בידוד של תאים מיואפיתל מתוך למבוגרים מורנה לקטמל בלוטות הלסת

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מאפשר הפרדה ובידוד של שני קווי תאי שריר חלקים, תאי myoepithelial ו pericytes. שיטה זו משלבת תיוג גנטי של תאי שריר חלקים באמצעות סמני פני תאים לטיהור אוכלוסיות של תאי מיופיתל ופוריציטים. פרוטוקול זה מאפשר להשוות את הפונקציה ואת יכולות ההתחדשות של תאים מיופיתאליים בריאים וחלו ועיבוד תאים אלה למחקרים ביטוי גנים.

תאים myoepithelial קיימים בבלוטות אקסוקריניות אחרות כגון החלב, הרוק, הלבלב, אשר מאפשר פרוטוקול זה להיות מותאם על ידי בידוד של תאים myoepithelial ו pericytes מכל רקמה אחרת. כדי לתייג את אלפא חלקה שריר actin או SMA הבעת תאים, להזריק שלושה עד ארבעה שבועות בן אלפא SMA מונחה אלפא עכברים כתב עם 100 microliters של טמוקסיפן לכל 20 גרם של משקל גוף intraperitoneally פעם ביום במשך יומיים. עבור איסוף בלוטת lacrymal, יומיים עד שלושה ימים לאחר הזריקה האחרונה, להשתמש פינצטה בעדינות למשוך בלוטה אחת בעת ובעונה אחת מגרד את רקמת החיבור סביב הבלוטה עם קצה חד של זוג מספריים קטנים כדי לשחרר את הבלוטה.

כאשר בלוטות lacrymal ו parotid הופרדו, להשתמש במספריים כדי לחתוך את בלוטת lacrymal החוצה ולמקום את הבלוטות לתוך צלחת 35 מילימטר עם שני מיליליטר של PBS קר על קרח. מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ ניתוח לקצץ כל שומן שמסביב רקמת חיבור. לאחר מכן להסיר את כמוסה בלוטת lacrymal עם שני מלקיחות.

כאשר כל הבלוטות נקצרו, לבדוק חתיכה קטנה של רקמה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר תיוג תאים. כדי להכין השעיה של תא יחיד, להעביר את כל בלוטות lacrymal לצלחת 35 מילימטר המכיל 0.5 מיליליטר של מדיום עיכול בטמפרטורת החדר ולהשתמש מספריים קטנים כדי לטחון את הבלוטות לתוך 0.2 לחתיכות מרובעות מיקרומטר אחד. באמצעות קצה מסנן פיפטה רחב נשא להעביר את הרקמה הטחון לתוך צינור עגול תחתון שני מיליליטר ולהביא את עוצמת הקול בצינור לשני מיליליטר עם מדיום העיכול.

להפוך את הצינור כדי לערבב, ולה מניחים את הצינור לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס רועד במשך 90 דקות ב 100 עד 120 סיבובים לדקה. כל 30 דקות לאט triturate חתיכות הבלוטה 20 עד 30 פעמים באמצעות 1000 טיפים מסנן microliter עם גודל משעמם פוחתת. בסוף כל טריטורציה, לבדוק aliquot 10 microliter תחת מיקרוסקופ עבור אשכולות.

לאחר 90 דקות להעביר את המדגם פעמיים עד שלוש פעמים דרך מחט מזרק אינסולין כדי לשחרר עוד יותר את התאים לתוך ההשעיה ולהעביר את פתרון התא לצינור 15 מיליליטר. הוסף חסימה סוג בינוני 1 לסך של חמישה מיליליטר ומערבבים את הצינור פעמיים עד שלוש פעמים על ידי היפוך. מעבירים את התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לצינור של 50 מיליליטר, ושוטפים את המסננת במיליליטר אחד של חסימת סוג בינוני 1, לפני שהם מסננים את התאים דרך המסנן פעם נוספת.

הבא לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולתלות את גלולה בשני מיליליטר של חסימת חסימת סוג בינוני 2. מעבירים את התאים לצינור מיקרוצנטריפוגה שני מיליליטר ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. תן את התאים במיליליטר אחד של פתרון Accutase עבור דגירה של שתיים עד שלוש דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 100 עד 120 סיבובים לדקה.

בסוף הדגירה, להעביר את התאים לצינור 50 מיליליטר ולהוסיף עד 10 מיליליטר של חסימת סוג בינוני 1. לאחר צנטריפוגה resuspend התאים בשישה מיליליטר של מדיום התאוששות עבור דגירה 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, בדוק דגימת 10 מיקרוליטר מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח דיסוציאציה מלאה של התאים.

לאחר הספירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. כדי להכתים את התאים עבור מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, או FACS, להוסיף עד חמש פעמים 10 לחמשת התאים לכל צינור מיליליטר המכיל 400 microliters של חיץ FACS ולהוסיף חמישה microliters של מבריק סגול 421 נגד עכבר CD326 ו 0.5 microliters של Ghost Red 780 צמיג יכולת היוויה. לאחר ערבוב יסודי, לעטוף את הצינורות עם נייר כסף עבור דגירה 45 דקות ב 4 מעלות צלזיוס עם סיבוב.

בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש את כדורי במיליליטר אחד של חיץ FACS לכל מדגם. העבר את דגימות התאים לצינורות FACS בודדים של חמישה מיליליטר על קרח והתאם את הפיצוי באמצעות פקדי צבע בודדים. ואז למיין את התאים ב 20 פאונד לאינץ ' מרובע דרך חריר 100 מיקרומטר.

כלי דם מיקרו-וסקולריים מתפתחים סביב קירות נימים ומדגימים צורה מרובעת. תאים myoepithelial להקיף את הפרשת lacrymal acini, יש תהליכים ארוכים, ולתפוס שטח גדול יחסית. כאן, תאים נותק מבלוטה lacrymal כהכנה למיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, כפי שהודגם רק, מוצגים.

עבור מיון ציטומטרי זרימה של תאים myoepithelial ו pericytes התאים צריכים להיות מגודרים תחילה על ידי אזורי פיזור קדימה וצד שלהם לפני לא כולל כל כפילים. לאחר gating כדי לא לכלול את התאים המתים, דגימות בקרה משמשים כדי לקבוע את רעש הרקע כדי ליצור פיצוי הולם עבור הפרדה אופטימלית בין אותות. זכור לשמור על מספר הבלוטות והעיכול נפח בינוני כמתואר בפרוטוקול, ולבדוק את היעילות של עיכול רקמות בכל השלבים.

התאים המבודדים יכולים לשמש עבור יישומים מרובים במורד הזרם, כולל בניסויי vivo/in vitro, לדוגמה תרבות תאים, השתלה, מטבולומיקה, פרוטומיקה וניתוח תא יחיד.