Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Science Foundation (MCB-0923794 à FT).

1. Produire périthèces <ol><li> Agar Centre carotte inoculer 10 en a 6,0 cm de diamètre boîte de Pétri avec une souche fertile de F. graminearum (PH Recommander-1). </li><li> Lieu inoculé plats sous les lumières lumineuses fluorescentes à température ambiante (18-24 ° C) et laisser croître jusqu&#39;à ce que le mycélium a atteint le bord extérieur de la boîte de Pétri (3-5 jours). Les lampes domestiques commerciaux fluorescentes fonctionnent très bien pour stimuler la formation de corps de fructification et de décharge. </li><li> Retirez délicatement le mycélium aérien avec un cure-dent stérile. </li><li> Distribuer 1,0 ml de 2,5% de Tween 60 aq à la surface avec une Hockeystick verre stérile ou d&#39;extrémité arrondie d&#39;une tige en verre stérile. </li><li> Remettre les assiettes à la lumière. Ne pas ajouter de Parafilm à plaques. </li><li> Après 24 h, la surface des plaques doit avoir un aspect brillant. Si mycélium réapparaît, la surface gratter et une nouvelle demande de Tween-60 solution. </li><li> Observer le développement des périthèces cours de la semaine prochaine. Les étapes intermédiaires dedéveloppement périthèce peut être récolté en grattant doucement la surface de l&#39;agar-agar et surgelés pour extraction de l&#39;ARN (Figure 1). </li><li> Les spores mûres vont s&#39;accumuler sur le couvercle de la plaque par jour 7. Au départ, ces ne sera visible que sous un microscope à dissection, mais le jour 9, ils se sont accumulés à une densité suffisante de manière à être visible à l&#39;œil nu. </li></ol> 2. Essai de décharge des ascospores <ol><li> Au jour 6 après l&#39;application de la solution de Tween, couper un cercle de 1 cm de diamètre sur l&#39;agar-agar avec un perce-bois. Alternativement, un scalpel peut être utilisé pour enlever un segment de taille similaire. Le cercle peut être coupé en deux et chaque moitié placé sur une lame de microscope en verre. </li><li> Orienter les pièces afin que la surface contenant les fructifications est perpendiculaire à la surface de la diapositive, et les spores sont tirés vers le bas la longueur de la glissière. </li><li> Placer la lame dans une chambre humide pendant la nuit sous les lumières. Les spores vont s&#39;accumuler sur lesla lame et être visible à l&#39;œil nu le matin suivant (Figure 2). </li><li> Spores accumulées peuvent être lavés de la lame à l&#39;eau et quantifiés si vous le souhaitez. </li><li> Inhibiteurs potentiels de la décharge d&#39;ascospores peuvent être analysés en les ajoutant à l&#39;arrière du bloc de gélose pendant le montage de l&#39;essai. Certains inhibiteurs de canaux ioniques qui permettent de réduire la décharge ont déjà été testés avec cette technique 15. </li></ol> 3. Génération d&#39;une descendance recombinante <ol><li> Initier traverser en inoculant agar carotte avec deux souches de F. graminearum (un Nit + et l&#39;autre à lentes), plaçant les points de inoculation sur des côtés opposés de la boîte de Petri. </li><li> Une fois que les hyphes ont rempli la surface, grattez partie aérienne et appliquer une solution de Tween-60 tel que décrit ci-dessus. Utilisation d&#39;un marqueur de noter sur le côté de la boîte de Petri, où les hyphes répondre. </li><li> Retour cultures à la lumière et incuber jusqu&#39;à périthèces se sont développés, et ont cirrhes êtrearmes à feu pour former de l&#39;périthèces long de l&#39;intersection entre les deux cultures. </li><li> Sous le microscope de dissection, mettre en voir les périthèces long de l&#39;intersection des deux cultures. Utilisation une broche d&#39;insecte, stérilisé et trempée dans de l&#39;eau stérile, un toucher cirrhus long de ce bord légèrement avec l&#39;extrémité de la broche. L&#39;humidité sur la broche devrait permettre aux cirrhus de s&#39;en tenir à la broche. </li><li> Rincer l&#39;extrémité de la broche avec les cirrhus sur elle dans 200 ul d&#39;eau stérile dans un tube Eppendorf de se laver les spores hors tension. </li><li> Flamme de la broche, l&#39;humidifier et reprendre un autre cirrhus. Très 10 à 15 cirrhes, et placer chacun dans un tube séparé de l&#39;eau. </li><li> Tubes vortex brièvement suspendue contenant cirrhes. </li><li> Retirer 60 pl de la suspension de spores avec une pipette et le lieu sur un milieu MMTS 1 dans un plat de Pétri de 9 cm. Étaler avec une crosse de hockey stérile. La suspension de spores restant peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine et réétalées si nécessaire. </li><li> Incubationte à la température ambiante (la lumière n&#39;est pas nécessaire) pendant 3-5 jours jusqu&#39;à ce que les très petites colonies apparaissent (Figure 3). Il y aura deux sortes de phénotypes entre les colonies. Les colonies lentes aura hyphes moins nombreuses que les colonies + NIT. Cirrhes de recombinaison périthèces se montrent les deux phénotypes colonie en proportion à peu près égale. Jeter les plaques avec des colonies de seulement un phénotype unique sur eux. Notez que, parfois, plus de deux phénotypes survenir en raison de la ségrégation des autres facteurs. </li><li> Déplacer les colonies à V8 ou de l&#39;agar de carotte pour le stockage. Colonies de test sur gélose de Czapek Dox (les souches lentes ne poussent pas sur Czapek Dox) et sur le PDA avec le chlorate (0,5 M chlorate de potassium; les souches + NIT ne poussent pas sur PDA avec le chlorate) pour confirmer le phénotype correcte. Examinez ces colonies pour les qualités souhaitées. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Produire des périthèces Le but est d&#39;avoir une pelouse depérithèces sans mycélium ou des spores apparentes. La surface de la culture sera semblable au velours noir (Figure 1). À 24 h après l&#39;application de Tween la surface de la gélose doit avoir un léger lustre. Si mycélium réapparaissent, puis la plaque peuvent ne pas avoir été gratté assez pour induire le développement périthèce. Ascospores décharge Toujours prévoir dans votre test de plusieurs blocs de gélose à partir de la souche de type sauvage. Si ceux qui ne se déclenchent pas, alors soit vos périthèces sont trop jeunes ou trop vieux. Si ils sont trop vieux, alors de nombreux hyphes apparaîtra au-dessus de la surface de la culture en lui donnant une teinte blanchâtre. Si ce n&#39;est pas le cas, ils peuvent être trop jeune, et le dosage doit être jugé à nouveau en 24 h. Parfois, les cultures ne se déchargent pas bien, et l&#39;expérience devra être répétée. Assurez-vous effectuer le test dans les conditions de lumière propres. Descendance recombinante <p class="jove_content"Périthèces&gt; recombinant devraient constituer la majorité des périthèces long de l&#39;intersection entre les deux souches. Nous avons l&#39;habitude de traiter 10 cirrhes d&#39;un croisement et au moins 4-6 de ceux-ci devraient être recombinant. Très occasionnellement, une mutation empêche une souche de l&#39;accouplement. Si l&#39;un des parents a un phénotype de croissance aberrant, puis plus de 2 phénotypes peuvent être présents parmi les colonies sur MMTS. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig1.jpg" /> Figure 1. Les étapes du développement périthèce sur gélose de carotte. Gauche, 72 h après l&#39;application de Tween. Notez pigment rouge et périthèces très jeune visibles que quelques grains noirs sur la surface. A droite, à 144 h, périthèces matures ont formé. Notez l&#39;absence quasi-complète du mycélium superficiel dans les deux cultures. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig2.jpg" /> Test de décharge Figure 2.. La fiche orange carotte agar est orienté de façon thaspores t force déchargés de la périthèces matures sur sa surface peuvent s&#39;accumuler sur la surface de la lame de verre. 15 h temps d&#39;accumulation. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig3.jpg" /> Figure 3. Les différences de croissance entre Nit nit + et des colonies sur milieu MMTS sélective. Les colonies nit-(pointes de flèches) sont plus petits. Les + de Nit colonies (flèches) montrent une croissance robuste. Photo prise au bout de 7 jours.

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	<li>Bowden, R. L., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+recombination+in+Gibberella+zeae.">Sexual recombination in Gibberella zeae.</a> Phytopathology. 89, 182-188 (1999).</li><li>Buller, A. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Researches on Fungi. , (1909).</li><li>Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid1,+a+mechanosensitive+calcium+ion+channel,+affects+growth,+development,+and+ascospore+discharge+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae.">Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).</li><li>Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fusarium+graminearum+genome+reveals+a+link+between+localized+polymorphism+and+pathogen+specialization.">The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization.</a> Science. 317, 1400-1402 (2007).</li><li>Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -. H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -. W., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+and+complementation+of+the+mating+type+(MAT)+locus+of+the+wheat+head+blight+pathogen+Gibberella+zeae.">Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).</li><li>Gueldener, U., Seong, K. -. Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -. R., Adam, G., Mewes, H. -. W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fusarium+graminearum+Affymetrix+GeneChip+For+profiling+fungal+gene+expression+in+vitro+and+in+planta.">Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).</li><li>Hallen, H., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-Type+calcium+ion+channel+Cch1+affects+ascospore+discharge+and+mycelial+growth+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum).">The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).</li><li>Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -. H., Guldener, U., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+shifts+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum),+with+particular+emphasis+on+ion+transport+proteins.">Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins.</a> Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).</li><li>Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -. W., Yun, S. -. H., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifting+fungal+reproductive+mode+by+manipulation+of+mating+type+genes:+obligatory+heterothallism+of+Gibberella+zeae.">Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae.</a> Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).</li><li>Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+reduction+mutants+of+Fusarium+moniliforme+(Gibberella+fujikuoi.">Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi.</a> Genetics. 118, 417-423 (1988).</li><li>Min, K., Lee, J., Kim, J. -. C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene,+ROA,+is+required+for+proper+morphogenesis+and+discharge+of+ascospores+in+Gibberella+zeae.">A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).</li><li>Qi, W., Kwon, C., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+transcript+accumulation+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum).">Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).</li><li>Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+cannons:+explosive+spore+discharge+in+the+Ascomycota.">Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota.</a> FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).</li><li>Trail, F., Common, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perithecial+development+by+Gibberella+zeae:+a+light+microscopy+study.">Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study.</a> Mycologia. 92, 130-138 (2000).</li><li>Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+environmental+aspects+of+ascospore+discharge+in+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum.">Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum.</a> Mycologica. 94, 181-189 (2002).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

F. graminearum est particulièrement bien adapté à l&#39;étude du développement du corps fructifère en raison de la disponibilité d&#39;un génome bien annotée ( <a href="http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/">mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB /</a> ; 4), et de la disponibilité d&#39;un Affymetrix- sur la base microréseau 6. Cela a facilité la capacité à identifier les gènes importants pour la libération des ascospores 7,11,3. Les méthodes présentées ici permettent au chercheur de se concentrer sur un ensemble discret de stades de développement et des fonctions pour l&#39;analyse génétique des fructifications de F. graminearum. Les méthodes sont également facilement adaptables aux champignons connexes qui peuvent être induites à fruits dans la culture, et peut être utilisé comme un standard pour le développement dans une variété d&#39;autres types de fructification des champignons. La capacité d&#39;évaluer un phénotype de tir des spores peuvent être subtils dans les espèces où les spores sont de petite taille et difficiles à voir, comme <em&gt; F. graminearum. La collection de spores sur une lame propre facilite à la fois une évaluation visuelle, et l&#39;évaluation quantitative, sous forme de spores peuvent être lavés de la lame et quantifié. Certaines espèces fongiques produisent un mucilage qui entoure leur spores et les spores ne peut pas être rincé, mais doivent être comptés au microscope car ils restent sur la diapositive. Nous avons trouvé que cela est vrai de Sclerotinia sclerotiorum.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Fusarium graminearum souche PH-1 </td><td> Fongique Genetics Stock Center, Kansas </td><td> FGSC 9075 </td></tr><tr><td> Tween 60 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1629 </td></tr><tr><td> Agar Czapek Dox </td><td> Difco, Becton Dickinson </td><td> 233810 </td></tr><tr><td> Le chlorate de potassium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 255572 </td></tr></tbody></table>

sexual development and ascospore discharge in fusarium graminearum

Fusarium graminearum est devenu un système modèle pour les études en matière de développement et de la pathogénicité des champignons filamenteux. F. graminearum produit le plus facilement les organes de fructification, appelés périthèces, sur gélose de carotte. Les périthèces contiennent de nombreux types de tissus, des produits à des stades spécifiques du développement périthèce. Il s&#39;agit notamment (par ordre d&#39;apparition) la formation des initiales périthèce (qui donnent lieu à des hyphes ascogènes), la paroi extérieure, paraphyses (mycélium stérile qui occupent le centre du périthèce jusqu&#39;à ce que le asques se développent), le asques, les ascospores et les au sein de l&#39;asques 14. Le développement de chacun de ces tissus est séparé par environ 24 heures et a été la base d&#39;études de transcriptomique pendant le développement sexuel 12,8. Reportez-vous à Hallen et al. (2007) pour une description plus approfondie du développement, y compris des photographies de chaque étape. Ici, nous présentons les méthodes pour générer et à la récolte synchronement le développement de pelouses périthèces pour les études temporelles de la régulation des gènes, le développement et les processus physiologiques. Bien que ces méthodes sont écrites spécifiquement pour être utilisé avec F. graminearum, les techniques peuvent être utilisées pour une variété d&#39;autres champignons, à condition que la fructification peut être induite dans la culture et il ya une certaine synchronie au développement. Nous avons récemment adapté ce protocole d&#39;étudier le développement sexuel de F. verticillioides. Bien que les périthèces individu doit être cueillies à la main dans cette espèce, car une pelouse de développer périthèces n&#39;a pas pu être induite, le processus a bien fonctionné pour étudier le développement (Sikhakolli et Trail, non publié). La fonction la plus importante des fructifications fongiques est la dispersion des spores. Dans la plupart des espèces de Ascomycota (asque produire des champignons), les spores sont abattus à partir de l&#39;asque, en raison de la génération de la pression de turgescence au sein de l&#39;asque, la conduite d&#39;éjection de spores (et fluide epiplasmic) par l&#39;intermédiaire dupores dans la pointe asque 2,7. Nos études de la libération des ascospores forcé ont abouti à l&#39;élaboration d&#39;un &quot;test de décharge des spores&quot;, que nous utilisons pour dépister des mutations dans le processus. Nous présentons ici les détails de cet essai. F. graminearum est homothallique, et ne peut donc former des fructifications en l&#39;absence d&#39;un partenaire compatible. L&#39;avantage de ce passage à niveau est homothallisme n&#39;est pas nécessaire de générer des homozygotes progéniture pour un trait particulier, une facette qui a facilité l&#39;étude du développement sexuel chez cette espèce 14,7. Cependant, les souches hétérothalliques est généré, qui peut être utilisé pour le franchissement 5,9. Il est également possible de traverser les souches homothalliques d&#39;obtenir des mutants pour plusieurs gènes dans une souche 1. Cela se fait par un plat de Petri coinoculating avec 2 souches. Outre le point de rencontre, la majorité des périthèces sera recombinant (à condition d&#39;une mutation dans l&#39;un des souches parentales n&#39;inhibe paspollinisation croisée). Comme l&#39;âge périthèces, ils respirent la ascospores en masse au lieu de les évacuer de force. L&#39;exsudat de spores résultant (appelé cirrhus) se trouve à la pointe du périthèce et peut facilement être enlevé pour la récupération des spores individuelles. Ici, nous présentons un protocole pour faciliter l&#39;identification des périthèces recombinant et la récupération de la descendance recombinante.

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Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Croisements sexués et l&#39;isolement de la descendance recombinante sont des outils de recherche importants pour le champignon filamenteux,<em&gt; Fusarium graminearum</em&gt;, Les techniques nécessaires de mener à bien ces processus sont présentés.

Développement sexuel et la libération des ascospores dans Fusarium graminearum</em

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

21.7K vues.  Michigan State University. Croisements sexués et l'isolement de la descendance recombinante sont des outils de recherche importants pour le champignon filamenteux, Fusarium graminearum, Les techniques nécessaires de mener à bien ces processus sont présentés.

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Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

Gibberella zeae ascospores production et la collecte d&#39;expériences sur biopuces.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Recherche

Biologie

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Bioluminescent imagerie des tumeurs mammaires qui utilisent des fréquences IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualiser le cœur battant Drosophile</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congélation et de décongélation cellules souches embryonnaires humaines

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

L&#39;induction ou à toxines et d&#39;extraction de protéines à partir Fusarium Spp. Cultures pour les études protéomiques

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluation de développement des glandes mammaires et fonction dans des modèles murins

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

ADN-ARN combiné Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation (FISH) à étudier inactivation du chromosome X dans différencié Femme Souris cellules souches embryonnaires

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopie de levure Fission Lifecycle sexuelle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Gap Junctional intercellulaire Communication: Un biomarqueur fonctionnelle pour évaluer les effets néfastes des substances toxiques et les toxines, et bienfaits pour la santé des produits naturels

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group developed an intra-molecular FRET sensor to detect the interaction between G&#945; subunits and GPCRs in live cells following agonist stimulation. Here, we detail the protocol for detecting changes in FRET between the &#946;2-adrenergic receptor and the G&#945;s C-terminus peptide upon treatment with 100 &#181;M isoproterenol hydrochloride as previously characterized1. Our FRET sensor is a single polypeptide consisting serially of a full-length GPCR, a FRET acceptor fluorophore (mCitrine), an ER/K SPASM (systematic protein affinity strength modulation) linker, a FRET donor fluorophore (mCerulean), and a G&#945; C-terminal peptide. This protocol will detail cell preparation, transfection conditions, equipment setup, assay execution, and data analysis. This experimental design detects small changes in FRET indicative of protein-protein interactions, and can also be used to compare the strength of interaction across ligands and GPCR-G protein pairings. To enhance the signal-to-noise in our measurements, this protocol requires heightened precision in all steps, and is presented here to enable reproducible execution.

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

Conformations GPCR G Protein-sélectifs mesurée à l&#39;aide de FRET capteurs dans un Fluorometer Assay de cellules vivantes de suspension

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...