עבודה זו נתמכה על הגנום Scholar / פקולטה מעבר פרס NIH / NHGRI (K22 HG002908) ל-AMD ושותפות אסטרטגית בין המכון למערכות ביולוגיה והאוניברסיטה של ​​לוקסמבורג על ידי. בקשות לזנים או פלסמידים צריכים להיות מופנות לאיימו דאדלי (aimee.dudley @ gmail.com).

1. בניית הזנים ואפיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות את מתח דיפלואידי הטרוזיגוטיים לשימוש בצלב על ידי הזדווגות זנים הפלואידים ובחירת diploids 2 או באמצעות מתח הטרוזיגוטיים מתרחש באופן טבעי. הזנים לא צריכים נמל ה-GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהמתח אינו יכול לגדול על YPD 2 + 200 G418 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהמתח הוא מסוגל sporulate. BEST תואם צלבי יעילות נביגה נמוכים, אבל זמן מיון FACS תדירות עולה נביגה נמוך הנדרש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תרבות O / N של הזן ב5 YPD מיליליטר ולגדול עם תסיסה ב30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 0.5 מיליליטר של תרבות O / N שלוש פעמים עם PBS (pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים נשטפו, להסיר את supernatant, resuspend ב 2 בינוניים נביגה מיליליטר 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתסיס תאים ב RT ולבדוק מדי יום להיווצרות הטטרדה באמצעות מיקרוסקופ אור לעומת שלב עם מטרת 40X. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את כדאיות הנבג של הצלב על ידי נתיחה קונבנציונלית 2,3 של מספר קטן (~ 20) של tetrads. כדאיות Spore בהכלאות בין רקע מתח שונה משתנית מאוד ובלתי צפוי. עם זאת, ניתן להשתמש בו ציפיות מראש של כדאיות נבג כדי להעריך את היעילות של ניסוי הטובים ביותר לקראת שלבי עבודה והעלות האינטנסיבית של חיסכון וgenotyping הזנים. לכן, בשלב זה מומלץ מאוד. </li></ol> 2. טרנספורמציה של Diploids עם הספרייה של פלסמידים המינימרקטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את פלסמיד המינימרקטים pCL2_BC לזן דיפלואידי הטרוזיגוטיים באמצעות פרוטוקול השינוי המתואר בGietz וודס 8 בשינויים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תאים כבר הודגרו עם תערובת השינוי ב30 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, להוסיף DMSO ל -8% מהיקף תמהיל טרנספורמציה. תוספת של DMSO כבר נמצאה כדי לשפר את i יעילות שינויn קצת רקע מתח 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלב הלם החום, גלולה התאים עם צנטריפוגה קצרה, למזוג את תערובת השינוי, ולשטוף את התאים בעדינות בYPD. ואז, resuspend התאים 1 מיליליטר YPD ולאפשר להם להתאושש על RT במשך 3 שעות ללא תסיסה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר transformants על ידי ציפוי על YPD + G418 (200 מיקרוגרם / מיליליטר) אגר צלחות. כדי להבטיח בריכה מורכבת של ברקודים פלסמיד, לקצור מספר רב של מושבות, למשל 5 צלחות עם ~ 2,500 מושבות בכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם אחת מושבות גלויות (2-3 ימים של צמיחה ב30 מעלות צלזיוס), בריכת transformants ידי הגירוד בזהירות אותם מהצלחת לנוזל YPD + G418 (200 מיקרוגרם / מיליליטר) + גליצרול 15%. מערבולת השעיה תא זה, להעביר לבקבוקון שימור בהקפאה, ולהקפיא ב -80 ° C. הפוך המניה קפוא נפרדת לכל צלחת. מניות קפואות אלו משמשים כזנים מתחילים לשלב 3.1 ויכולות לשמש גם כדי ליצור יותר tetrads במועד מאוחר יותר, אם תרצה בכך. </li&gt; </ol> 3. המתנבג הספרייה של תאים הפך להשג Tetrads המינימרקטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחיות את התאים מהמניות הקפואות שנוצרו ב2.3 ידי צמיחת O / N ב 5 מיליליטר YPD + G418 (200 מיקרוגרם / מיליליטר) ב30 מעלות צלזיוס עם תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים מO / N תרבויות 3x ב PBS (pH 7.4) ולאחר מכן resuspend התאים בינוניים נביגה 7 בתוספת 200 G418 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתסיס תרבויות נביגה ב RT ולעקוב אחר התקדמות נביגה יום עד tetrads החדש הפסיק יוצרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתרבות מכילה tetrads בנוי היטב ויחסית מעט צמדים, להסיר תרבויות מהתסיסה ולהשאיר על RT במשך לפחות 7 ימים. בעוד כמה צלבים עשויים להיות מקובל על מערכת העיכול צלחת ושיבוש בהקדם tetrads יצר (שהוערך כמתואר ב7.3), הדגירה נוספת (7-10 ימים בניסויים שלנו) היא חיונית לצלבים אחרים. לכן, בשלב זה מומלץ מאוד. </li></ol> 4. הקמתגייטס FACS להטטרדה מיון Meiotically הביע היתוך SPS2-GFP על פלסמיד pCL2_BC מאפשר tetrads בתרבות נביגה כדי להתגלות ומבודד מהתרבות על ידי הקרינה. הפרוטוקול הבא פותח לFACSAria השני. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. שערי FACS. סדרה של ארבעה שערים רציפים משמשת כדי לבודד tetrads. השערים שמוצגים ב( א) ו (ב) לעזור להפחית את מספר הגושים. אירועי פלורסנט נבחרים עם השער ב( C). היסטוגרמה ב( ד &#39;) יש לו שתי פסגות. אירועים בשיא השמאל הם בעיקר tetrads (תמונת שיבוץ שמאלית), ואירועים בשיא הנכון הם בדרך כלל tetrads עם ניצן מצורף (תמונת שיבוץ מימין). שער אחרון הואלהחיל היסטוגרמה זו כדי לבחור אירועים שהם בעיקר tetrads (קווים אדומים). נתון זה שונה מLudlow, ואח&#39; 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תרבות sporulated על סדרן FACS ולהקים שני שערי פיזור ופיזור בצד קדימה שלא לכלול פסולת, תאים בכבדות, ותאים מרובים לכל טיפה (2A והדמויות 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לא צריך להיות אוכלוסייה של תאי ניאון, אשר בעת שימוש בכתב לבנות SPS2-GFP כוללים צמדים וtetrads 10. שער ה-GFP לעומת FSC לכלול אירועי ניאון אלה (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לרקע המתח זה עשוי להיות נחוץ כדי לכלול שער נוסף כדי להסיר גושים הכוללים tetrads ותאים אחרים. אם זה הכרחי, לבדוק היסטוגרמה FSC של אירועי הניאון ולציין שער הכולל אירועים עם FSC נמוך יותר (איור 2 ד, אירועים מגודרות הם באדום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את היעילות של t<html> הוא gating משטר ידי מיון ~ 1,500 tetrads לשקופית מיקרוסקופ וסופר את חלקם של tetrads אי tetrads באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב בהגדלה 400X. אחוזים מtetrads ניתן לאמוד באופן מדויק על ידי ספירה רק ~ 200 אירועי מיון, אבל מיון ~ 1,500 מפחית את כמות הזמן מושקעת בחיפוש אחר תאים בשקופית מיקרוסקופ. לחלופין, יחס tetrads אי tetrads ניתן להעריך בשלב 4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעת לעת לבדוק כי סדרן הוא דיווח מדויק את מספר האירועים על ידי מיון 25 tetrads לשקופית מיקרוסקופ ובדיקת התאים הכלולים באגל באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב בהגדלה 400X. לא צריך להיות 25 tetrads בטיפה. חזור על פעולה 3-4x כדי להעריך את השונות של מכשיר FACS. </li></ol> 5. Tetrads המיון על גבי צלחת אגר &quot;Width =&quot; p_upload/51401/51401fig3highres.jpg 500 &quot;/&gt; איור 3. מיקום של הצלחת אגר על סדרן FACS. כדי למיין tetrads לטיפה קטנה של פתרון zymolyase ממוקמת באמצע סטנדרטי צלחת (מעגלית) אגר, סטנדרטי (מלבני 100 מ&quot;מ) צלחת 96 היטב היא ראשונה להציב על הבמה של סדרן התא והסדרן מתוכנת להפקיד tetrads לתוך באר ספציפי (במקרה זה D5). ואז, הצלחת אגר החוזר ממוקמת על גבי צלחת 96 היטב ומיושר, כך שהירידה של zymolyase מרוכזת מעל הבאר שצוינה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את המספר הרצוי של YPD + G418 (200 מיקרוגרם / מיליליטר) צלחות לפחות 1.5 שעות בחממה 37 מעלות צלזיוס ממוקמת ליד סדרן FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכונה מרכזית של פרוטוקול המיון היא היכולת לכוון במדויק FACS מיון tetrads למיקום ספציפי בצלחת אגר המכילה מאגר של פתרון zymolyase. כדי לעשות זאת, הנח את &quot;נקודת ציון&quot; צלחת 96 היטב על tהוא אוטומטי יחידת תא בתצהיר (ACDU) של סדרן. הכן את פריסה מסוג זה יהיה למיין 25 tetrads לאחד טוב של פורמט 96 היטב. בחר גם קרוב לאמצע הצלחת, למשל גם D5. איור 3 מראה צלחת פטרי וצלחת 96 היטב הועמסה על סדרן תא. מיון 25 tetrads לכל צלחת תשואות מושבות מופרדות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא ערימה של 10 צלחות אגר מן החממה 37 מעלות צלזיוס לסדרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 25 μl אחד אגר הצלחת ופיפטה של ​​פתרון zymolyase (1 מ&quot;ג / מיליליטר ב0.7 M סורביטול) על גבי אגר בסמוך למרכז הצלחת. לאחר מכן, הנח את הצלחת על צלחת 96 היטב הציון, יישור אגל zymolyase מעל היעד גם משלב 5.2, למשל גם D5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל למיין ולהפקיד 25 tetrads לאמצע אגל zymolyase על הצלחת אגר. לאחר מכן, להסיר ולכסות את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 5.4 ו5.5 עד 25 tetrads כבר מסודרים לטיפי zymolyase על כל צלחת בערימה. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את ערימת צלחות המכיל הטטרדה ל37 מעלות צלזיוס החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הצעדים 5.3 דרך 5.7 עד שיש את כל הצלחות tetrads. </li></ol> 6. נבגי הפרדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל ערימה של צלחות אגר המכיל הטטרדה ב37 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחות מן החממה, להוסיף 15-25 חרוזי זכוכית 3 מ&quot;מ סטרילי לכל צלחת, ולנער את הצלחות כערימה (או כשתי ערימות של 5 צלחות) של 3-5 דקות. הפרדת הנבג הטובה ביותר מושגת על ידי הזזת הצלחות נוקשה מצד לצד או קדמי לאחורי. אל תזיזו את הצלחות כך שהחרוזים &quot;המערבולת&quot; מסביב לקצה החיצוני של הצלחת. השאר את חרוזים על הצלחות בסיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את ערימת צלחות עם חרוזים עם הפנים כלפי מעלה בחממה 30 מעלות צלזיוס. אחזר את צלחות המחסנית הבאות מן החממה 37 מעלות צלזיוס, וחזור על שלב 6.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות O / N ב30 ° C. </li></ol> 7. קציר מושבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחרדגירה O / N ב 30 מעלות צלזיוס, מושבות קטנות צריכה יצרו על הצלחות. מוציא בזהירות את הצלחות מן החממה מבלי להפריע חרוזי הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חרוזי זכוכית על ידי זהירות והיפוך במהירות את הצלחות מעל מיכל עמוק. המכל צריך להיות עמוק מספיק כדי לתפוס את חרוזים מבלי לאפשר להם להקפיץ למעלה ופגע בצלחת אגר. הקשה על תחתית הצלחת בזמן שהוא הפוך יכול לעזור לסלק חרוזים כי הם דבוקים לצלחת. ניתן לעשות שימוש חוזר חרוזים אלה על ידי שטיפה יסודית עם סבון, שטיפה היטב במי deionized וטיהור על ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר המושבות על כל צלחת ולהשתמש במספר המושבות להעריך את היעילות של הפרדת נבג והתאוששות. לדוגמא, 25 tetrads לכל צלחת לצלב עם כדאיות 100% ליד יכול להניב כולל של כל צלחת 100 מושבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצלחות עם כמות מספקת של מושבות (&gt; 65 לצלבים גבוהה כדאיות), תאי העברה מקולניו יורק לתוך באר נפרד מצלחת 96 היטב המכילה נוזל YPD + G418. כמו כן, שימו לב שהבארות מכילות מושבות מאותה הצלחת אגר; מידע זה ישמש כדי לסייע לתוכנת משימת הטטרדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 96 גם צלחות נוזל זרע תרבויות לגנוטיפ ולהצלת זנים כמו מניות גליצרול קפוא. ניתן למצוא פרטים על רצף RAD-תג וניתוח רצף באל Ludlow et 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Ludlow, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+tetrad+analysis.">High-throughput tetrad analysis.</a> Nat Methods. 10, 671-675 (2013).</li><li>Rose, M., Winston, F., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual. , (1990).</li><li>Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Saccharomyces+cerevisiae+asci.">Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li><li>Winge, O., Laustsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+two+types+of+spore+germination,+and+on+genetic+segregations+in+Saccharomyces+demonstrated+through+single+spore+cultures.">On two types of spore germination, and on genetic segregations in Saccharomyces demonstrated through single spore cultures.</a> C.R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 24, 263-315 (1937).</li><li>Coluccio, A., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspore+bridges:+a+new+feature+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+spore+wall.">Interspore bridges: a new feature of the Saccharomyces cerevisiae spore wall.</a> Microbiology. 150, 3189-3196 (2004).</li><li>Baird, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+SNP+discovery+and+genetic+mapping+using+sequenced+RAD+markers.">Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5791-57 (1991).</li><li>Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+isolates+of+Saccharomyces+cerevisiae+display+complex+genetic+variation+in+sporulation+efficiency.">Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency.</a> Genetics. 174, 985-997 (2006).</li><li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross.">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494, 234-237 (2013).</li><li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+gene+conversion:+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast.">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

תחומים רבים של מחקר בגנטיקה, החל מיפוי תכונה מורכב 11 לחקר מנגנוני רקומבינציה DNA 12, דורשים מספרים גדולים מאוד של צאצאים וכמויות גדולים של רצפי DNA. יש טכניקות שתינשאנה את כוחו של גישות קונבנציונליות עם הקיבולת של רצפי DNA תפוקה גבוהה הפוטנציאל לאפשר מחקרים שהיו בלתי פתירים בעבר. למרות מספר שיטות שמרי גנטיקה תפוקה גבוהה יושמו בצורה יעילה לבעיות ספציפיות, לכל אחד יש מגבלות שנופלות מתחולתה הרחבה של ניתוח הטטרדה קונבנציונלי. הכתובות הטובים ביותר עם אתגרים אלה על ידי העסקת גישת תפוקה גבוהה המשלבת נתיחת הטטרדה וgenotyping הצאצאים של שמרי צלבים. בשיתוף עם רצף RAD-תג מרובב, BEST מציע דרך זולה כדי ללקט מידע גנוטיפ עבור כל זן צאצאים תוך שמירה על יחסי הטטרדה באמצעות ברקודים הטטרדה ייחודיים.0; של שימוש בכל שיטות כיום תפוקה גבוהות, BEST משחזר באופן הדוק ביותר את המידע המסופק על ידי שמרי צלב גזור באופן ידני. יש BEST שתי תכונות עיקריות. הראשון הוא השימוש בFACS לבודד tetrads במהירות הרחק מתאים unsporulated בתרבות (פרוטוקול שלבי 5-6). היכולת לבודד אלפי אירועי ניאון (tetrads) נותנת BEST הרווח הגדול ביותר שלה בתפוקה. אוטומציה זה מספקת יתרון גדול עוד יותר מעל לנתיחה במדריך לצלבים עם יעילות נביגה נמוכה, בשל הזמן עלה צורך לזיהוי חזותי של אירועים נדירים. תכונת המפתח השנייה היא השימוש ברקוד מורכב ביותר מולקולרי (פרוטוקול שלב 2) שמועבר לכל נבג אחותו של הטטרדה. מכיוון שניתן להשתמש בם ברקודים אלה למחשוב לשחזר את יחסי הטטרדה בין הנבגים שהופצו באופן אקראי על פני צלחת אגר, הצורך באופן ידני תאי מערך ברשת הורה הוא להקל עליו. לבסוף,כי את הברקוד המולקולרי וגן כתב ה-GFP נביגה ספציפית מקושרים פיזי (באותו פלסמיד), רק tetrads ששמר את הברקוד המולקולרי נבחרים על ידי FACS מיון. ישנם שני שיקולים הקובעים את משך הזמן שתרבויות צריכה להיות מודגרות במדיום נביגה. ראשית, משום שהכתב נביגה הספציפי (SPS2-GFP) בא לידי הביטוי בשלב מוקדם במיוזה, GFP לבד אינו מבחין tetrads 4 נבג-שלם מהתאים שעדיין לא סיימו את המיוזה (כלומר צמדים). בעוד gating FACS נוסף עשוי להקטין את מספר tetrads ניאון, לא שלם, הדרך הקלה ביותר כדי להקטין את האירועים הללו לא רצויים היא פשוט ניטור התרבות נביגה (שלב 3.3) ושתמשיך פעם tetrads החדש הפסיק יוצרים. בניסויים שלנו, בתדירות של צמדים מסודרים היא פחות מ -1%. שנית, לכמה זמן נוסף צלבים בילה במדיום נביגה ב RT ללא תסיסה (שלב 3.4) significantly משפרת את ההפרדה tetrads ידי חרוזי הזכוכית בציפוי ((שלב פרוטוקול 6). למעשה, צעד זה הוא הכרחי לשיבוש של כמה צלבים. כמו כל שיטות התפוקה גבוהות, הטובים ביותר הוא &quot;רועש&quot; מאשר הגישה הקונבנציונלית המקבילה. הירידה הקלה ביעילות הטובים ביותר בהשוואה לנתיחה הטטרדה קונבנציונלית יכולה לנבוע משילוב של מספר גורמים. גורם אחד הוא האובדן המוגבר של נבגי קיימא אחר, אשר עלול להיגרם כתוצאה מהידבקות לחרוזי הזכוכית בהפצה או מוגבר מות נבג בשל הלחצים מכאניים של התהליך. גורם שני יכול להיות אובדן פלסמיד פשוט במהלך המיוזה. גורם שלישי יכול להיות ירידה יעילה במושבות שמישה וכתוצאה ממושבות מעורבים גנוטיפים, 5% ~ משוער של מושבות בפיילוט שלנו חוצים 1. סביר להניח כי מושבות אלה מייצגים כישלונות של הפרדה נבג אחות. בגלל פלואוריד המהירescence מיון והפרדת נבג לאפשר האוסף של מספרים עצומים של tetrads, הטובים ביותר הוא מצויד היטב כדי להתגבר על ירידה ביעילות בקנה מידה זה. בעוד חזרות עתידיות של BEST יכולים להגביר את היעילות מתקרבות לזה של נתיחה ידנית, זה אולי סביר יותר להניח כי מסלול מעריכי הנוכחי של קיבולת רצפי DNA יהיה במהירות לפצות על זה ברמה של אובדן מתח שמיש. בכל מקרה, את היכולת לבצע ניתוח הטטרדה בקנה המידה שבה ניתן ליישם BEST תאפשר מחקרים כי כרגע בלתי אפשריים בשיטות ידניות.

מיפוי Meiotic גן, הידוע בכינויו ניתוח הטטרדה, הוא מרכזי לשמרי גנטיקה. בקצרה, שני זנים הפלואידים, המכילים עותק אחד של כל כרומוזום, הם הזדווגו כדי ליצור מתח דיפלואידי הטרוזיגוטיים עם שני עותקים של כל כרומוזום, אחד מכל הורה. הרעבת תאי דיפלואידי לחנקן גורמת למיוזה (נביגה) שבו הכרומוזומים לשכפל, לעבור ארגון מחדש, ומתחלקים לארבעה תאים הפלואידים (נבגים או segregants) עם צירופים חדשים של אללים מכל הורה. ארבעה נבגים הנובעים ממיוזה יחידה יכולים להיות מבודדים על ידי תהליך ידני שנקרא נתיחת הטטרדה. 2,3 הנתיחה הקונבנציונלי הטטרדה שהשתנה מעט יחסית מאז הפרסום המקורי בשנת 1937 4, יש שלוש מטרות. ראשית, תאים שעברו מיוזה (tetrads) חייבים להיות מבודדים מרקע של תאי צמח. בניתוח קונבנציונלי, זה נעשה על ידי חוקר ש, באמצעותמיקרוסקופ, מבחינה ויזואלית מזהה tetrads על צלחת אגר ומעסיק מנגנון micromanipulator חזותי זיהוי tetrads על צלחת אגר ובאמצעות micromanipulator לעבור הטטרדה על אזור ללא תא של הצלחת. בשלב הבא, ארבעת הנבגים בהטטרדה חייבים להיות מופרדים פיזי כדי למנוע הזדווגות interspore. נבגים בתוך הטטרדה מוחזקים יחד על ידי שני נאד, השריד של קיר התא של תא דיפלואידי המקורי, וקבוצה של interspore גשרים 5. בניתוח קונבנציונלי הטטרדה הנאד יוסר על ידי עיכול אנזימטי, וחוקר משתמש micromanipulator לשבור גשרי interspore ולהקניט בנפרד הנבגים. לבסוף, הנבגים הבודדים אינם ערוכים בדפוס gridded ששומר על היחסים בין הנבגים, כלומר כל הצאצאים בשורה של ארבעה הם נבגי אחותו של אותו הטטרדה מקורי. שמרי חוקר מנוסה יכול להשלים את התהליך של ביתור 10 tetrads (מספר מינימאלי מקובללצלב) בכ 15 דקות. פיתחנו שיטה חדשה תפוקה גבוהה גנוטיפ הטטרדה, שאנו מכנים E arcode B equencing S nabled של etrads T (הטובים ביותר) 1. BEST מרחיב על שיטות קיימים בגנטיקה תפוקה גבוהה כך שהיא מאפשרת את הדור וגנוטיפ של מספרים גדולים של צאצאים כי הם מבודדים, genotyped, ונשמר כיחידים באופן שמאפשר יחסי נבג אחותו של כל ארבעת מוצרי meiotic להיות התאוששו. המטרה זו מושגת על ידי שימוש בשלוש אסטרטגיות עיקריות (איור 1). הראשון הוא המבוא של כתב לבנות כי תוויות בתאים שעברו מיוזה עם GFP ומאפשר להם להיות מבודדים על ידי תא הקרינה המופעל מיון (FACS). שני הוא השילוב של ברקוד DNA המורכב ביותר (מחרוזת של 15 נוקלאוטידים אקראיים) בטופס המועבר לכל ארבעת הנבגים של הטטרדה וניתן לקרוא על ידי רצפי DNA של ProGen רקומביננטיy ובכך מזהה את נבגי אחות מאותו הטטרדה. שלישי הוא צעד גנוטיפ, והטוב ביותר הוא תואם עם פלטפורמות גנוטיפ רבות שהלכידה שני סט של סמנים הגנומי כמו גם ברקוד הטטרדה ספציפי. אנו מעסיקים רצף הגבלה הקשורים אתר DNA תג (RAD-seq) שיטה 6 שמנתב את רצף הגנום לאתרי הגבלה ספציפי 1, ובכך ללכוד 2-3% עקביים של הגנום של זני צאצאים, כמו גם את הברקוד שמקורן בפלסמיד . ההתאוששות של מערכות יחסים הטטרדה יחד עם נתונים גנוטיפ אמפירי הנגזרים מן הצלב מאפשרת היסק מדויק של מידע חסר, ובכלל זה מעמדם של סמנים עם כיסוי רצף נמוך והגנוטיפ של אנשים inviable (ולכן בלתי הפיך) המלא. כאן, אנו מתארים את יישום השיטה במיקרואורגניזם הנפוץ ביותר המשמש למיפוי meiotic, שמרי ס cerevisiae. עם זאת, עם החלפות של קטין ריאה האורגניזם ספציפירבותיי, למשל חלבונים נביגה ספציפית שונים התמזגו ה-GFP, השיטה צריכה להיות בקלות להעברה למיקרואורגניזמים אחרים, כוללים אורגניזמים שבו מיפוי meiotic הוא באופן משמעותי יותר עבודה אינטנסיבית או פתירה ברגע זה. <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> איור 1. השיטה הטובים ביותר. () פלסמיד pCL2_BC הוא פלסמיד 2 מיקרון עם פיוז&#39;ן נביגה ספציפי GFP, התנגדות לG418, וברקוד אקראי 15 mer. בנייה של ספריית פלסמיד מתוארת באל Ludlow et 1. (ב) בריכה של פלסמידים המינימרקטים הופכת לזן דיפלואידי מצלב. אז transformants (C) גדלים על בחירה ו~ 10,000 מושבות הפכו הם אספו וsporulated. במהלך המיוזה כל נבג של הטטרדה יורש שיתוףpy של פלסמיד המינימרקטים. Tetrads (ד &#39;) מופרדים מתאי unsporulated ידי FACS ונאסף על צלחות אגר, שם הם מתעכלים ושבשו כדי לאפשר לכל נבג להקים מושבה. לאחר מכן מושבות (E) נאספות לתוך צלחות 96 היטב, phenotyped, וgenotyped. במהלך genotyping רקוד פלסמיד הוא לקרוא ומשמש לזיהוי ארבעה החברים של כל הטטרדה. נתון זה שונה מאל Ludlow et 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">FACSAria II (Special order unit)</td>
			<td style="width:149px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:155px;">Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td colspan="2">643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymolyase 100T</td>
			<td>Seikagaku Biobusiness</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418</td>
			<td>A.G. Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

best: barcode enabled sequencing of tetrads

ניתוח הטטרדה הוא כלי רב ערך עבור שמרי גנטיקה, אבל טבע מדריך למייגע של התהליך יש הפריע יישומה בקנה מידה גדולה. ברקוד מופעל רצף של Tetrads (הטובים ביותר) 1 מחליף את התהליכים ידניים של בידוד, שיבוש ומרווח tetrads. BEST מבודד tetrads מכוחו של חלבון ה-GFP היתוך נביגה ספציפית המאפשר מיון תא הקרינה המופעל של tetrads ישירות על גבי צלחות אגר, שבו הנאד מתעכל enzymatically והנבגים הם שיבשו באופן אקראי וערוך על ידי ציפוי חרוז זכוכית. המושבות הפלואידים מכן הוקצו יחסי נבג אחות, כלומר מידע על שנבגי מקורו מאותו הטטרדה, באמצעות ברקודים מולקולריים לקרוא בגנוטיפ. על ידי הסרת את צוואר הבקבוק של נתיחה ידנית, ניתן לבודד מאות או אפילו אלפי tetrads בתוך דקות. כאן אנו מציגים תיאור מפורט של הפרוצדורות הנדרשות לביצוע הטובים ביותר בשמריםשמר אפייה, החל במתח דיפלואידי הטרוזיגוטיים דרך הבידוד של מושבות נגזרות מצאצאי meiotic הפלואידים.

<html> BEST יכול לשפר באופן משמעותי את המהירות שבה ניתן לבודד מנבגי tetrads. כדוגמא לתפוקה בשיטה זו יכולה לספק, חוקר אחד ביצע את FACS מיון והפרדת נבג (שלבי 5.1 דרך 6.3) עם 149 צלחות אגר ב3 שעות 1. תשואה מקבילה (כ 3,725 tetrads) תדרוש יותר מ90 שעות של נתיחה ידנית. עם זאת, כמו שיטות תפוקה גבוהה רבות, איטרציה הנוכחית של השיטה יש כמה אובדן של יעילות בהשוואה לנתיחה ידנית. הפסד זה בא לידי ביטוי במספר מופחת של מושבות התאושש בהשוואה לציפייה מחושבת על בסיס כדאיות הנבג של הצלב, שנקבעה על ידי לנתיחה במדריך (שלב 1.4). בהנחה שהסיבות לנשירות נבג (דיון) משפיעות נבגים באופן אקראי, יכולות להתבצע הערכות של כמה מושבות התאוששו יהיו חברי tetrads בי 1, 2, 3, או 4 נבגים כבר התאוששו (איור 4). page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. סימולציה של יעילות שיטה ברמת הטטרדה. אי הצלחה לשחזר נבגים (כמושבות) יכולה להיות בגלל inviability נבג, נבג הידבקות לחרוזי הזכוכית, כישלון להפריד נבגים אחד מהשני, וכו &#39;ההתפלגות הבינומית שימשה כדי לחשב את החלק היחסי הצפוי של tetrads (עם לפחות אחת נבג התאושש בהצלחה) לייצר 4, 3, 2 או 1 מושבות בהתאם לחלק היחסי של כל הנבגים התאוששו בהצלחה. גרף זה יכול לשמש כמדריך גס למספר הזנים שסופו של דבר מרכיבים אותם ל3 - או 4 - tetrads נבג. ככל שמספר מושבות בכל צלחת עולה, כך גם מספר tetrads המלא התאושש. בניסוי שתואר לעיל, 25 tetrads מצלב עם קרוב כדאיות נבג 100% (כDetermined ידי נתיחה ידנית) 1 היה מצופה על 149 צלחות אגר. בניסוי זה, את המספר המרבי של מושבות שנצפו לכל צלחת היה 80, המציין כי 20 נבגים לא הצליחו ליצור מושבות בדידות. מספר הממוצע של מושבות בכל צלחת היה 62. מושבות מהצלחות 61 מכילות 65 מושבות או יותר נקצרו ורצף. של 3,700 הזנים שעברו בקרת איכות רצף, 72% יכולים להיות מוקצים המחשוב ל3 - או 4 - tetrads נבג.

Watch this Scientific Journal Video about BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads at JoVE.com

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

רצף ברקוד מופעל של Tetrads (הטובים ביותר) מחליף את התהליכים ידניים של בידוד, שיבוש ומרווח tetrads. BEST מבודד tetrads ידי תא הקרינה המופעל מיון על גבי צלחות אגר, מפריד את הנבגים על ידי תסיסה עם חרוזי זכוכית, וקובע שמושבות ערוכות באופן אקראי נגזרו מאותו הטטרדה המקורי באמצעות ברקודים מולקולריים.

רצף ברקוד מופעל של Tetrads: BEST

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

best-barcode-enabled-sequencing-of-tetrads

Research

JoVE Journal

Biology

10.0K Views.  Pacific Northwest Diabetes Research Institute.  רצף ברקוד מופעל של Tetrads (הטובים ביותר) מחליף את התהליכים ידניים של בידוד, שיבוש ומרווח tetrads. BEST מבודד tetrads ידי תא הקרינה המופעל מיון על גבי צלחות אגר, מפריד את הנבגים על ידי תסיסה עם חרוזי זכוכית, וקובע שמושבות ערוכות באופן אקראי נגזרו מאותו הט...

Video: BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

זיהוי גנטי של וריאנטים נדירים מן הרצף נקווה שימוש Splinter

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; untranslated regions (UTRs) are generated in differentiated cells whereas proliferating cells preferentially express transcripts with short 3&#39;UTRs. We describe the A-seq protocol, now at its second version, which was developed to map polyadenylation sites genome-wide and study the regulation of pre-mRNA 3&#39; end processing. Also this current protocol takes advantage of the polyadenylate (poly(A)) tails that are added during the biogenesis of most mammalian mRNAs to enrich for fully processed mRNAs. A DNA adaptor with deoxyuracil at its fourth position allows the precise processing of mRNA 3&#39; end fragments for sequencing. Not including the cell culture and the overnight ligations, the protocol requires about 8 h hands-on time. Along with it, an easy-to-use software package for the analysis of the derived sequencing data is provided. A-seq2 and the associated analysis software provide an efficient and reliable solution to the mapping of pre-mRNA 3&#39; ends in a wide range of conditions, from 106 or fewer cells.

3&#039; End Sequencing Library Preparation with A-seq2

This protocol describes a method for mapping pre-mRNA 3&#39; end processing sites.

3' סיום רצף ספריית הכנה עם א-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

הדמיה של מבנה שומן לבן תלת-ממד באמצעות צביעת כולה-הר

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract metabolic abnormalities. So far, different types of IF models with varying durations of fasting and feeding periods have been documented. However, interpreting the outcomes is challenging, as many of these models involve multifactorial contributions from both time- and calorie-restriction strategies. For example, the alternate day fasting model, often used as a rodent IF regimen, can result in underfeeding, suggesting that health benefits from this intervention are likely mediated via both caloric restriction and fasting-refeeding cycles. Recently, it has been successfully demonstrated that 2:1 IF, comprising 1 day of fasting followed by 2 days of feeding, can provide protection against diet-induced obesity and metabolic improvements without a reduction in overall caloric intake. Presented here is a protocol of this isocaloric 2:1 IF intervention in mice. Also described is a pair-feeding (PF) protocol required to examine a mouse model with altered eating behaviors, such as hyperphagia. Using the 2:1 IF regimen, it is demonstrated that isocaloric IF leads to reduced body weight gain, improved glucose homeostasis, and elevated energy expenditure. Thus, this regimen may be useful to investigate the health impacts of IF on various disease conditions.

The current article describes a detailed protocol for isocaloric 2:1 intermittent fasting to protect and treat against obesity and impaired glucose metabolism in wild-type and ob/ob mice.

הערכה של ההשפעות המטבולית של Isocaloric 2:1 לסירוגין צום בעכברים

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...