Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Science Foundation (MCB-0923794 bis FT) unterstützt.

1. Producing Perithecien <ol><li> Zentrale inokulieren Karotten-Agar 10 in einer 6,0 cm Durchmesser Petrischale mit einer fruchtbaren Stamm von F. graminearum (PH empfehlen-1). </li><li> Ort beimpften Schalen unter hellen Leuchtstoffröhren bei Raumtemperatur (18-24 ° C) und erlauben zu wachsen, bis Myzel den äußeren Rand der Petrischale (3-5 Tage) erreicht hat. Kommerzielle Haushalt Leuchtstoffröhren arbeiten für die Stimulierung Fruchtkörper Bildung und Entladung in Ordnung. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Luftmycelien mit einem sterilen Zahnstocher. </li><li> Verteilen 1,0 ml 2,5% Tween 60 aq an der Oberfläche mit einem sterilen Glas Hockeystick oder abgerundeten Ende einer sterilen Glasstab. </li><li> Zurück Platten ans Licht. Fügen Sie nicht zu Parafilm Platten. </li><li> Nach 24 Stunden sollte die Oberfläche der Platten haben ein glänzendes Aussehen. Wenn Myzelien erscheint wieder, kratzen Oberfläche und erneut bewerben Tween-60-Lösung. </li><li> Beobachten Sie die Entwicklung der Perithecien in der nächsten Woche. Die intermediären Stufen derPerithecium Entwicklung kann durch sanftes Abkratzen der Oberfläche des Agar und Flash zur RNA-Extraktion (1) gefroren geerntet werden. </li><li> Reifen Sporen werden auf dem Deckel der Platte bis zum Tag 7 ansammeln. Zunächst werden diese nur sichtbar, unter einem Binokular, sondern von Tag 9, sie werden um eine ausreichende Dichte angesammelt haben, so dass sie mit bloßem Auge. </li></ol> 2. Ascosporenausschleuderung Assay <ol><li> Am Tag 6 nach der Anwendung von Tween-Lösung, schneiden Sie ein 1 cm Durchmesser Kreise aus dem Agar mit einem Holz-Bohrer. Alternativ kann ein Skalpell verwendet, um eine ähnlich große Segment entfernt werden. Der Kreis kann in zwei Hälften geschnitten und jede Hälfte platziert auf einem Objektträger. </li><li> Orient die Stücke so dass die Oberfläche mit den Fruchtkörper senkrecht zu der Oberfläche der Folie, und die Sporen sind über die gesamte Länge des Schiebers gebrannt. </li><li> Legen Sie den Objektträger in einer feuchten Kammer über Nacht unter Beleuchtung. Die Sporen werden auf akkumulierender Schieber und sichtbar für das bloße Auge am nächsten Morgen (Abbildung 2). </li><li> Kumulierte Sporen können aus der Folie mit Wasser gewaschen und quantifiziert werden, falls gewünscht. </li><li> Mögliche Sporenemission Inhibitoren können, indem sie in der Rückseite des Agarblock bei der Montage des Assays getestet werden. Einige Ionenkanal-Inhibitoren, die Entladung zu verringern wurden bereits mit dieser Technik 15 getestet. </li></ol> 3. Erzeugung von rekombinanten Nachkommen <ol><li> Initiieren Sie durch Impfen Karotten-Agar mit zwei Stämme von F. überqueren graminearum (ein Nit + und ein nit-), indem die Impfung Punkte auf gegenüberliegenden Seiten der Petrischale. </li><li> Sobald Hyphen haben die Oberfläche gefüllt, abkratzen Antenne Teil und gelten Tween-60-Lösung wie oben beschrieben. Verwenden Sie einen Marker, um auf der Seite der Petrischale, wo die Hyphen erfüllen beachten. </li><li> Zurück Kulturen zu Licht und inkubieren bis Perithecien entwickelt haben, und cirrhi haben seinPistole aus der Perithecien entlang der Schnittlinie zwischen den beiden Kulturen zu bilden. </li><li> Unter dem Binokular, bringen in den Blick der Perithezien entlang der Schnittlinie der beiden Kulturen. Mit Hilfe eines Insekts Pin, sterilisiert und in sterilem Wasser getaucht, berühren Sie eine Cirrus entlang dieser Grenze leicht mit der Spitze des Stifts. Die Feuchtigkeit auf den Stift sollte es den Cirrus, um den Stift zu halten. </li><li> Spülen Sie die Spitze des Stifts mit der Cirrus darauf in 200 ul sterilem Wasser in ein Eppendorf-Röhrchen, um die Sporen abwaschen. </li><li> Flamme der Stift, befeuchten Sie es erneut und wählen Sie ein anderes Cirrus. Haupt 10-15 cirrhi, und jeden in einem separaten Röhrchen Wasser. </li><li> Vortexen Röhrchen mit cirrhi suspendiert. </li><li> Entfernen 60 ul der Sporensuspension mit einer Pipette und auf MMTS Medium 1 in einer 9 cm-Petrischale. Verbreiten Sie mit einer sterilen Hockeyschläger. Der verbleibende Sporensuspension kann bei 4 ° C bis zu einer Woche aufbewahrt werden und bei Bedarf erneut ausplattiert. </li><li> Incubate bei Raumtemperatur (Licht nicht notwendig) für 3-5 Tage, bis sehr kleine Kolonien erscheinen (Abbildung 3). Es werden zwei Arten von Phänotypen zu den Kolonien. Die NIT-Kolonien haben spärlicher als die Hyphen Nit +-Kolonien. Cirrhi von rekombinantem Perithecien zeigen beide Phänotypen Kolonie in etwa gleichen Anteil. Entsorgen Sie die Platten mit Kolonien von nur einem einzigen Phänotyp auf sie. Beachten Sie, dass manchmal mehr als zwei Phänotypen durch Segregation von anderen Faktoren zur Folge haben. </li><li> Bewegen Sie Kolonien auf V8-oder Karotten-Agar für die Lagerung. Test-Kolonien auf Czapek Dox-Agar &#39;s (die nit-Stämme nicht auf Czapek Dox die wachsen) und auf PDA mit Chlorat (0,5 M Kaliumchlorat; die Nit +-Stämme nicht auf PDA mit Chlorat wachsen), um die richtige Phänotyp zu bestätigen. Untersuchen Sie diese Kolonien für die gewünschten Qualitäten. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Producing Perithezien Das Ziel ist, einen Rasen habenPerithezien ohne Myzelien oder Sporen sichtbar. Die Oberfläche der Kultur erscheint wie in schwarzem Samt (Abbildung 1). Nach 24 Stunden nach der Anwendung der Tween die Oberfläche des Agar sollte eine leichte Glanz. Wenn Myzelien wieder auftauchen, dann kann die Platte nicht gekratzt haben genug zu Perithecium Entwicklung zu induzieren. Ascosporenausschleuderung Immer in Ihrer Assay mehrere Blöcke von Agar bieten von der Wildtyp-Stamm. Wenn diejenigen, die nicht tun, Feuer, dann ist entweder Ihre Perithezien sind zu jung oder zu alt. Wenn sie zu alt sind, können zur Hyphen wird über die Oberfläche der Kultur gibt es eine weißliche Farbe angezeigt. Ist dies nicht der Fall, können sie zu jung sein, und der Test sollte in 24 Stunden erneut versucht werden. Gelegentlich haben Kulturen nicht gut zu entladen, und das Experiment muss wiederholt werden. Achten Sie darauf, Sie führen den Test unter den richtigen Lichtverhältnissen. Rekombinante Nachkommen <p class="jove_content"&gt; Rekombinante sollte Perithezien bilden die Mehrheit der Perithezien entlang der Schnittlinie zwischen den beiden Stämmen. Wir verarbeiten in der Regel 10 cirrhi aus einer Kreuzung und mindestens 4-6 derer sein sollte rekombinantes. In seltenen Fällen verhindert, dass eine Mutation eines Stammes aus der Paarung. Wenn ein Elternteil eine aberrante Wachstum Phänotyp, dann mehr als 2 Phänotypen können unter den Kolonien auf MMTS vorhanden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig1.jpg" /> Abbildung 1. Stadien der Entwicklung Perithecium auf Karotten-Agar. Linke, 72 h nach der Anwendung von Tween. Beachten Sie, rotes Pigment und sehr junge Perithecien sichtbar als schwarze Körner auf der Oberfläche. Richtig, bei 144 h, haben reifen Perithecien gebildet. Beachten Sie nahezu vollständigen Fehlen von oberflächlichen Myzelien in beiden Kulturen. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig2.jpg" /> Abbildung 2. Discharge-Test. Die orangefarbene Karotte Agarpfropfen ist so ausgerichtet, that Sporen zwangsweise aus dem reifen Perithecien auf seiner Oberfläche entladen kann auf der Oberfläche des Objektträgers zu akkumulieren. 15 Stunden Akkumulations-Zeit. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig3.jpg" /> Abbildung 3. Unterschiede im Wachstum zwischen Nit + und Nit-Kolonien auf selektiven MMTS Medium. Die NIT-Kolonien (Pfeilspitzen) sind kleiner. Die Nit +-Kolonien (Pfeile) zeigen ein robustes Wachstum. Foto nach 7 Tagen genommen.

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	<li>Bowden, R. L., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+recombination+in+Gibberella+zeae.">Sexual recombination in Gibberella zeae.</a> Phytopathology. 89, 182-188 (1999).</li><li>Buller, A. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Researches on Fungi. , (1909).</li><li>Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid1,+a+mechanosensitive+calcium+ion+channel,+affects+growth,+development,+and+ascospore+discharge+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae.">Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).</li><li>Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fusarium+graminearum+genome+reveals+a+link+between+localized+polymorphism+and+pathogen+specialization.">The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization.</a> Science. 317, 1400-1402 (2007).</li><li>Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -. H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -. W., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+and+complementation+of+the+mating+type+(MAT)+locus+of+the+wheat+head+blight+pathogen+Gibberella+zeae.">Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).</li><li>Gueldener, U., Seong, K. -. Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -. R., Adam, G., Mewes, H. -. W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fusarium+graminearum+Affymetrix+GeneChip+For+profiling+fungal+gene+expression+in+vitro+and+in+planta.">Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).</li><li>Hallen, H., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-Type+calcium+ion+channel+Cch1+affects+ascospore+discharge+and+mycelial+growth+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum).">The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).</li><li>Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -. H., Guldener, U., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+shifts+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum),+with+particular+emphasis+on+ion+transport+proteins.">Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins.</a> Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).</li><li>Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -. W., Yun, S. -. H., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifting+fungal+reproductive+mode+by+manipulation+of+mating+type+genes:+obligatory+heterothallism+of+Gibberella+zeae.">Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae.</a> Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).</li><li>Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+reduction+mutants+of+Fusarium+moniliforme+(Gibberella+fujikuoi.">Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi.</a> Genetics. 118, 417-423 (1988).</li><li>Min, K., Lee, J., Kim, J. -. C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene,+ROA,+is+required+for+proper+morphogenesis+and+discharge+of+ascospores+in+Gibberella+zeae.">A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).</li><li>Qi, W., Kwon, C., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+transcript+accumulation+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum).">Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).</li><li>Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+cannons:+explosive+spore+discharge+in+the+Ascomycota.">Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota.</a> FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).</li><li>Trail, F., Common, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perithecial+development+by+Gibberella+zeae:+a+light+microscopy+study.">Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study.</a> Mycologia. 92, 130-138 (2000).</li><li>Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+environmental+aspects+of+ascospore+discharge+in+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum.">Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum.</a> Mycologica. 94, 181-189 (2002).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

F. graminearum ist besonders gut auf das Studium der Fruchtkörper Entwicklung aufgrund der Verfügbarkeit eines gut kommentierten Genoms (angepasst <a href="http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/">mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB /</a> , 4), und die Verfügbarkeit eines Affymetrix- Basis Microarray-6. Dies hat die Fähigkeit, Gene, die für Sporenemission 7,11,3 identifizieren erleichtert. Die hier vorgestellten Methoden wird es der Forscherin, auf einer bestimmten Reihe von Entwicklungsstadien und Funktionen für die genetische Analyse der Fruchtkörper von F. konzentrieren graminearum. Die Verfahren sind ebenfalls leicht an erhältlichen Pilze, die Früchte in Kultur induziert werden kann, und kann als Standard für die Entwicklung in einer Vielzahl anderer Pilz Fruchtkörper Typen verwendet werden. Die Fähigkeit, eine Spore Brennen Phänotyp beurteilen kann bei Arten, wo Sporen sind klein und schwer zu sehen, wie subtil <em&gt; F. graminearum. Die Sammlung von Sporen auf einen sauberen Objektträger erleichtert sowohl die visuelle Beurteilung und quantitative Bewertung, als Sporen aus können Sie die Folie gewaschen und quantifiziert. Einige Pilzarten produzieren einen Schleim, die ihre Sporen und die Sporen können nicht abgespült werden umgibt, muss aber mikroskopisch gezählt werden, da sie auf der Folie bleiben. Wir haben das gefunden um wahr zu sein von Sclerotinia sclerotiorum.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Fusarium graminearum PH-1-Stamm </td><td> Fungal Genetics Stock Center, Kansas </td><td> FGSC 9075 </td></tr><tr><td> Tween 60 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1629 </td></tr><tr><td> Czapek Dox-Agar die </td><td> Difco, Becton Dickinson </td><td> 233810 </td></tr><tr><td> Kaliumchlorat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 255572 </td></tr></tbody></table>

sexual development and ascospore discharge in fusarium graminearum

Fusarium graminearum hat sich zu einem Modellsystem für Studien in der Entwicklung und Pathogenität der Fadenpilze. F. graminearum am leichtesten produziert Fruchtkörper, genannt Perithezien, auf Karotten-Agar. Perithecien enthalten zahlreiche Gewebearten, in bestimmten Phasen der Entwicklung Perithecium produziert. Dazu gehören (in der Reihenfolge ihres Auftretens) Bildung der Perithecium Initialen (was Anlass zu der ascogenen Hyphen), die Außenwand, Paraphysen (sterile Myzelien, die das Zentrum des Perithecium besetzen, bis die Asci entwickeln), die Asci, und die Ascosporen innerhalb der Asci 14. Die Entwicklung jedes dieser Gewebe wird von ungefähr 24 Stunden getrennt und war die Grundlage der Transkriptom-Studien während der sexuellen Entwicklung 12,8. Siehe Hallen et al. (2007) für eine ausführliche Beschreibung der Entwicklung, darunter Aufnahmen von jeder Etappe. Hier präsentieren wir die Methoden zur Erzeugung und Ernte von synchronenly Entwicklung von Rasenflächen Perithezien für zeitliche Untersuchungen der Genregulation, Entwicklung und physiologischen Prozessen. Obwohl diese Methoden sind speziell auf die mit F. verwendet werden geschrieben graminearum, können die Techniken für eine Vielzahl von anderen Pilzen verwendet werden, vorausgesetzt, dass Fruchtkörper in Kultur induziert werden und es gibt synchron zur Entwicklung. Vor kurzem haben wir dieses Protokoll angepasst, um die sexuelle Entwicklung von F. untersuchen verticillioides. Obwohl einzelne Perithecien müssen Hand in dieser Art aufgenommen werden, weil ein Rasen entwickeln Perithezien nicht induziert werden konnte, arbeitete das Verfahren auch zur Untersuchung von Entwicklung (Sikhakolli und Trail, unveröffentlicht). Die wichtigste Funktion von Pilzfruchtkörper ist die Verbreitung der Sporen. In vielen der Arten der Ascomycota (Ascus Herstellung Pilze), werden die Sporen aus dem Ascus gedreht, aufgrund der Erzeugung der Turgordruck im Ascus, Antreiben Ausstoßen von Sporen (und epiplasmic Fluid) durch diePore ​​in der Spitze 2,7 Ascus. Unsere Untersuchungen der gewaltsamen Sporenemission haben in der Entwicklung eines &quot;Sporenausstoß Assay&quot;, die wir verwenden, um auf Mutationen in den Prozess Bildschirm führte. Hier präsentieren wir Ihnen die Details dieses Tests. F. graminearum ist homothallischen, und somit kann Fruchtkörper in der Abwesenheit eines kompatiblen Partner bilden. Der Vorteil ist, dass homothallism Kreuzung ist nicht notwendig, Nachkommen homozygot für ein bestimmtes Merkmal, eine Facette, die die Untersuchung der sexuellen Entwicklung ermöglicht hat bei dieser Art 14,7 erzeugen. Allerdings haben heterothallisch Stämme wurden generiert, die für das Überschreiten der 5,9 verwendet werden. Es ist auch möglich, homothallischen Stämme kreuzen, um Mutanten für mehrere Gene in einem Stamm 1 zu erhalten. Dies wird durch coinoculating einer Petrischale mit 2 Stämmen durchgeführt. Entlang der Treffpunkt, wird die Mehrheit der Perithezien rekombinant sein (vorausgesetzt, die eine Mutation in einem der Elternstämme nicht hemmtAuskreuzung). Als Perithecien Alter, verströmen sie Ascosporen en masse statt gewaltsam entladen sie. Die resultierenden Sporen Exsudat (eine so genannte Cirrus) liegt an der Spitze des Peritheciums und kann leicht für die Rückgewinnung von einzelnen Sporen entfernt werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Identifizierung von rekombinantem Perithecien und die Gewinnung von rekombinanten Nachkommen zu erleichtern.

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Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Sexuelle Kreuze und Isolierung von rekombinanten Nachkommen sind wichtige Werkzeuge für die Forschung Fadenpilz,<em&gt; Fusarium graminearum</em&gt;, Die Techniken, die notwendig erfolgreiche Durchführung dieser Prozesse vorgestellt werden.

Sexuelle Entwicklung und Ascosporenausschleuderung in Fusarium graminearum</em

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces ...

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Research

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Biology

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

21.7K Aufrufe.  Michigan State University. Sexuelle Kreuze und Isolierung von rekombinanten Nachkommen sind wichtige Werkzeuge für die Forschung Fadenpilz, Fusarium graminearum, Die Techniken, die notwendig erfolgreiche Durchführung dieser Prozesse vorgestellt werden.

Serie: Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

Gibberella zeae Ascosporen Produktion und Sammlung für Microarray-Experimente.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Forschung

Biologie

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Biolumineszenz Imaging von Brusttumoren mit IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Einfrieren und Auftauen humanen embryonalen Stammzellen

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

Toxin Induktions-und Protein-Extraktion aus Fusarium Spp. Kulturen für Proteom-Studien

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluation der Brustdrüse Entwicklung und Funktion in Mausmodellen

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH) zu X-Chromosom-Inaktivierung in Differenzierte Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus Studieren

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Mikroskopie von Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group developed an intra-molecular FRET sensor to detect the interaction between G&#945; subunits and GPCRs in live cells following agonist stimulation. Here, we detail the protocol for detecting changes in FRET between the &#946;2-adrenergic receptor and the G&#945;s C-terminus peptide upon treatment with 100 &#181;M isoproterenol hydrochloride as previously characterized1. Our FRET sensor is a single polypeptide consisting serially of a full-length GPCR, a FRET acceptor fluorophore (mCitrine), an ER/K SPASM (systematic protein affinity strength modulation) linker, a FRET donor fluorophore (mCerulean), and a G&#945; C-terminal peptide. This protocol will detail cell preparation, transfection conditions, equipment setup, assay execution, and data analysis. This experimental design detects small changes in FRET indicative of protein-protein interactions, and can also be used to compare the strength of interaction across ligands and GPCR-G protein pairings. To enhance the signal-to-noise in our measurements, this protocol requires heightened precision in all steps, and is presented here to enable reproducible execution.

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

G-Protein-selektive GPCR Konformationen gemessen mit FRET-Sensoren in einer Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...