פרוטוקול זה הוא דרך פשוטה ויעילה מאוד לזהות מוטציות שנוצרו על ידי טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מאנשים רבים. שני היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם כי זה יכול להיעשות בכמה שעות וכי זה חל על שפע של אורגניזמים. עיצוב פריימר יכול להיות מאתגר עבור גנים מסוימים וייתכן שיידרשו סבבים מרובים של תכנון ואימות פריימר כדי להפוך את HRMA ליעילה.
לביצוע PCR הדרגתי, התחל על-ידי הכנת תערובת ראשית. לאחר מכן הסר 19 מיקרוליטרים של התערובת הראשית עבור הפקד שאינו תבנית או NTC בלוח 96 בארות. לאחר מכן, הוסף את התבנית לתערובת האב הנותרת.
Aliquot 20 microliters של תערובת המדגם לתוך צלחת 96-well. בצע PCR בעקבות הפרמטרים רכיבה על אופניים ולאחר מכן ליצור את פרופילי המסה תרמית באמצעות הפרמטרים המוזכרים בכתב היד. לאחר איסוף כל החומר הנדרש, להכין תערובת מאסטר עם 0.5 microliters של ריאגנט שחרור DNA ו 20 microliters של חוצץ דילול לכל אדם להיות genotyped.
באמצעות צינור רב ערוצי, aliquot 20 microliters של התערובת לתוך צלחת PCR ולהשאיר את צלחת PCR על קרח. לאחר מכן, מניחים את יתושי G1 המרידים בצלחת פטרי כדי לשמור אותם מסומם ומניחים שמונה יתושים מסוג בר בצלחת הפטרי השנייה. נגב זוג פינצטה עם 70% אתנול והשתמש פינצטה מחוטאת כדי להסיר את אחד היתושים רגליים אחוריות.
לאחר מכן, להטביע את הרגל בתמיסת ריאגנט שחרור DNA. מניחים את היתוש בווינאל המתאים וסוגבים את הקרבון עם ספוג. לאחר סיום, לנגב את פינצטה עם 70% אתנול לפני שתמשיך עם הסרת הרגל מן היתוש הבא עד צלחת 96-well הושלמה.
מאוחר יותר, לאטום את הצלחת עם חותם צלחת PCR אופטי ולדגירה את צלחת PCR המכיל את הרגליים בטמפרטורת החדר במשך שתיים עד חמש דקות, ואחריו דגירה ב 98 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. אפשר לצלחת להתקרר לטמפרטורת החדר. עבור PCR, הכינו תערובת ראשית המכילה את הרכיבים המועדפים ולאחר מכן השתמשו בצינור רב-ערוצי כדי להעביר 19 מיקרוליטרים של תערובת האב לכל באר של הצלחת 96-well.
לאחר העברת מיקרוליטר אחד של תמיסה לשחרור DNA המכיל DNA יתוש שהוכן בעבר לצלחת, לאטום את הצלחת עם חותם צלחת PCR אופטי. בצע את ה- PCR עם הפרמטרים המתאימים לרכיבה על אופניים כדי ליצור פרופילי המסה תרמיים בהתאם לפרמטרים המתוארים בכתב היד, ולאחר מכן בדוק את פרופילי ההיתוך על-ידי הקצאת פקד מסוג בר לאשכול הייחוס. סמן את האשכולות השונים בצבעים המתאימים בתבנית 96-well.
לאחר מכן, בחר את האנשים עם עקומות של עניין ולהסיר את האנשים שנבחרו מן הצינורות כדי לחצות בחזרה. מזון דם עשה את זה נקבות, ואחריו איסוף G2As. בניתוח הייצוגי, מוצג ניתוח הרצף של מוטציית ZIP11 של Aedes aegypti.
האלקטרופרוגרמה ממוטנטים הטרוזיגוס של Aedes aegypti ZIP11 הצביעו על מיקום הנוקלאוטיד שבו התרחשה ההדלה. ההדלה מיוצגת על ידי מעבר מפסגות בודדות לכפלות, שכן תנוחות פולימורפיות מראות את שני הנוקלאוטידים במקביל. בסוף ההפעלה, מספר זוגות הבסיס שנמחקו או נוספו חושב על-ידי ספירת הפסגות הבודדות.
יתושים המכילים מוטציות בגנים Aedes aegypti ZIP11 ומיו-פאם היו genotyped ורצף מאומת באמצעות ניתוח המסה ברזולוציה גבוהה של HRMA. האותות הפלואורסצנטיים של הדגימות נוטלו לערכים יחסיים של אחד עד אפס. בנוסף, כל עקומה הופחתה מההפניה מסוג בר וציין את ההגדלה המתאימה.
הקצאת אשכול אוטומטית שנכשלה מוצגת בתוצאות הייצוגיות, כאשר לא בוצעה הבחנה נכונה בין הקבוצות. יתר על כן, כל מדגם נותח בנפרד והוקצה לקבוצות הנכונות בהתבסס על הדמיון לדגימות התייחסות של הטרוזיגוטים, הומוזיגוטים וטרנסהטרוזיגוטים. לאחר ביצוע HRMAs, ריצוף ה- DNA מהאנשים שעברו מוטציה יש צורך לנתח את indels ולזהות את המוטציות האחרות ברצף היעד.
