Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (FT için MCB-0.923.794) bir hibe ile desteklenmiştir.

1. Perithecia Üreten <ol><li> F. verimli bir suşu ile 6.0 cm çaplı Petri kabındaki Merkezi inokülasyon havuç agar 10 graminearum&#39;un (PH-1 Tavsiye). </li><li> Yeri oda sıcaklığında (18-24 ° C) parlak floresan ışıkları altında yemekler aşılanmış ve misel Petri (3-5 gün) dış kenarına ulaşana kadar büyümeye olanak sağlar. Ticari ev floresan ışıkları meyve vücutta oluşumu ve akıntı teşvik için sorunsuz çalışır. </li><li> Yavaşça steril bir kürdan ile havadan miselyumla kaldırın. </li><li> Steril bir cam hockeystick veya steril bir cam çubuğun yuvarlak ucu ile yüzeye 1.0 ml% 2.5 Tween 60 aq dağıtın. </li><li> Işığa plakalar dönün. Plakalara parafilm katmayın. </li><li> 24 saat sonra, plaka yüzeyi parlak bir görünüme sahip olmalıdır. Eğer miselyumla belirirse, kazıma yüzey ve yeniden başvuru Tween-60 çözüm. </li><li> Önümüzdeki hafta içinde perithecia gelişimi dikkate alınmalıdır. Bir ara aşamalarınperithecium geliştirme hafifçe RNA ekstraksiyonu (Şekil 1) dondurulmuş agar ve flaş yüzeyini kazıyarak hasat edilebilir. </li><li> Olgun sporlar Gün 7 ile plaka kapağında birikecektir. Başlangıçta bu sadece bir mikroskop altında görülebilir, ancak çıplak gözle olacak şekilde günde 9, onlar yeterli yoğunluğu birikmiş olacaktır. </li></ol> 2. Askopor Deşarj Tahlili <ol><li> 6. günde Tween çözüm uygulandıktan sonra, bir odun kurdu olan agar 1 cm çap daire kesip. Alternatif olarak, bir bisturi aynı büyüklükte bir bölümü kaldırmak için kullanılabilir. Daire yarısında dilimlenmiş ve her yarım bardak mikroskop lamı üzerine yerleştirilebilir. </li><li> Orient adet meyve gövdeleri içeren yüzey sürgünün yüzeyine dik olacak şekilde, ve sporların sürgünün uzunluğu aşağı ateşlenir. </li><li> Işıklar altında gece bir nem odasında slayt yerleştirin. Sporlar üzerinde birikecektirslayt ve çıplak gözle ertesi sabah (Şekil 2) görülebilir. </li><li> Biriken sporların su ile yıkanmış ve kapama istenirse belirtilebilir. </li><li> Potansiyel askopor deşarj inhibitörleri testin montaj sırasında agar bloğunun arkasına ekleyerek test edilebilir. Deşarj azaltmak bazı inhibitörleri daha önceden iyon kanalı bu teknik 15 ile test edilmiştir. </li></ol> 3. Rekombinant Döl üretimi <ol><li> F. iki suşları ile havuç agar aşılayarak çapraz Initiate graminearum (bir Nit + ve bir NIT-), Petri tabağı zıt tarafları üzerinde inokulasyon noktaları yerleştirilmesi. </li><li> Bir kez hif yüzey doldurdu, hava bölümünü kazıyarak ve yukarıda açıklandığı gibi Tween-60 çözümü uygulayın. Hif karşılamak Petri tarafında dikkat edilmesi gereken bir işareti kullanın. </li><li> Işık kültürler dönün ve perithecia geliştirdik kadar inkübe ve cirrhi olmak varsilahı iki kültür arasındaki kesişme boyunca perithecia gelen oluşturur. </li><li> Iki kültürün kesiştiği boyunca perithecia görüntülemek içine mikroskop altında getirmek. Bir böceğin iğne ucu ile, steril ve steril suya batırılmış, iğne ucuyla hafifçe Bu sınır boyunca bir cirrhus dokunun. Pin üzerindeki nem cirrhus pin ayrılmamak için izin vermelidir. </li><li> Sporlar yıkayın bir Eppendorf tüp içinde 200 ul steril su içinde üzerinde cirrhus ile pin ucu durulayın. </li><li> Alev pimi tekrar ıslatın ve başka bir cirrhus seçin. 10-15 cirrhi çekme, ve su ile ayrı bir tüp içinde, her yerleştirin. </li><li> Kısaca vorteks tüpler cirrhi askıya içermesin. </li><li> 9 cm Petri kabındaki MMTS orta 1 bir pipet ve yer ile spor süspansiyon 60 ul çıkarın. Steril bir hokey sopası ile yayıldı. Geriye kalan spor süspansiyonu bir hafta için 4 ° C&#39;de saklandı ve gerekirse kaplandı edilebilir. </li><li> Inkübasyon3-5 gün oda sıcaklığında (gerekli değil ışık) az te çok küçük koloniler (Şekil 3) ortaya çıkıncaya kadar. Koloniler arasında fenotipleri iki tür olacak. Nit-koloniler Nit + koloniler daha sparser hif olacaktır. Rekombinant perithecia gelen Cirrhi yaklaşık olarak eşit oranda her iki koloni fenotipleri gösterecektir. Üzerlerinde tek bir fenotip koloniler ile plakaları atılır. Bazen ikiden fazla fenotip diğer faktörlere bağlı olarak segregasyon neden olduğunu not edin. </li><li> V8 veya depolama için havuç agar kolonileri taşıyın. Doğru fenotipi onaylamak için; Czapek Kullanıcı Dox Agar (nit suşlar Czapek Kullanıcı Dox üzerinde büyümek olmaz) ve Klorat (Nit + suşlar Klorat ile PDA üzerinde büyümek olmaz 0,5 M Potasyum Klorat) ile PDA Testi koloniler. İstenilen niteliklere için bu kolonilerin inceleyin. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Perithecia Üreten Amaç bir çim sahip olmaktırHerhangi bir misel veya belirgin sporlar olmadan perithecia. Kültür yüzey siyah kadife (Şekil 1) benzer bir görünümde olacaktır. 24 saat at Tween uygulandıktan sonra ağar yüzeyine hafif bir parlaklık sahip olmalıdır. Miseller yeniden takdirde, bord perithecium gelişimi indüklemek için yeteri kadar sıyrılmıştır edilmemiş olabilir. Askopor deşarj Her zaman yabani tip suşu sizin test agar birkaç blok sağlar. Bu ateş yoksa, sonra ya perithecia çok genç veya çok yaşlı. Onlar çok eski ise, o çok sayıda hif bir beyaz renk veren kültür yüzey üzerinde görünür. Bu durumda değilse, çok genç olabilir ve deney 24 saat içinde tekrar denenmelidir. Bazen, kültürler de deşarj yoktur ve deneyi tekrarladı gerekecektir. Eğer uygun ışık koşullarında test gerçekleştirmek emin olun. Rekombinant döl <p class="jove_content"&gt; Rekombinant perithecia iki suş arasındaki kesişme boyunca perithecia çoğunluğu kadar yapmak gerekir. Genellikle bir çapraz den 10 cirrhi işlemek ve bunlardan en az bir rekombinant 4-6 olmalıdır. Çok nadiren, bir mutasyon çiftleşme bir gerginlik engeller. Ebeveynlerden biri Aberan büyüme fenotipi varsa, en fazla 2 fenotipleri MMTS üzerinde koloniler arasında mevcut olabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig1.jpg" /> Şekil 1. Havuç agar perithecium gelişim aşamaları. Tween uygulamadan sonra Sol, 72 saat. Kırmızı pigment ve yüzeyde siyah taneleri gibi görünen çok genç perithecia unutmayın. Sağ, 144 saatte, olgun perithecia oluşturmuşlardır. Her iki kültürde de yüzeysel misel ve tama yakın olmadığına dikkat edin. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig2.jpg" /> Şekil 2. Deşarj testi. Turuncu havuç agar tapa odaklı böylece tha olduğunuzorla yüzeyinde olgun perithecia boşaltılan t sporların cam sürgünün yüzeyinde birikebilir. 15 saat birikimi zaman. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig3.jpg" /> Şekil 3. Nit + ve seçici MMTS ortamda nit-koloniler arasında büyüme farklar. Nit-koloniler (ok başları) daha küçüktür. Nit + koloniler (oklar) güçlü büyüme göstermektedir. Fotoğraf 7 gün sonra alınır.

<ol>
	<li>Bowden, R. L., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+recombination+in+Gibberella+zeae.">Sexual recombination in Gibberella zeae.</a> Phytopathology. 89, 182-188 (1999).</li><li>Buller, A. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Researches on Fungi. , (1909).</li><li>Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid1,+a+mechanosensitive+calcium+ion+channel,+affects+growth,+development,+and+ascospore+discharge+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae.">Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).</li><li>Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fusarium+graminearum+genome+reveals+a+link+between+localized+polymorphism+and+pathogen+specialization.">The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization.</a> Science. 317, 1400-1402 (2007).</li><li>Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -. H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -. W., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+and+complementation+of+the+mating+type+(MAT)+locus+of+the+wheat+head+blight+pathogen+Gibberella+zeae.">Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).</li><li>Gueldener, U., Seong, K. -. Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -. R., Adam, G., Mewes, H. -. W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fusarium+graminearum+Affymetrix+GeneChip+For+profiling+fungal+gene+expression+in+vitro+and+in+planta.">Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).</li><li>Hallen, H., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-Type+calcium+ion+channel+Cch1+affects+ascospore+discharge+and+mycelial+growth+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum).">The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).</li><li>Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -. H., Guldener, U., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+shifts+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum),+with+particular+emphasis+on+ion+transport+proteins.">Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins.</a> Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).</li><li>Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -. W., Yun, S. -. H., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifting+fungal+reproductive+mode+by+manipulation+of+mating+type+genes:+obligatory+heterothallism+of+Gibberella+zeae.">Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae.</a> Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).</li><li>Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+reduction+mutants+of+Fusarium+moniliforme+(Gibberella+fujikuoi.">Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi.</a> Genetics. 118, 417-423 (1988).</li><li>Min, K., Lee, J., Kim, J. -. C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene,+ROA,+is+required+for+proper+morphogenesis+and+discharge+of+ascospores+in+Gibberella+zeae.">A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).</li><li>Qi, W., Kwon, C., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+transcript+accumulation+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum).">Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).</li><li>Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+cannons:+explosive+spore+discharge+in+the+Ascomycota.">Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota.</a> FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).</li><li>Trail, F., Common, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perithecial+development+by+Gibberella+zeae:+a+light+microscopy+study.">Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study.</a> Mycologia. 92, 130-138 (2000).</li><li>Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+environmental+aspects+of+ascospore+discharge+in+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum.">Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum.</a> Mycologica. 94, 181-189 (2002).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

F. graminearum özellikle iyi açıklamalı genomunun (kullanılabilirliği nedeniyle meyve vücut geliştirme çalışması uyarlanmıştır <a href="http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/">mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB /</a> ; 4), ve kullanılabilirliğini Affymetrix- mikroarray 6 dayanır. Bu askopor deşarj 7,11,3 için önemli genlerin tanımlanması için yeteneği kolaylaştırmıştır. Burada sunulan yöntemler araştırmacı F. meyve organlarının genetik analiz için gelişim evreleri ve fonksiyonları ayrı bir set odaklanma sağlayacak graminearum&#39;un. Yöntemleri de kültüre meyve uyarılan edilebilir ilgili mantarlar kolayca adapte olan ve diğer mantar meyve vücut tiplerinde in geliştirilmesi için bir standart olarak kullanılabilir. Bir spor ateş fenotipi değerlendirmek için yeteneği sporlar görmek için küçük ve zor türler gibi ince olabilir <em&gt; F. graminearum&#39;un. Temiz bir slayt üzerinde sporların toplanması sporları slayt kapalı yıkanabilir ve nicelendirildi edilebileceği gibi, görsel değerlendirme ve niceliksel hem de kolaylaştırır. Bazı mantar türleri kendi spor ve spor durulanır edilemez çevreleyen bir zamk üretmek, ancak slayt üzerinde kalması mikroskobik sayılmalıdır. Biz Sclerotiniasclerotiorum gerçek olmak için bu bulduk.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Fusarium graminearum suşu PH-1 </td><td> Mantar Genetik Stok Merkezi, Kansas </td><td> FGSC 9075 </td></tr><tr><td> Tween 60 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1629 </td></tr><tr><td> Czapek en Dox Agar </td><td> Difco, Becton Dickinson </td><td> 233810 </td></tr><tr><td> Potasyum Klorat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 255572 </td></tr></tbody></table>

sexual development and ascospore discharge in fusarium graminearum

Fusarium graminearum filamentöz mantarların gelişmesi ve patojenite çalışmaları için bir model sistem haline gelmiştir. F. graminearum&#39;un en kolay havuç agar, perithecia adlandırılan meyve organları, üretir. Perithecia perithecium gelişim aşamasında üretilen belirli sayıda doku grupları, içerirler. Bunlar, (sırasına göre) perithecium baş (ascogenous hifler ortaya çıkmasına neden olan), dış cidar, paraphyses (asci geliştirmek kadar perithecium merkezi işgal steril Miseller), asci ve ascospores oluşumunu içeren asci 14 içinde. Bu dokuların her birinin gelişimi yaklaşık 24 saat ile ayrılır ve cinsel gelişimi sırasında 12,8 transkriptomik çalışmalara göre olmuştur. Her aşamanın fotoğrafları da dahil olmak üzere gelişme daha ayrıntılı bir açıklama için, Hallen ve ark. (2007) bakın. Burada, senkron üretim ve hasat için yöntemler sunmakly gen düzenlenmesi, geliştirilmesi ve fizyolojik süreçlerin zamansal çalışmaları için perithecia arasında çimler gelişmekte. Bu yöntemler F. ile kullanılmak için özel olarak yazılmış rağmen graminearum, meyva verme teknikleri kültüründe uyarılan edilebilir olması koşuluyla, diğer mantarlara çeşitli için kullanılır ve gelişme için bazı senkronize vardır edilebilir. Biz son zamanlarda F. cinsel gelişimi incelemek için bu protokolü adapte olması verticillioides. Perithecia gelişen bir çim uyarılabilir çünkü bireysel perithecia, bu türün ele alınmak zorunda olsa da, süreç geliştirme (Sikhakolli ve Trail, yayınlanmamış) çalışmak için iyi çalıştı. Mantar meyve organlarının en önemli fonksiyonu sporların yayılmasını olduğunu. Ascomycota (TSKB mantar üreten) türlerin çoğunda, sporlar yoluyla (ve epiplasmic sıvı) sporların ejeksiyon sürüş, TSKB içinde turgor basıncı nesil nedeniyle, TSKB gelen çekilirTSKB ucu 2,7 gözenek. Zorla askopor deşarj çalışmalarımız bu süreçte mutasyonların taranması için kullanabileceğiniz bir &quot;spor deşarj assay&quot;, geliştirilmesi sonuçlandı. Burada Bu testin ayrıntıları sunulmaktadır. F. graminearum homothallic, ve böylece, uyumlu bir ortak yokluğunda meyve gövdeleri oluşturabilirler. Homothallism bir avantajı, bu geçiş, belli bir özelliği, bu tür 14,7 cinsel gelişme çalışma kolaylaştırmıştır bir yönü için yavru homozigot üretmek için gerekli değildir. Bununla birlikte, heterothallic suşları 5,9 geçiş için kullanılabileceği oluşturulan edilmiştir. Bu, bir suş 1 birkaç genleri için mutantları elde etmek homothallic suşları çapraz da mümkündür. Bu, 2 suşları ile bir Petri tabağına coinoculating yapılır. Buluşma noktası boyunca perithecia çoğunluğu (ana türlerden biri bir mutasyon sağlanan inhibe etmez rekombinant olacak) döllenmedir. Perithecia yaşına gelince, onlar zorla boşaltarak onların yerine ascospores topluca terlemek. Çıkan spor eksuda (a cirrhus denir) perithecium ucunda oturur ve kolayca bireysel sporların kurtarma için kaldırılabilir. Burada rekombinant perithecia ve rekombinant ahfadının kurtarma kimlik kolaylaştırmak için bir protokol mevcut.

Watch this Scientific Journal Video about Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum at JoVE.com

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Cinsel haçlar ve rekombinant döl izolasyonu, ipliksi mantar için önemli araştırma araçlarıdır<em&gt; Fusarium graminearum</em&gt;, Gerekli teknikleri başarıyla bu süreçlerin sunulmaktadır yürütmek.

Cinsel Gelişim ve askopor Deşarj Fusarium graminearum</em

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces ...

sexual-development-and-ascospore-discharge-in-fusarium-graminearum

Research

JoVE Journal

Biology

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

21.8K Görüntüleme.  Michigan State University. Cinsel haçlar ve rekombinant döl izolasyonu, ipliksi mantar için önemli araştırma araçlarıdır Fusarium graminearum, Gerekli teknikleri başarıyla bu süreçlerin sunulmaktadır yürütmek.

Video: Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

Gibberella zeae Ascospore Üretim ve Tahsilat Mikroarray deneyler için.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Biyoloji

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

Meme Tümörleri IVIS Spektrum kullanarak in vivo Bioluminescent Görüntüleme

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Dayak Kalp görselleştirme Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürü ve Bakım

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

İnsan Embriyonik Kök Hücreler Donma ve Çözülme

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

Toksin İndüksiyon ve Protein Ekstraksiyonu Fusarium Spp.</emProteomik Araştırmalar> Kültürler

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Fare Modeller Meme Bezi Geliştirme ve Fonksiyon Değerlendirme

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

Kombine DNA-RNA Floresan<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH) Farklılaştırılmış Kadın Fare Embriyonik Kök Hücreleri X kromozomu inaktivasyonu Eğitim için

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...