פרוטוקול זה מספק תפוקה גבוהה ואיפור אמין לניתוח NHEJ שיכול לקבוע את השכיחות ואת הכמות היחסית של מוטציות Indel באוכלוסיות יתושים בעריכת גנים. בהשוואה לדור הבא, או ריצוף סנגר, ל- ddPCR יש זמן תפנית מהיר יותר לתוצאות, המאפשר ניתוח מהיר ומלא של שונות גנטית לשדה עבור אורגניזמים מהונדסים גנטית. שיטה זו צריכה להיות ישימה בדרך כלל לכל המערכות הניסיוניות.
שיוכיח את ההליך יהיה תאי פאם, עמית מחקר מהמעבדה של היאנג. ראשית, הכינו 25 מיקרוליטרים של ה-PCR טיפה דיגיטלית, או תערובת דגימת ddPCR על ידי הוספת תערובת סופר ddPCR, פריימרים קדימה ואחורה, בדיקות HEX או FAM, DNA ומים בפרופורציות המתוארות בטקסט. ואז לערבב ביסודיות את התגובה על ידי מערבולת.
באמצעות פיפטה רב-ערוצית של 50 מיקרוליטר, טען 20 מיקרוליטרים של תערובת דגימת ddPCR לשורה האמצעית של המחסנית. לאחר מכן השתמש 200 מיקרוליטר פיפטה רב ערוצית לטעון 70 microliters של השמן לשורה התחתונה מבלי ליצור בועות לאורך הצינורות. מניחים את האטם, נוגעים רק בקצוות, נמנעים מהמרכז, האזור הקומר, ולאחר מכן מניחים את הצלחת בבטחה במחולל הטיפות, וסוגרים את הכיסוי כדי להתחיל את הריצה.
כדי להעביר את תערובת הטבילה מהשורה העליונה של המחסנית לצלחת 96-well, השתמש בצינור רב-ערוצי, ושחרר 40 מיקרוליטרים של דגימה נוזלית למשך שלוש עד חמש שניות בזווית של 30 עד 45 מעלות. לאחר מכן לגרש את התערובת לתוך הבאר לאט במשך יותר משלוש שניות בזווית של 45 מעלות, ומאפשר לו לרדת מהצד, ולאחר מכן ללכת לתחנה השנייה של pipette לגרש את הנוזל לחלוטין. בעזרת אטמי חום בנייר כסף, אוטמים את הלוחות לחמש שניות ב-180 מעלות צלזיוס.
מניחים את הצלחת האטומה לתוך התרמוציקלר, ומגדירים את תנאי ה- PCR להנחיות ההורדה של NHEJ על ידי הגדרת denaturation ראשונית ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, להגדיר 40 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות כדי denature, 55 מעלות צלזיוס מדקה אחת עד חלאל, ו 60 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות כדי להאריך. לאחר 40 מחזורים, קבעו 98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, והחזקה סופית בארבע מעלות צלזיוס.
השתמש בקצב הרמפה של שתי מעלות צלזיוס לשנייה עבור כל השלבים. טמפרטורת חישול ישתנה, על פי הבדיקות או פריימר בשימוש. מניחים את הצלחת בבטחה בקורא הטיפות כאשר ה- A1 מסומן היטב בצד שמאל העליון.
פתח את התוכנית והגדר את הצלחת על ידי הגדרת FAM כערוץ הייחוס הידוע, ו- HEX כערוץ הלא ידוע עבור כל באר. לאחר מכן, שנה את השם עבור כל דוגמה. הפעל את ניסוי הקריאה טיפה כימות ישיר תוך שמירת התבנית.
לייעד את הפרמטרים הניסיוניים הנכונים לניתוח תוכנה, כלומר מידע לדוגמה, תערובת סופר, שם יעד, סוג יעד, ערוץ אות 1 ערוץ 2. לאחר מכן, הגדר את הסף לספירת טיפות מעל 10,000 לקבלת תוצאות אמינות. לאחר מכן, בדוק את ספירת הטיפות עבור כל באר בכרטיסיה טיפה, ומבטיח שכולם מעל 10,000.
לבסוף, בדוק משרעת 1D להפרדת אותות יעילה מתשלילים. בעורך הלוחות, הדגישו את כל הצלחת והגדירו את סוג הניסוי לירידה. הגדר את יעד WT כהפניה, וייעד את ערוץ 1 עבור FAM ואת ערוץ 2 עבור HEX.
הגדר את יעד NHEJ כלא ידוע, וייעד את ערוץ 1 עבור FAM ואת ערוץ 2 כאפס. בכרטיסיה משרעת דו-ממדית, הגדר את סף האשכול בעזרת כלי הגרף עבור כל דגימה. הזנב קשור בדרך כלל עם אשכול WT לבדיקות NHEJ.
תחת לשונית היחס, לחץ על סמל גלגל השיניים מהחלק השמאלי העליון של הגרף ובחר את שפע השבר כדי להתוות נקודה המתאימה לאחוז אירועי NHEJ. 15 דגימות שונות של 10 יתושים כל אחד הכיל אללים NHEJ שונים, נותחו וזוהו באמצעות בדיקת טיפה, והתוצאות הראו כי כל 15 הדגימות נשאו 100% אללים Indel. בניסוי אחר, 11 דגימות של יתושים מסוג בר ויתושים NHEJ עם אחוזי NHEJ שונים נבדקו עם פרוטוקול ddPCR זה.
התוצאות הראו כי האחוז שזוהה היה קרוב יחסית לזיהוי Indel על ידי טכניקת ניתוח אמפליסון. פיפטה לאט כדי למנוע בועות, ולאפשר לכל טיפות אמולסיה לטפטף במורד הקיר של בארות.
