להלן. </li></ol> הרעיון מאחורי iTILLING היא לייצר האוכלוסייה מוטציה חלוף, אשר עומד בניגוד לאוכלוסיות מוטנטים עמידים נוצר לפרויקטים לעבד המסורתית. עבור iTILLING, זרעים מתוך אוכלוסייה M2 התנשא נזרעים לתוך 50-100 בלוקים שווי קרח, ו-DNA מופק בשיטת קרח יתר. שתילים ארבידופסיס ממוקמות אז 4 ° C תוך הקרנת מוטציה מתבצעת באמצעות ה-DNA קרח יתר preps. שתילי עגבניות מאוחסנים על 12 ° C.. לאחר שתילים מוטציות הרצוי נושאת זוהו, הם התאוששו הקרח יתר צלחות הועבר אדמה. iTILLING אינו מיועד לספק לאוכלוסייה לטווח ארוך מוטציה למען הקהילה המחקר כולו למסך. במקום זאת, iTILLING מספק האסטרטגיה שבאמצעותהמדען אחד יכול מסך האוכלוסייה מוטציה מותאמות אישית עבור מוטציות קומץ של גנים במהירות, ביעילות, ובמחיר נמוך יחסית. מצאנו קרח יתר להיות שיטה יעילה לגידול genotyping, ארבידופסיס עגבניות ואורז. אנו צופים כי מינים אחרים של צמחים צריכים גם להיות מקובל יתר קרח. מגבלה אחת על מגוון המינים שניתן לאכלס על ידי Ice-Cap הוא בגודל של הזרעים. רק צמחים עם הזרעים קטן מספיק כדי להתאים לתוך הבארות של צלחת 96-טוב יהיה תואם יתר קרח בתצורה הנוכחית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, NJ </td><td> 2000 Geno / מלתעה </td><td> מכונת עבור רועד פלטות רוט להפקת DNA </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-אוטם </td><td> ABgene ארה&quot;ב </td><td> AB-0384 </td><td> איטום ידני חום המכונה משמש פלטות שורש לפני שיבוש רקמה </td></tr><tr><td> צנטריפוגה מצויד נושאות microplate מתנדנד </td><td> Beckman Coulter </td><td> אלגרה 25R </td><td> כל צנטריפוגה עם ספקים microplate מתנדנד יהיה מתאים </td></tr><tr><td> MicroFill Dispenser microplate </td><td> BioTek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> מנפק נוזל מילוי אוטומטי עבור microplates </td></tr><tr><td> מותג Bialettiקוקי 17x11 ס&quot;מ מסחרי גדול גיליון </td><td> יעד Department Store </td><td> www.bialetti.com </td><td> זה נייר אפייה ספציפי יש עומק אידיאלי עבור יתר הקרח </td></tr><tr><td> Custom Made ארון מתכת </td><td> חומרה Store </td><td></td><td> ראו טקסט תיאור מלא </td></tr><tr><td> 33 ליטר פלסטיק תיבת אחסון </td><td> יעד Department Store </td><td> Sterilite מותג </td><td> עבור מזרקת קרח יתר. אחסון קופסת פלסטיק גדול מספיק כדי להכיל את גיליון 17x11 ס&quot;מ עוגיה </td></tr><tr><td> 30 ליטר לכל משאבת מזרקה שעה </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> משאבת מזרקה קטנה הצוללת זמין בחנויות אספקת גן </td></tr><tr><td> צינור עבור משאבת מזרקה </td><td> כל ההיצע מעבדה החברה </td><td></td><td> תואם משאבת מזרקה צינור </td></tr><tr><td> פלסטיק קלאמפ </td><td> חומרה Store </td><td></td><td> קלאמפ להחזיק צינור עוגיהסדין </td></tr><tr><td> מכסי פלסטיק שקוף מלמטה Microtest פלקון שטוח 96-היטב צלחות קלקר </td><td> BD פלקון www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> מכסי פלסטיק שקוף לכיסוי הקרח יתר פלטות שתיל </td></tr><tr><td> 3M micropore באיספלנית </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch נירוסטה בקוטר של כדורי פלדה </td><td> הרטפורד טכנולוגיות, רוקי היל, CT </td><td> 034-006-1K </td><td> משמש כדי לשבש את רקמת השורש לאחר הקטיף </td></tr><tr><td> 3 אינץ שיער גומיות </td><td> בחנות מכולת מקומית </td><td></td><td> משמש כדי להבטיח פלייט שורש כדי פלייט שתיל </td></tr><tr><td> 4 מ&quot;מ קוטר שיפודי עץ </td><td> בחנות מכולת מקומית </td><td></td><td> שיפודי אלה משמשים בדרך כלל להכין קבבוני </td></tr><tr><td> פישר סיינטיפיק Nunc המותג, 1-mL צלחות מסנן ללא frit </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 278012 </td><td> 96, גם שתיל פלטות עם חורים בתחתית. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-ובכן גבוה-PCR ארובה פלייט </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 14-230-242 </td><td> גם 96-Root פלטות </td></tr><tr><td> אגר - תרבית תאים נבדק </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Morpholinoethanesulfonic חומצה (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige ו Skoog (MS) תערובת מלח הבסיס </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> פיל חום קל איטום לסכל </td><td> ABgene ארה&quot;ב </td><td> AB-0745 </td><td> איטום מחממים סרט לאיטום פלטות שורש לפני שיבוש רקמה </td></tr><tr><td> מותג דאק אריזות אקסטרה רחב סרט, 3.00 &quot;x 54.6 yd </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> פריט לא. 21242139 </td><td> סרט דבקעבור microplates איטום המכיל תמציות DNA לאחסון </td></tr><tr><td> איטום רולר </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> יד החזיקה כלי מתגלגל לכבישה סרט דבק איטום על microplates </td></tr><tr><td> 96-היטב מתכת תרמית לחסום </td><td> קולמן בן הזוג </td><td> 36400-66 </td><td> משמש להקפיא את צלחות רוט לקציר רקמה </td></tr><tr><td> Whatman נייר סינון </td><td> Whatman הבינלאומי </td><td> 1002 090 </td><td> משמש לחיטוי זרעים פני השטח </td></tr><tr><td> פנויה פיפטה פסטר </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 13-678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;פיפטה פסטר חד פעמי המשמש להעברת זרעים פלייט שתיל </td></tr><tr><td> פיירקס תבנית אפייה (20 ס&quot;מ X 30 ס&quot;מ) </td><td> יעד Department Store </td><td></td><td> משמש לבנות אמבט קרח יבש / אתנול. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping

זה הופך נפוץ עבור מדענים צמח לפתח פרויקטים הדורשים את genotyping של מספר גדול של צמחים. השלב הראשון בכל פרויקט genotyping היא לאסוף דגימת רקמה מצמח בנפרד. הגישה המסורתית משימה זו לצמחים מדגם אחד ב-פסק זמן. אם אדם רוצה גנוטיפ מאות או אלפי אנשים, לעומת זאת, באמצעות תוצאות האסטרטגיה צוואר בקבוק משמעותי בצנרת genotyping. שיטת הקרח יתר שאנו מתארים כאן מספק פתרון תפוקה גבוהה לאתגר זה בכך שהוא מאפשר מדען אחד לאסוף רקמה כמה אלפי שתילים ב 1,2 יום אחד. רמה זו של התפוקה מתאפשר על ידי העובדה כי רקמות שנקטפו מצמחים 96-at-פסק זמן, ולא אחת בכל פעם-a-. שיטת הקרח יתר מספק פלטפורמה משולבת לביצוע צמיחה שתיל, קציר רקמות, מיצוי DNA. הבסיס יתר הקרח הצמיחה של seedliNGS בזוג מגובב של 96-גם הצלחות. הבארות של צלחת העליון מכילים תקעים של צמיחה התקשורת אגר בו שתילים בודדים לנבוט. השורשים לצמוח למטה דרך התקשורת אגר, צא צלחת העליון דרך חור, ומעבירים למים צלחת נמוך המכיל. כדי לקצור רקמה להפקת DNA, המים צלחת התחתון המכיל רקמות השורש הוא קפוא במהירות בעוד שתילי בצלחת העליונה להישאר בטמפרטורת החדר. צלחת העליון הוא קלופים אז מן הצלחת התחתון, מניב צלחת אחת עם 96 דגימות רקמה שורש קפואים בקרח אחד צלחת עם 96 שתילים קיימא. הטכניקה נקראת &quot;קרח יתר&quot;, כי היא משתמשת קרח כדי ללכוד את רקמות השורש. צלחת 96-המכילה גם את השתילים אז יכול עטוף בנייר כסף והועבר בטמפרטורה נמוכה. תהליך זה משהה צמיחה נוספת של שתילים, אך אינו משפיע על יכולת הקיום שלהם. לאחר ניתוח גנוטיפ הושלמה, שתילים עם גנוטיפ הרצוי ניתן להעביר גם 96-pמאוחר לקרקע עבור התפשטות נוספת. אנחנו הדגימו את התועלת של השיטה קרח יתר באמצעות thaliana ארבידופסיס עגבניות, אורז ושתילים. אנו צופים כי השיטה צריכה גם לחול על מינים אחרים של צמחים עם הזרעים קטן מספיק כדי להתאים לתוך הבארות של 96-גם הצלחות.

Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

Ice-Cap: שיטה לגידול צמחי ארבידופסיס ועגבניות בצלחות עם 96 בארים עבור גנוטייפ בתפוקה גבוהה | ביולוגיה | וִידֵאוֹ

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

שיטת הקרח יתר מאפשר לגדל צמחים צלחות 96-היטב שאינם destructively שורש רקמה מן הקציר שתיל אחד. הדנ&quot;א מופק רקמות השורש הזה יכול לשמש התגובות genotyping. מצאנו כי קרח יתר עובד היטב עבור<em&gt; ארבידופסיס thaliana</em&gt;, עגבניות, שתילי האורז.

Ice יתר: שיטה גידול ארבידופסיס צמחים עגבניות ב 96-פלטות היטב genotyping תפוקה גבוהה

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

ice-cap-method-for-growing-arabidopsis-tomato-plants-96-well-plates

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Plant Biology

Plant Reproduction

SCIENTISTS IN ACTION

22.7K Views.  University of Wisconsin-Madison. שיטת הקרח יתר מאפשר לגדל צמחים צלחות 96-היטב שאינם destructively שורש רקמה מן הקציר שתיל אחד. הדנ"א מופק רקמות השורש הזה יכול לשמש התגובות genotyping. מצאנו כי קרח יתר עובד היטב עבור ארבידופסיס thaliana, עגבניות, שתילי האורז.

Video: Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: שיטה פשוטה genotyping מדויק

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

שיטת תפוקה גבוהה למדידה של קצב סינון הגלומרולרי בעכברים בהכרה

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בצמחים ארבידופסיס

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

מדידת התנגדות סטרס חמצוני של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; בצלחות microtiter 96-היטב

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...