ברצוננו להכיר את FACS הרחב תאי גזע מרכז המחקר ומודה במיוחד לג&#39;סיקה סקולס ופליציה Codrea על עזר במיון תא. העבודה מומנה על ידי CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, אגודה אמריקנית בית חזה / COPD קרן ATS-06-065, קרן הדאגה, נבג Jonsson UCLA המקיף במרכז סרטן חזה אונקולוגיה תכנית / סרטן הריאות, הסרטן של אוניברסיטת קליפורניה מחקר ועדת תיאום וGwynne הייזן דובדבן זכרון המעבדות (BG).

קווי מתאר של צעדים 1. נתיחה של קנה נשימה 2. ניקוי קנה נשימה וחותך אותו 3. אנזים עיכול ועיבוד לתוך השעית תא בודדה 4. הכתמה לFACS ומיון 5. עיבוד תאים ממוינים לin vivo ו במודלים חוץ גופייה 1. נתיחה של קנה נשימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם זריקת intraperitoneal של 0.1 mg/0.2 סמ&quot;ק של פנטוברביטל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור לפתוח את דופן הבטן, ולהעביר את המעיים לצד לחשוף את אב העורקים בבטן ולאחר מכן לנתח את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את החזה על ידי חיתוך דרך הסרעפת ובית חזה קדמי בשני הצדדים כדי לחשוף את הלב וריאות. תמשיך לחתוך לתוך צוואר הסרת בלוטות שומן ורוק לחשוף את קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התימוס ולחתוך את הריאות מהחיבורים שלו מתחת ומאחורי. Separאכלתי את קנה הנשימה מהוושט על ידי החדרתו מלקחיים ביניהם ואז לחתוך את קנה הנשימה בחלק העליון ביותר שלה מעל החיבור שלה עם הגרון. לאחר מכן החזק את קנה הנשימה עם מלקחיים ולנתח את זה מהדבקות וממשיך כלפי מטה כדי להסיר אותו עם הלב וריאות en-בלוק. לחתוך את הלב וריאות בסמוך לhilum לכלול את רוב הסמפונות העיקרית ימין ושמאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קנה הנשימה בצלחת פטרי קטנה המכילה איסוף בינוני על קרח. </li></ol> 2. ניקוי קנה נשימה וחיתוך זה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במלקחיים עדינים מאוד (נקודת מס &#39;5) ומספרי טובינגן Vannas (15003-08 finescience.com FST) כדי לנקות את קנה נשימה מכל הרקמות האחרות שמחוברות אליו. זה כולל: בלוטות הלימפה, עצב בגרון חוזר ונשנה, שומן, בלוטת תריס וכלי ריאה נותרת. חלק העליון של קנה הנשימה זקוק לתשומת לב מיוחדת, כדי להסיר את סחוסי הגרון הגדולים מבלי להתפשר על החבורה הגדולה של SMGשנטוע בין סחוס cricoid והצלצול הראשון קנה נשימת הסחוסים (C1) 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את קנה הנשימה בחלק העליון וחלק התחתון בין C4 וC5 ולאחר מכן לחתוך את שני חלקים פתוחים בלום של קנה הנשימה. </li></ol> 3. אנזים עיכול ועיבוד להשעית תא בודדה (SCS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את החלק התחתון של קנה הנשימה ב1 מ&quot;ל של dispase 16 U בצינור אפנדורף בטמפרטורת חדר (RT) למשך 30 דקות, כפי שתוארו בעבר 5. ואז להוסיף 0.5 מיליליטר DNase אני בDMEM מ&quot;ג / ל20 דקות נוספות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מעוכלת אל קנה הנשימה בינונית איסוף טרי בצלחת פטרי סטרילית, ולהפשיט אפיתל המשטח תחת מיקרוסקופ לנתח. השתמש פיפטה להעביר במדיום המכיל אפיתל הופשט לצינור 50 מיליליטר חרוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה אפיתל הופשט ב1000 XG ב 4 ° C. הסר את supernatant, ולהוסיף 0.1% טריפסין / EDTA ולדגור בעוד רועד הצינור בדואר 37 מעלות צלזיוס חממה רועדת (200 סל&quot;ד) למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, באמצעות קצה μl 1000, פיפטה מעלה ומטה כדי לשבור את הגושים ויוצר השעית תא בודדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קנה הנשימה העליון בצינור חרוטים המכיל 1 מ&quot;ל של pronase 0.15%. אז לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בעדינות את הצינור, ואז למקם את קנה הנשימה למדיום איסוף טרי ולאשר תחת מיקרוסקופ לנתח שיש ניתוק מוחלט של אפיתל פני השטח (SE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברר בקנה הנשימה עם מספריים מצוינים לפתוח את מדורי SMG ואז דגירה במשך שעה אחת נוספת בpronase בRT עם רעד בגוף איטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספין למטה רקמות קנו נשימה, הסר pronase, מוסיף 0.1% טריפסין / EDTA ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם הרעד כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר תאים מתעכלים, גושים וכל נתחים נותרים של בלוטות באמצעות 20G, 23 ז ו26G מחטים באמצעות מזרק מ&quot;ל 10. חזור מספר פעמי passaging עם כל גודל מחט לפניהתפטרותו. עכשיו, רוב התאים צריכים להיות בSCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה דרך מסננת מיקרומטר 40 לאחר מכן לשטוף את המסננת וספין למטה התאים. ואז לחדש את התאים בנפח המתאים של מדיום, ספירת התאים ולפנות מייד לFACS מכתים ומיון. אל תשאיר את תאים ב4 מעלות צלזיוס או על קרח לכמה שעות כי מצאו כי זה משפיע על הכדאיות וקשה מפחית את הכדור ויצר את היעילות. </li></ol> 4. הכתמה לFACS ומיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח מספיק תאים להכנת צינורות הפיצויים המוכתמים בתוליים ואחת אז כתם שאר תאים עם נוגדנים ראשוניים, Trop2 עיזים וחולדות ITGA6, במשך 15 דקות בRT. לאחר מכן לשטוף עם PBS או איסוף בינוני, המסיר supernatant מאוד בזהירות ולשבור את התא הגלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם עם הנוגדן המשני המתאים, דגירה בחושך בRT למשך 10 דקות, לשטוף ולהסיר את supernatant ולאחר מכן לשבור את הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על FACSARIA, לאחר התאמת המתח והפיצוי, שערכם את הפסולת, התאים קטנים מאוד, כפילויות סלולריות ותאים מתים. ואז, רוב התאים מSE צריכים להיות TROP2 חיוביים תוך 20-50% מתאי SMG יהיו TROP2 + 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע שער מיונך לTrop2 + ITGA6 + תאים מSE (תאי בסיס) ולTrop2 + תאים (+ /-ITGA6 תאים חיוביים) מSMG (תאי צינור). </li></ol> 5. עיבוד תאים למיון: בתרבות מבחנה בדגם vivo 5.1 בתחום המבחנה להרכיב 5-9 תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב 100 μl של &quot;גורם גדילה מופחתת Matrigel&quot; עם 100 μl של מדיום שלם 10,11 (ראה טבלה 1) המכיל עד 50,000 תאים ממוינים ואז לשים את התערובת בחדר העליון של טרנס גם 24 גם. ואז לשים 400 μl של מדיום מלא בחדר תחתון ולדגור על 37 ° C. שינוי הבינוני בחדר תחתון בכל יום אחר ולהוסיף 100 μl הנוסף של Matrigelכל שבוע או מוקדם יותר, אם זה הופך להיות רזה. </li></ol> 5.2 במודל vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקם את התא מסודר בגלולה בינונית מלאה מעורבב עם 01:01 matrigel בריכוז של 5,000-10,000 תאים לכל 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם את C57/BL6 עכברי נמען. לנהל carprofen (5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) subcutaenously כמשכך כאבים. לעקר ולגלח את גבם לאחר מכן לבצע חתך בעור אורך מרכזי בגב העליון. החתך צריך להיות גדול מספיק כדי לזהות את אתר שומן משטח ההזרקה כמו גם בועה שיוצרת לאחר הזרקה. השתמש בצד הקהה של המספריים להרחיב שקיות בין העור והאחורי של קיר בית החזה בשני הצדדים על מנת למקסם את הגישה וויזואליזציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הגבול המדיאלי של השכמה על ידי דחיפת forelimb העכבר למעלה ואחורה כדי לראות מרגש שכמה. קח 50 μl של השעית התא לתוך מזרק אינסולין BD μl 300 ולהזריק אותו בכרית השומן פשוט המדיאלי לעצם השכם ורוחב כדיהחוליות. אתה אמור להיות מסוגל לראות בועה אחרת אתה הוא עמוק מדי. חזור על אותו הדבר בצד אז קליפ או לתפור חתך בעור השני. בדקו עכברים ולתת carprofen (5 מ&quot;ג / ק&quot;ג, SC) פעם ביום למשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 שבועות, להרדים עכברים עם pentobarbatol (0.1 mg/0.2 סמ&quot;ק, ה-IP), לפתוח את העור כאמור לעיל ולנתח את כרית השומן השלמה משני הצדדים עם מרווח ביטחון כדי למנוע חסרים כל מבנה רקמות שיכולים להיוצר והוארך בסביבה. התקן בPFA ולהטביע בפרפין 12. זהירות רבה צריכה להיות מועסקת בזמירה וחיתוך הבלוק לא לעקוף או להתעלם מבנה. התרגול הטוב ביותר הוא לקצץ 40 מיקרומטר פעם אחת ואז לחתוך פרוסת 4 מיקרומטר, הנח אותו על משטח זכוכית ולבחון אותו במיקרוסקופ כדי לאשר אם יש &quot;מבני אפיתל&quot; בחלק זה של הגוש או לא. אם אין שום דבר לראות, ולאחר מכן לקצץ פעם נוספת ולחזור על שלב זה. </li></ol> 6. נציג תוצאות Stripping קנה נשימה של העכבר יגרום לקנה נשימת נכרתים כי הוא גלוי במיקרוסקופ אור, כפי שמוצג באיור 1 א. 1B האיור מציג את נוף brightfield של קנה נשימה לאחר שבזז אפיתל בבלוטות submucosal ששוחררו מהרקמות והאשכולות דומים של ענבים. Pronase מסיר epitope ITGA6 וזו הסיבה שלא ניתן להפריד את תאי TROP2 הצינור לתוך ITGA6 + ו - אוכלוסיות. עם זאת, dispase, המשמר את ITGA6 epitope, מעכל את כל פני שטח האפיתל ותאי הצינור אפילו עם זמני דגירה קצרים מאוד, ולכן לא ניתן להשתמש בו כדי להפריד בין צינור מתאי בסיס, 3. cytometry הזרימה של השעיות התא הבודדות צריך להראות קדימה חלקות פיזור פיזור וצד שמיוצגות באיור 2 א. הפרדה טובה של תאי צינור משאר אם תאי קנה הנשימה יש לראות עם נוגדן Trop2 cytometry זרימה לתא sorti פעיל ניאוןng (FACS) כפי שניתן לראות באיור 2B. Spheres צריך להיות גלוי בmatrigel לאחר כ 1 שבוע בתרבות ובצפוף במראה כפי שמוצג באיור 3. היעילות של התהליך הזה היא בסדר הגודל של 1-2% ותאים בודדים עדיין תהיה נוכח בmatrigel ועשוי לייצג תאים מצינוריות בלוטת submucosal שאין להן את יכולת התחדשות עצמית. הזרקה של תאי גזע לתוך צינור את תוצאות כרית שומן העכבר בהיווצרות של מבני submucosal בלוטה דמוית שמוצגים איור 4. אלה ראו בבלוקים גם ללא צביעת H &amp; E. אלה הם כדוריים ובעלי לום מרכזי. חתכים רבים צריכות להתבצע באמצעות כרית השומן על מנת שלא לפספס את מבני אפיתל אלה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig1.jpg" /> איור 1. עיכול אנזימתי של האפיתל של קנה נשימה. הסרת תאי אפיתל פני שטח נראית עם blacחיצי k, הסרת תאים בצינוריות בלוטת submucosal מוצגים עם חיצים ירוקים. קנה נשימה ערומה הנראות על ידי מיקרוסקופ אור מוצגת לאחר 30 דקות של עיכול dispase ואחרי 4 שעות של עיכול pronase. <img alt="איור 2 א" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2A.jpg" /> איור 2 א. אני. cytometry זרימה של השעיות התא הבודדות המראות פיזור קדימה מייצג וחלקות פיזור לוואי מהעכבר קנה נשימה לאחר משטח האפיתל ההפשטה. ii. חלקות FACS נציג לTROP2 ביטוי בתאי צינור קנה נשימה מעכבר. <img alt="התרשים 2B" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2B.jpg" /> 2B איור.. cytometry זרימה של השעיות תא הבודדות ממשטח אפיתל הופשט משני השליש התחתון של עכבר קנה הנשימה מראה פיזור קדימה מייצג וחלקות פיזור לוואי. ii. עלילת FACS אופייני ITGA6 ביטוי בsurface האפיתל. ג. עוד עלילת FACS נציג של קדימה ופיזור מצד אפיתל פני שטח מראה האחורי gating של אוכלוסיית תאי הבסיס בירוק. ד. ITGA6 טיפוסי וTROP2 להביע אוכלוסיית תא בירוק. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig3.jpg" /> איור 3. כמובן זמן פיתוח של תחומים. תחומי Duct א. Spheres צריך להיות גלוי בmatrigel לאחר כ 1 שבוע בתרבות וכמעט כולם צפופים במראה. תאים בודדים שאינו מהווים תחומים גם ראו. (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). תחומים בסיסיים B. הם גדולים יותר וluminal בהופעה. תאים בודדים שאינו מהווים תחומים גם ראו. (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig4.jpg" /> איור 4. הזרקה של תאי גזע לתוך צינור את תוצאות כרית שומן העכבר בהיווצרות של מבני submucosal בלוטה דמוית. מבנים מייצגיםמוצגים בכרית השומן וחלקם הראה הפקת mucin (כחול בהיר) עם שיף החומצה Alcian הכחול התקופתי הכתם.

<ol>
	<li>Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+functions+of+the+airway+epithelium.">Innate immune functions of the airway epithelium.</a> Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).</li><li>Finkbeiner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathology+of+tracheobronchial+glands.">Physiology and pathology of tracheobronchial glands.</a> Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).</li><li>Hegab, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Stem/Progenitor+Cell+Population+from+Murine+Tracheal+Submucosal+Gland+Ducts+with+Multipotent+Regenerative+Potential.">A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential.</a> Stem Cells. , (2011).</li><li>Jeffery, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+features+of+airway+surface+epithelial+cells+and+glands.">Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).</li><li>Rock, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).</li><li>Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trop2+identifies+a+subpopulation+of+murine+and+human+prostate+basal+cells+with+stem+cell+characteristics.">Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+an+epithelial+stem/progenitor+cell+hierarchy+in+the+adult+mouse+lung.">Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).</li><li>Inayama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+growth+and+differentiation+of+clones+of+tracheal+basal+cells.">In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells.</a> Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).</li><li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells:+selection+of+a+proliferative+population.">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).</li><li>Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Bronchial+Epithelial+Cells+Differentiate+to+3D+Glandular+Acini+on+Basement+Membrane+Matrix.">Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).</li><li>Ooi, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+putative+tumor-initiating+progenitor+cell+population+predicts+poor+prognosis+in+smokers+with+non-small+cell+lung+cancer.">Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer.</a> Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

טכניקה זו לבודד תאים הבזליים מצינור ודרכי הנשימה היא חשובה לשיפור ההבנה של דרך נשימת תיקון והתחדשות ומחלות של דרך נשימה שלנו. הטכניקות המתוארות כאן כוללות כמה שלבים קריטיים. הראשון הוא תקופת העיכול אנזימטי האופטימלית. השני הוא היצירה של השעית תא בודדה דרך סידורי passag...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> השלם בינוני 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td></tr><tr><td> Hepes (15 מ&quot;מ) </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט (3.6mm או 0.03%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין (4 מ&quot;מ) </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-Cl </td></tr><tr><td> פניצילין (100 U / ml) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ &#39;) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> Amphotericin B (0.25 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> Lonza </td><td> 17-836R </td></tr><tr><td> בתוךsulin (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> סיגמא </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Transferrin (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> סיגמא </td><td> T1147 </td></tr><tr><td> רעלן הכולרה (0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> סיגמא </td><td> C8052 </td></tr><tr><td> עוריות Growth Factor (25 ng / ml) </td><td> BD </td><td> 354001 </td></tr><tr><td> תמצית יותרת מוח שור (30 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> Invitrogen </td><td> 13028-014 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי (5%) </td><td> דיג </td><td> SH3008803HI </td></tr><tr><td> חומצה רטינואית (0.05 מיקרומטר) </td><td> סיגמא </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> גורם גדילה מופחתת Matrigel </td><td> BD </td><td> 354230 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. השלם רכיבי תקשורת. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td&gt; <td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> רוש </td><td> 10165921001 </td><td> השתמש ב 0.15%: -O / n ב 4 ° C עיכול לבודד תאי קנה נשימה של כלל (לתרבות ALI) עיכול -4 שעות 4 ° C כדי לבודד SMG </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> השתמש ב 16 יחידות: 30 דקות ב RT </td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> סיגמא </td><td> DN25 </td><td> השתמש ב 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל: 20-30 דקות ב RT </td></tr></tbody></table> טבלה 2. אנזימים המשמשים לעיכול האנזימטית של קנה הנשימה.

isolation of basal cells and submucosal gland duct cells from mouse trachea

דרכי האוויר הגדולות הן ישירות במגע עם הסביבה ולכן רגישות לפגיעה מרעלים וחומרים מזהמים שאנו נושמים ב1. דרכי האוויר הגדולות ולכן דורשות מנגנון תיקון יעיל כדי להגן על גופנו. תהליך תיקון זה מתרחש מתאי גזע בדרכי אוויר ובידוד תאי גזע מדרך הנשימה הוא חשוב להבנת המנגנונים של תיקון והתחדשות. זה גם חשוב להבנת תיקון חריג שעלול להוביל למחלות דרך נשימת 2. המטרה של שיטה זו היא לבודד את אוכלוסיית תאי גזע רומן מצינוריות בלוטת submucosal קנה הנשימה של העכבר ולמקם את התאים האלה במבחנה במערכות מודל vivo לזהות את המנגנונים של תיקון והתחדשות של בלוטות submucosal 3. ייצור זה מציג שיטות שיכולות לשמש לבידוד ובדיקת תאי הגזע הדביקים ובסיסיים מ3 דרכי האוויר הגדולות. זה יאפשר לנוללמוד מחלות של דרך הנשימה, כגון סיסטיק פיברוזיס, אסתמה ומחלת ריאות חסימתית כרונית. נכון לעכשיו, אין שיטות לבידוד של תאי צינור בלוטה submucosal ואין במודלי vivo ללמוד התחדשות של בלוטות submucosal.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea at JoVE.com

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

כאן אנו מראים הפרוטוקול שלנו לבידוד של תאי צינור בלוטה הבזליים וקנה נשימת submucosal מעכבר. גם אנחנו מדגימים את השיטה של ​​הזרקת תאי גזע לכרית השומן הגבה עכבר כדי ליצור<em&gt; In vivo</em&gt; מודל של התחדשות הבלוטה submucosal.

בידוד של תאי בסיס ותאי בלוטת Duct Submucosal מעכבר קנה נשימה

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

isolation-basal-cells-submucosal-gland-duct-cells-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Views.  David Geffen School of Medicine at UCLA. כאן אנו מראים הפרוטוקול שלנו לבידוד של תאי צינור בלוטה הבזליים וקנה נשימת submucosal מעכבר. גם אנחנו מדגימים את השיטה של ​​הזרקת תאי גזע לכרית השומן הגבה עכבר כדי ליצור In vivo מודל של התחדשות הבלוטה submucosal.

Video: Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

בידוד של תאים מסוג CD4 + T מ בלוטות לימפה עכבר באמצעות טיהור Miltenyi MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

בידוד של בלוטת הרוק עכבר תאים גזע

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

בידוד והתרבות של תאים מאזור nephrogenic של הכליה עכבר עובריים

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...