עבודה זו נתמכה על ידי ברית אטקסיה המחקר של Friedreich ומענק טייס מן ארנולד קרן משפחת והמרכז בתאי גזע וביולוגיה התפתחותית ב MD Anderson Cancer Center.

1. וירוס ייצור התמרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת הפניקס Ampho תאים בצפיפות של צלחת 10 ~ 7-8x10 6 ס&quot;מ לכל 10 מ&quot;ל של DMEM בינוני (גלוקוז DMEM גבוהה, 10% FBS חום מומת, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, ללא אנטיביוטיקה). מקום בחממה ותרבות לילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת transfect הפניקס תאים באמצעות 12 מיקרוגרם של קידוד וקטורי או Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-myc, או GFP גן (Addgene פלסמידים 17217, 17218, 17219, 17220) ו 35 Fugene μl 6. להכין תערובת transfection ב μl של 500 DMEM בינוני (גלוקוז DMEM גבוהה, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, לא FBS ואנטיביוטיקה). דגירה 20 דקות. בעדינות פיפטה מתחמי דנ&quot;א לתוך צלחות 10 ס&quot;מ המכיל 70-80% תאים confluent הפניקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף התקשורת 6-8 שעות שלאחר transfection עם DMEM בינוני (גלוקוז DMEM גבוהה, 10% FBS חום מומת, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין) המכיל פניצילין וסטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לאסוף וירוסים המכיל מדיה 4 פעמים ב 12 שעותבמרווחים, לשלב את כל החלקים ומסוננים באמצעות כמה 0.45 מיקרומטר סינון להסיר תאים משפחתיים ופסולת (מדיה המכילים חלקיקים נגיפיים אפשר לשמור במקרר במשך 2 שבועות מבלי לאבד את פעילות זיהומיות, אולם ההקפאה אינה מומלצת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור retroviral, התמרה צלחת fibroblasts בוגרים האדם (מעבר 10, Coriell מעבדות) מ h קפוא המניה 24 שקדמו ליום האחרון של אוסף המדיה retroviral. זרעים התאים על 6 צלחות מכוסות היטב ג&#39;לטין בבתי 1x10 צפיפות 5 תאים לכל גם ב DMEM גלוקוז גבוהה, 10% FBS, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, פניצילין, סטרפטומיצין ולא חיוניות חומצות אמינו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחליף למחרת DMEM התקשורת עם התקשורת המכילים חלקיקים נגיפיים שהתקבלו תאים הפניקס. הוסף מדיה נגיפיים (1 מ&quot;ל של כל אחד Oct4, Sox2, Klf4, ו-c-myc התקשורת, הכולל 4 מ&quot;ל) השלימו עם 6 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של polybrene אל היטב בכל צלחת 6-גם של התרבויות פיברובלסטים ו צנטריפוגות ב 1600g עבור 1h על 20 ° C. כ 12 שעות AFter התמרה, להחליף את התקשורת ויראלי עם המדיום תרבות פיברובלסטים. בצע זיהום ויראלי צנטריפוגה 3 פעמים ב -24 מרווחי ש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות fibroblasts ב DMEM מדיה עבור H 48 לאחר ההדבקה האחרונות. יש לבדוק את היעילות של זיהום על ידי transductions מקבילים עם מדיה retroviral המבטאים GFP. איור 1 מדגים את היעילות של זיהום צנטריפוגה הקל retroviral של פיברובלסטים האדם. </li></ol> 2. תכנות מחדש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 6 צלחות גם עם γ-מוקרן שכבות מזין MEF ידי זריעת תאים MEF בצפיפות של ~ 2x10 5 תאים לכל היטב את הג&#39;לטין טיפול 6 צלחת גם במדיום גידול פיברובלסטים. למחרת לפצל fibroblasts אדם שנדבקו באמצעות 0.05% טריפסין / EDTA וזרעי אותם בצפיפות של 1.2x10 ~ 4 לכל גם במדיום fibroblasts הצמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת להחליף את התקשורת עם הס התקשורת (DMEM/F12, 20% סרום נוק תחליף, לא חיוניות חומצות אמינו, penicillin / סטרפטומיצין, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, 0.1 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, 20 ng / ml הצמיחה הבסיסי פיברובלסטים פקטור (bFGF), השלימו עם בוטיראט 0.5 מ&quot;מ נתרן ל -7 הימים הראשונים של תכנות מחדש. לשנות את התקשורת מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקוב אחר שינויים מורפולוגיים בתאים transduced מדי יום. מושבות של הירכיים דמויי תאים יתחיל לצאת כ 5 - 10 ימים לאחר העברת fibroblasts transduced על גבי תאים מזין. המושבות hiPSC מוכנים לבודד כ 14 - 28 ימים לאחר ציפוי אותם על התאים מזין MEF. </li></ol> 3. הבידוד של hiPSC המושבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני בחירת המושבות hiPSC להכין 24 גם צלחות עם γ-מוקרן מזין תאים MEF (~ 4 4x10 תאים בכל טוב) במצע גידול fibroblasts. בשלב זה מושבות hiPSC יכול גם להעביר את התרבות מזין בחינם באמצעות Matrigel ובינוניים mTeSR1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני בידוד של מושבות hiPSC להכין צלחות MEF על ידי הסרת הגידול fibroblasts mediuמ &#39;ושטיפה MEFs עם PBS להסיר עקבות של FBS. לאחר מכן מוסיפים 0.5 מ&quot;ל הס בינוני (או mTeSR1 בינוני במקרה של בארות מצופה Matrigel) עם מעכב 10 מיקרומטר רוק Y27632 זה 7,8 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, להסיר את fibroblasts סביב המושבות hiPSC עם מחט 21 מד תחת מיקרוסקופ רכוב בשכונה למינרית הזרימה (איור 2 א - ג). יש לשטוף את הצלחות עם PBS ולהוסיף טריים התקשורת הס המכיל נוגדנים ספציפיים Tra-1-81 StainAlive (1:200, Stemgent). אחרי 30 דקות., החלף מדיה המכילה את הנוגדן עם טריים התקשורת הס השלימו עם מעכב רוק 10 מיקרומטר. לבחון את הצלחות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומארק Tra-1-81 מושבות חיוביים באמצעות סמן אובייקטיבי (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את Tra-1-81 מושבות hiPSC חיוביים תחת המיקרוסקופ של מכסה המנוע למינרית, לחתיכות קטנות כמה באמצעות מחט מד 21 כפי שמוצג באיור 2E ופ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש אוטומטי פיפטה (P200) שברי העברה של מושבות hiPSC אל תעשבארות ividual של צלחת 24 גם עם MEFs או Matrigel. למנוע העברת שאינם הירכיים תאים. מניחים את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור ולאפשר המושבות hiPSC לצרף עבור 24-36 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי הס או mTeSR1 (על מושבות על מצע של Matrigel) התקשורת מדי יום. המושבות hiPSC עם מורפולוגיה הס דמוי נכונה ניתן יהיה לראות 48 שעות לאחר ההעברה הראשונית לצלחת של 24 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר ידני hiPSC מושבות כל 6 - 8 ימים על גבי 12-היטב ולאחר מכן על צלחת 6 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרחבת משובט והקמת קווי hiPSC, לנתח ביטוי של סמנים pluripotency tra-1-60, SSEA-4, Oct3 / 4, ו Sox2 Nanog באמצעות immunocytochemistry כפי שמוצג באיור 3. להעריך את תקינות הגנומי ובפוטנציאל בידול של קווי להשיג באמצעות קריוטיפ היווצרות תפלצת רוחנית ניתוח 6,9. </li></ol> 4. נציג תוצאות התמרה יעיל עם רטרווירוס המכיל התקשורת אניזה קריטי עבור תכנות מחדש מוצלחת. מומלץ לבצע את ההליך כולו transfection / זיהום באמצעות GFP להביע וירוס בכל ניסוי תכנות מחדש אחת כדי לפקח על יעילות כפי שמוצג באיור 1. כייל של וירוס ה-GFP להביע נקבע, כמתואר 10, דרך התמרה של fibroblasts האדם באמצעות המדיה שאינם מרוכזים ויראלי היה בדרך כלל בטווח של 0.5-5 x 10 -7 חלקיקים נגיפיים לכל מ&quot;ל (סמנכ&quot;ל / ml). Fibroblasts לשנות את המורפולוגיה כבר 2 ימים לאחר ההדבקה האחרון. Fibroblasts אדם Trypsinized יש לספור היטב לפני זריעת אותם על התאים מזין MEF. מומלץ לתאי זרע לאחר 3 צפיפויות שונות (6x10 3, 1.2x10 4, 2.5x10 4 לכל אחד גם צלחת גם 6) מאז כל שורה תא מדגים מאפיין צמיחה שונה וצפיפות זריעת הוא קריטי ליעילות של תכנות מחדש. סודיום בוטיראט המשמשראשוני 7 - 14 ימים של תכנות מחדש מגביר את היעילות של היווצרות hiPSC כ 5 פי. לעתים קרובות, במיוחד כאשר fibroblasts נגועים היו זרע בצפיפות גבוהה יותר, דמויי תאים פיברובלסטים יכול לגדול יותר מאכל תרבות לכסות מושבות hiPSC כפי שמוצג באיור 2 א. במקרה זה, שכבת פיברובלסטים ניתן הרים בזהירות להסיר לחשוף מושבות hiPSC (איור 2 ב). לאחר מכן, מושבות hiPSC יש לשטוף עם הס מדיה מוכתם נוגדנים Tra-1-81. בהתאם תאים פיברובלסטים, כ 20 - 40% של מושבות מפגינים עם מורפולוגיה iPSC כמו לא ללכלך עם נוגדנים Tra-1-81. מושבות hiPSC המזוהים ניתן להעביר מהצלחת בתוך 12 הבא - 24 שעות. דגירה ממושכת תגרום הבחנה מהירה של hiPSCs. מושבות ניתן passaged באופן ידני על גם בתאי מזין MEF או Matrigel מצופים צלחות. לאחר ההרחבה הוקמה שיבוטים hiPSC יש לבדוק באמצעות immunocytochemistry (ICC) לביטוי של pluripotenסי סמנים כמו הדגים באיור 3. בנוסף, אפיון מולקולארי מפורט של קווי שב&quot;ס שנוצר התא צריכה לכלול: ניתוח ביטוי גנים pluripotency באמצעות RT-PCR, הפגנה של demethylation DNA על היזמים של גנים וניתוחים pluripotency של transgenes להשתקת 9. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3416/3416fig1.jpg" /> באיור 1. היעילות של התמרה ויראלית נקבע באמצעות רטרווירוס GFP להביע. (א, ב) fibroblasts בוגרים האדם הנגזרות של המטופל Friedreich אטקסיה (GM03665, Coriell Repository) היו דמיינו אחרי שתי דלקות רצופות עם התקשורת GFP retroviral. (C, D) fibroblasts אדם נדבקו אצווה זהה של התקשורת GFP retroviral ואחריו צנטריפוגה של תאים ישירות על 6 צלחות גם עבור 1h ב 1600g. תמונות נתפסו 48h לאחר ההדבקה. <img alt= &quot;איור 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3416/3416fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2. זיהוי ובידוד של מושבות hiPSC. (א) בניגוד שלב תמונה של צלחת המכילה hiPSCs מוקפים fibroblasts. התאים היו בתרבית במשך 21 ימים על הס התקשורת. (B, C) המושבה hiPSC אותו לאחר הסרת שכבת פיברובלסטים שמסביב. (ד) מושבות hiPSC לתכנות מחדש כראוי מזוהים מכתים חי עם נוגדנים Tra-1-81 פני דה מרקר, לחתוך באמצעות מחט סטרילית (E, F) והועברו בארות נפרדות של צלחת של 24 באר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3416/3416fig3.jpg" /> איור 3. הביטוי של סמנים ספציפיים pluripotency Oct3 / 4, Nanog, Sox2, SSEA4 ו Tra-1-60 hiPSCs נקבע על ידי immunocytochemistry.

<ol>
	<li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes.">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28, 713-720 (2011).</li><li>Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state.">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li><li>Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., Pyle, A. D., Tchieu, J., Sridharan, R., Clark, A. T., Plath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts.">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li><li>Dick, E., Matsa, E., Bispham, J., Reza, M., Guglieri, M., Staniforth, A., Watson, S., Kumari, R., Lochmuller, H., Young, L., Darling, D., Denning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+protocols+to+enhance+the+production+and+isolation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell+lines.">Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Res. 6, 158-167 (2011).</li><li>Ku, S., Soragni, E., Campau, E., Thomas, E. A., Altun, G., Laurent, L. C., Loring, J. F., Napierala, M., Gottesfeld, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friedreich's+ataxia+induced+pluripotent+stem+cells+model+intergenerational+GAATTC+triplet+repeat+instability.">Friedreich's ataxia induced pluripotent stem cells model intergenerational GAATTC triplet repeat instability.</a> Cell Stem Cell. 7, 631-637 (2010).</li><li>Emre, N., Vidal, J. G., Elia, J., O'Connor, E. D., Paramban, R. I., Hefferan, M. P., Navarro, R., Goldberg, D. S., Varki, N. M., Marsala, M., Carson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS One. 5, e12148-e12148 (2011).</li><li>Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Maherali, N., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li><li>Yu, J., Thomson, J. A., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derivation.">Induced Pluripotent Stem Cell Derivation.</a> Essentials of Stem Cell Biology. , 331-337 (2009).</li><li>Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Woltjen, K., Michael, I. P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hamalainen, R., Cowling, R., Wang, W., Liu, P., Gertsenstein, M., Kaji, K., Sung, H. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li><li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li><li>Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A., Daley, G. Q., Brack, A. S., Collins, J. J., Cowan, C., Schlaeger, T. M., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA.">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li><li>Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li><li>Han, S. S., Williams, L. A., Eggan, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+and+deconstructing+stem+cell+models+of+neurological+disease.">Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease.</a> Neuron. 70, 626-644 (2011).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

לימוד מחלות אנושיות, נוירולוגיות ניווניות במיוחד, כבר מאתגר במיוחד בשל חוסר נגישות של מודלים מתאימים הסלולר אדם. היכולת לתכנת מחדש תאים סומטיים להשגה בקלות לתוך המושרה בתאי גזע pluripotent ואת הפוטנציאל להבדיל אותם סוגי תאים שונים נפתחה האפשרות ליצור דגמים סלולריים של מחלות גנטיות. בנוסף, iPSCs לקיים הבטחה גדולה לעתיד של רפואה רגנרטיבית. לכן, חשוב לפתח שיטות אופטימיזציה אמין, יעיל ובטוח של תכנות מחדש תאים סומטיים כדי pluripotency. מנקודת המבט של יישומים רפואיים, חשוב לפתח גישות בטוחות של הדור iPSC חסר טביעת רגל מוטציות בגנום המארח. שיטות של תא סומטי תכנות מחדש ללא החדרת שינויים קבועים לתוך הגנום של תאים לתכנות מחדש כמו transfection של וקטורים episomal, שימוש excisable transposons, זיהום adenoviral, ואספקה ​​ישירה של ה-mRNA או חלבונים כבר הוקמו 11-15. עד כה את היעילות באמצעות תכנות מחדש את transgene ללא שיטות נמוך תלוי בסוג אופי, גיל לתכנות מחדש תאים סומטיים. לפיכך, פרוטוקולים אלה אינם מתאימים תכנות מחדש מעבר מאוחר, בוגרים תאים סומטיים לעתים קרובות שהופקדו מאגרים סלולריים. בנוסף, כדי לאפשר אפיון מפורט של קווי iPSC מרובים ליצור מודלים חדשים של מחלות אנושיות ולנהל תפוקה גבוהה מסכי סמים, תכנות מחדש של תאים סומטיים באמצעות משלוח ויראלי של גורמי תעתוק היא אסטרטגיה מתאימה. נכון להיום יותר מ -20 מחקרים דיווחו על דור של המטופל הספציפי iPSCs למחלות מודל האדם נוירולוגיות neuromuscular. בכל המקרים אבל iPSCs היו שנוצר באמצעות התמרה lentiviral או retroviral 16. הנתונים שלנו מראים כי פרוטוקול פשוט המבוסס על המשלוח דואר retroviral של גורמי תעתוק OSKM ניתן להשתמש ביעילות לתכנת מחדש fibroblasts אדם בוגרים, אפילו מעבר גבוהה. כמות הנגיף המתקבל transfection אחת של תאים הפניקס על צלחת 10 ס&quot;מ מספיק עבור יותר מ -10 ניסויים תכנות מחדש. ישנם שלושה שלבים קריטיים פרוטוקול תכנות מחדש שלנו fibroblasts בוגרים: (i) התמרה ויראלית היעילה ביותר בהנחיית צעד נוסף במהלך צנטריפוגה התמרה אשר מגדיל באופן דרמטי את היעילות של התמרה, (ii) צפיפות זריעה של פיברובלסטים transduced על MEFs ו ( ג) שימוש מכתים חי עם הנוגדן Tra-1-81 הסמן כדי להקל על הבחירה של מושבות פוטנציאל לתכנות מחדש באופן מלא אשר ניתן להעביר ישירות מזין ללא תרבויות. יעילות של תכנות מחדש משופרת באופן משמעותי באמצעות סודיום בוטיראט במהלך השבוע השני של תכנות מחדש. יתר על כן, הבחנו כי חלק גדול יותר של המושבות iPSC בתרביתנוכחות של התרופה ניתן להרחיב והקים את קווי iPSC לתכנות מחדש באופן מלא.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330 </td></tr><tr><td> KSR </td><td> Invitrogen </td><td> 10828 </td></tr><tr><td> שאינם חיוניים aminoacids </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> סודיום בוטיראט </td><td> סיגמא </td><td> B5887 </td></tr><tr><td> Y27632 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0012 </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Stemgent </td><td> 03-0002 </td></tr><tr><td> Tra-1-81 נוגדן </td><td> Stemgent </td><td> 09-0069 </td></tr><tr><td> Oct3 / 4 נוגדן </td><td> סנטה קרוז </td><td> SC-8628 </td></tr><tr><td> Nanog נוגדן </td><td> התא איתות טכנולוגיה </td><td> 4903S &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Tra-1-60 נוגדן </td><td> Millipore </td><td> MAB4360 </td></tr><tr><td> Sox2 נוגדן </td><td> התא איתות טכנולוגיה </td><td> 3579S </td></tr><tr><td> SSEA4 </td><td> Millipore </td><td> MAB4304 </td></tr><tr><td> CF1 MEFs </td><td> Globalstem </td><td> GSC-6201G </td></tr><tr><td> המטרה סמן </td><td> ניקון </td><td> MBW10010 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354277 </td></tr><tr><td> mTeSR1 </td><td> StemCell טכנולוגיות </td><td> 05850 </td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> סיגמא </td><td> M7522 </td></tr><tr><td> Fugene 6 </td><td> רוש </td><td> 11814443001 </td></tr><tr><td> polybrene </td><td> סיגמא </td><td> H9268 </td></tr><tr><td> סמן אובייקט </td><td> ניקון </td><td> MBW10010 </td></tr></tbody></table>

selecting and isolating colonies of human induced pluripotent stem cells reprogrammed from adult fibroblasts

במסמך זה אנו מציגים פרוטוקול של תכנות מחדש fibroblasts בוגרים האדם אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) בנוכחות סודיום בוטיראט 1-3. השתמשנו בשיטה זו כדי לתכנת מחדש את המעבר מאוחר (&gt; P10) fibroblasts בוגרים האדם הנגזרות של המטופל Friedreich אטקסיה (GM03665, Coriell Repository). הגישה תכנות מחדש כולל פרוטוקול התמרה היעילה ביותר באמצעות צנטריפוגה חוזרת של fibroblasts בנוכחות המכילים וירוסים התקשורת. המושבות hiPSC לתכנות מחדש זוהו באמצעות immunostaining חי עבור Tra-1-81, סמן פני השטח של תאים pluripotent, מופרד fibroblasts לא לתכנות מחדש ו passaged ידני 4,5. HiPSC אלה הועברו לאחר מכן צלחות Matrigel וגדלה במזין נטולי תנאים, ישירות מהצלחת תכנות מחדש. החל מ במעבר 1, מושבות hiPSC להפגין מאפיין הס-lאייק המורפולוגיה. שימוש בפרוטוקול זה יותר מ 70% של מושבות שנבחרו ניתן להרחיב בהצלחה והקים את שורות תאים. הקווים hiPSC שהוקמו מוצג סמנים אופייניים pluripotency כולל סמנים פני השטח tra-1-60 ו SSEA-4, כמו גם סמנים גרעיני Oct3 / 4, ו Sox2 Nanog. הפרוטוקול המובא כאן הוקם ונבדק באמצעות fibroblasts בוגרים שהתקבלו מחולים אטקסיה של Friedreich ויחידים בקרת 6, fibroblasts אדם שזה עתה נולדו, כמו גם קרטינוציטים אדם.

Watch this Scientific Journal Video about Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts at JoVE.com

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

אנו מציגים פרוטוקול תכנות מחדש יעיל של האדם התאים הסומטיים אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) וזיהוי של hiPSC לתכנות מחדש בצורה נכונה על ידי צביעה חיה עם Tra למוצרי 1-81 נוגדנים.

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

selecting-isolating-colonies-human-induced-pluripotent-stem-cells

Google

Research

JoVE Journal

Biology

19.8K Views.  University of Texas M.D. Anderson Cancer Center. אנו מציגים פרוטוקול תכנות מחדש יעיל של האדם התאים הסומטיים אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) וזיהוי של hiPSC לתכנות מחדש בצורה נכונה על ידי צביעה חיה עם Tra למוצרי 1-81 נוגדנים.

Video: Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts האדם עם Lentivirus Stemgent TF האדם הגדר

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

שימוש בביופסיות עור ליצירת פודוציטים שמקורם במטופל

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the glomerulus. Mutations in podocyte-specific genes can cause focal segmental glomerulosclerosis (FSGS), and podocytes are also affected in many other primary and secondary nephropathies. Due to their differentiated nature, primary cell culture models are limited for podocytes.&#160;Therefore, commonly conditionally immortalized cells are used. However, these conditionally immortalized podocytes (ciPodocytes) have several limitations: the cells can dedifferentiate in culture, especially when they reach confluency, and several podocyte-specific markers are either only slightly or not expressed at all. This brings the use of ciPodocytes and their applicability for physiological, pathophysiological, and clinical reach into question. Here, we describe a protocol for the generation of human podocytes-including patient-specific podocytes-from a skin punch biopsy by episomal reprogramming of dermal fibroblasts into hiPSCs and subsequent differentiation into podocytes. These podocytes resemble in vivo podocytes much better in terms of morphological characteristics, like the development of foot processes and the expression of the podocyte-specific marker. Finally, yet importantly, these cells maintain patients&#39; mutations, resulting in an improved ex vivo model to study podocyte diseases and potential therapeutic substances in an individualized approach.

מחבר זרקור: יצירת פודוציטים שמקורם במטופל מביופסיות עור  

This manuscript describes a two-step protocol to generate patient-specific podocytes from dermal fibroblasts via episomal reprogramming into human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and subsequent differentiation into podocytes.

יצירת פודוציטים שמקורם במטופל מביופסיות עור

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...