אנו מודים לד&quot;ר Takahiko מאטסודה למתן pCAG-mCherry לבנות. YCM נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה מטעם קרן Schweppe ומענק מקרן וייטהול.

1. אספקת הכנה (לא וידאו) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול 1X חדש של סטרפטומיצין / פניצילין (עט / דלקת) ב 1X PBS. לא יותר מ 50 מ&quot;ל הכרחי. לסנן עם מסנן 0.22 מזרק מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בונה הזרקת ידי שילוב בונה פלסמיד הרצוי. שמנו את כל המבנים של וקטור pCAG, דגל עם stoichiometry המתאים לנפח הסופי של μL 10 ~. כמו כן, pCAG-GFP 14 או pCAG-mCherry יש להוסיף ליעילות electroporation מעקב תאים electroporated. אנו משתמשים pCAG-mCherry לצורך ניסוי זה. לבסוף, מוסיפים 0.22 מיקרומטר, סינון צבע ירוק מהיר לתוך תערובת הדנ&quot;א פלסמיד בריכוז הסופי של 0.05% כדי להמחיש את יעילות הזרקה לתוך המוח האמצעי חומוס עובריים. </li></ol> 2. הכנת ביצה (וידאו) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לרכוש בשלב HH 11 עוברים, ביצים יש מודגרות ב 100 מעלות (37.8 מעלות צלזיוס) במשך כ 41 שעות לאחר ההפריה עם לחות 25-40%. מקוםביצים על הצד שלהם ולסמן את החלק העליון של כל עם קורטוב עיפרון. מכניסים מגשים מחומם מראש, חממה humidified. אט אט רוק ביצים על ידי הגדרת הפונקציה מפנה של חממה פלטפורמות &quot;אוטומטית&quot;. בדוק את רמת לחות מים כל 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממש לפני תחילת הניסוי, הסר ביצים מ בחממה ומשאירים בטמפרטורת החדר. זה יעזור להאט את ההתפתחות ולמנוע את הפיתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את פני השטח של כל ביצה עם 70% אתנול ו לנגב עם Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו שתי חתיכות 4 ס&quot;מ של נייר דבק ושמים אותם בצד ליד השני על ביצה לעשות מלבן גדול על מקף את העיפרון. להחליק את הסרט על הביצה. זה המקום בו חלון ייעשה. הקלטת ימנע חתיכות קטנות של קליפת מליפול כאשר החלון הוא חתך פתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מזרק 10 מ&quot;ל ו - 18 ½ מחט מד לצייר 5 מ&quot;ל של אלבומין את הביצה. אחרי חודרות את הקליפה, מסובב את המחט מן החלמון לא להפריעאו לגרום נזק לעובר תוך הסרת אלבומין. יש לנקות את המחט עם אתנול 70% בין הביצים, אך הקפד מחט יבש לפני חודרות את הביצה הבאה. </li></ol> 3. מחט זכוכית הכנה הזרקה (וידאו) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטים הזרקת מבוצעים באמצעות ההגדרות הבאות ב לוהטים / בראון micropipette פולר (דגם סאטר מכשיר P-97): מחממים 670, משוך 120, לוול ךיב 40, שעה 165. העולם Precision מכשירים (API) 4 אינץ&#39; 1.0 מ&quot;מ רזה הקיר זכוכית נימי (API TW100F-4) משמש כדי להפוך את המחטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מחט זכוכית משך באמצעות פיפטה P10 ו עצה ארוך נימי טוען פיפטה עצה (Eppendorf 5242956.003). טען μL 5-10, תלוי כמה ביצים יש להזריק. מלאו את המחט לאט זכוכית, יצירת טור מתמשך של פתרון פלסמיד הנעדר של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את המחט טעון בעל מחט מחוברת micromanipulator (Narishige MM3) ו III Picospritzer microinjector. הצג את המחט מתחת dissectiעל מיקרוסקופ לקצץ את המחט בנקודה שבה נוזל ירוק עוצר. זה עוזר להשתמש רקע כהה כדי להמחיש טוב יותר את המחט. מחט זמירה נכונה מגיע עם התרגול. </li></ol> 4. המוח התיכון / הזרקת בצינור העצבי (וידאו) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים האביב לקצץ 2-2.5 ס&quot;מ קוטר החלון ביצה. הפעל את חלון מחור המחט הקודם עשה כאשר ציור אלבומין, ולסובב את הביצה ביד תוך כדי לחתוך. הקפידו לנקות את המספריים עם Kimwipe רווי באתנול 70% בין הביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את העוברים חומוס תחת מיקרוסקופ לנתיחה. ייתכן שיהיה צורך להכשיר את העיניים. זה עשוי לעזור כדי להמחיש את העובר על ידי הזרקת 0.22 מיקרומטר, מסוננים 20% דיו הודו PBS תחת העובר חומוס. עם זאת, מצאנו כי שלב זה יש להימנע במידת האפשר, כפי שהוא נוטה להפחית את הישרדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרקת עובד הכי טוב אם העובר ממוקמת במקביל לנתיב של מחט, עם הראש מחוץ המחט.לאט לאט פירס בצינור העצבי בזווית של 45 מעלות עד צומת המוח התיכון, למוח האחורי. זה קריטי מאוד רק למלא את שלפוחית ​​עצבית המייצג את המוח התיכון עם ה-DNA פלסמיד וצבע ירוק מהיר, ללא דיפוזיה משמעותית לתוך אזורי המוח הקדמי ו למוח האחורי. התחל עם מערכת הזרקת משך microinjector של Picospritzer של 25 מילישניות, זה ייתכן שיהיה צורך לשנות בהתאם מחט זמירה. באופן כללי, השתמש בין 10-50 MS. </li></ol> 5. Electroporation (וידאו) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזור מחט ההזרקה. מקום 3 טיפות של פן דלקת 1X / בתמיסה PBS בביצה על העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ההגדרות של electroporator BTX EMC830: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מתח: </td><td> 20 V </td></tr><tr><td> PULSE זמן: </td><td> 25 ms </td></tr><tr><td> מס &#39;קטניות: </td><td> 3 </td></tr><tr><td> מרווח: </td><td> 500 ms </td></tr><tr><td> קוטביות: </td><tד חד קוטבי&gt; </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את האלקטרודות 2 מ&quot;מ פלטינה ארוכים בצורת ברמה אופקית כמו החלק התחתון של הצינור העצבי, עם המוח התיכון עובריים יושב באמצע בין 3 מ&quot;מ 2 מזה אלקטרודות. יישור האלקטרודות עם החלק התחתון של הצינור העצבי הוא קריטי electroporation יעיל של המוח התיכון הגחון. כדי להשיג המוח התיכון ספציפי electroporation, החלפנו את האלקטרודות BTX מקוריים עם שני מחוייט L בצורת אלקטרודות פלטינה עם 2 טיפים קצרים ארוכים מ&quot;מ. אלקטרודות אלו פלטינה עשויים 0.5mm פלטינה חוטים בקוטר (אלפא Aesar). אלו אלקטרודות פלטינה הם רק מספיק זמן כדי לכסות את המוח התיכון של העובר 11 חומוס הבמה, שזה בערך 0.9 מ&quot;מ אורך, ללא מיקוד חלק ניכר המוח הקדמי או האזורים למוח האחורי. לחץ footswitch BTX פעם אחת. בועות האוויר צריך להיות שנוצר סביב האלקטרודות עם כל electroporation מוצלח. מוציאים בזהירות את האלקטרודות מן הביצה ולנגב ציודאת האודות עם Kimwipe 70% אתנול מכוסה. מניחים עוד 3 טיפות פן 1X / פתרון דלקת בביצה, על העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את החלון עם 5 ס&quot;מ X 5 ס&quot;מ חלקים של סרט אריזה ברור. יש להקפיד לאטום את הביצה היטב כי תוכן הביצים לא לבוא במגע עם הקלטת. </li></ol> 6. לדגור קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הביצים אל תוך החממה. ודא הפיכת חממה פלטפורמות כבוי. דגירה הביצים עד לשלב הרצוי HH 23 מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיים עוברים קציר ומניחים אותם PBS-מלא מאכלים נפוצים פטרי עבור כל תנאי. מסך שנקטפו עוברים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתיחה, שמירה על עוברים רק עם הביטוי mCherry. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים לתוך בארות האישיים של מנה של 24 באר. ממלאים כל טוב עם 1 מ&quot;ל של 2% paraformaldehyde טריים (PFA) ולאפשר לתקן 2-3 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עוברים קבועים שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד ב PBS. עוברים מקום ברצף אניn 15% סוכרוז ו 30% עד equilibrated. עוברים יהיה בתחילה לצוף סוכרוז, אבל ישקעו על איזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לבדוק את העוברים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתיחה, רישום הערות על דפוס ביטוי mCherry ורמת עבור כל העובר. שבץ כל העובר על אוקטובר זה קריטי מאוד עוברים להתמצא כראוי ליצירת אופטימליים לחצות המוח התיכון חלקים עבור ניתוחים שלאחר מכן (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 18 חלקים עבים באמצעות מיקרומטר המוח התיכון cryostat CM3050S לייקה. לנתח את התפתחות המוח התיכון והבחנה נוירון דופאמין על ידי immunostaining עם סמנים הסוג המתאים סלולריים. </li></ol> 7. נציג תוצאות ייצוג שבתרשים של electroporating וניתוח המוח התיכון חומוס עובריים מוצג באיור 1. עוברי חומוס הזריק בהצלחה electroporated, ביטוי mCherry צריך להיות גלוי באזור המוח התיכון לאחר פיתוח נוסף ( <strong&gt; איור 2 א, ב, ג). בהנחה mCherry בקורלציה עם ביטוי של שיתוף electroporated גנים אחרים, עוברים בתערוכה ביטוי mCherry נכונה אז יכול להיות קבוע ומוטבעים להכין cryosections המוח התיכון למחקר נוסף (איור 2 ד). בדרך כלל, כ 50% אבות המוח התיכון הגחון עצביים ניתן transfected ביעילות עם הפרוטוקול הנ&quot;ל. מפרט הגורל דופאמין ב אבות עצביים electroporated ניתן לבדוק על ידי איתור משותף של mCherry, הדגל מתויג הגן, עם סמנים דופאמין נוירונים כמו hydroxylase טירוזין (TH) (איור 3). דפוסים של תחומים אב של המוח התיכון הגחון יכול להיחקר על ידי שיתוף immnostaining cryosections עם סמנים תחומים שונים אב. הביטוי mCherry עולה כי אין מספיק גנים מחוץ לרחם הם כנראה לא הביע ביעילות. עוברים תחת מצב זה לא אמור לשמש למחקרים נוספים. באופן דומה, עוברים את זהלא שרדו עד סוף הליך ניסיוני לא ניתן להשתמש בהם איסוף נתונים וניתוח. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig1.jpg" /> באיור 1. איור של המוח התיכון חומוס העוברית ב assay electroporation לג&#39;ימי. HH בשלב 11 עוברים חומוס עובריים מוזרקים עם pCAG-mCherry יחד עם גנים של עניין מעורבב עם ירוק מהר כדי להמחיש את תהליך ההזרקה (א &#39;). אחרי מלא בונה DNA, המוח האמצעי הם electroporated עם electroporator גל מרובע. עוברים מודגרת נוספת עד הרצויה בשלב HH 23 הוא הגיע. אז mCherry חיובי עוברים נקצרים קבועה, ומוטבעים (ב &#39;). Cryosections המוח התיכון מוכנים עם חיתוך מטוסים שמציינים קו לבן 1B איור, ונותחו על ידי immunostaining עם סמנים המוח התיכון כגון hydroxylase טירוזין (TH) (ג). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן</a>כדי להציג דמות גדולה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig2.jpg" /> איור 2. הכנת cryosections של המוח התיכון חומוס העוברית. לאחר דגירה 41 שעות, HH 23 הבמה חומוס עוברים המבטאים mCherry וגנים של עניין נקצרים (A, B ו-C), קבוע עם PFA, מטופלים עם סוכרוז, ו מוטבע אוקטובר עבור cryosectioning. עוברים חומוס מכוונים בקפידה כדי להבטיח את הכנת חלקים המוח התיכון. מורפולוגיה העובר טיפוסי המטוס חיתוך לקבלת חלקים המוח התיכון מוצגים (ד &#39;). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> . <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig3.jpg" /> איור 3. ניתוח של חלקים במוח התיכון electroporated. Cryosections מעוברים עם רמות גבוהות של ביטוי mCherry () ערוכים מוכתם antibodIES כי מכירות הדגל מתויג הגן של עניין (ב &#39;) דופאמין במוח התיכון נוירון סמן TH (C). המוח האמצעי עובריים electroporated עם pCAG-mCherry ו-pCAG דגל וקטור ריק לשמש מלאה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> .

<ol>
	<li>Wightman, R. M., Robinson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+changes+in+mesolimbic+dopamine+and+their+association+with+'reward'.">Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'.</a> J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).</li><li>Kelley, A. E., Berridge, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroscience+of+natural+rewards:+relevance+to+addictive+drugs.">The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs.</a> J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).</li><li>Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathophysiology+of+Parkinson's+disease.">Molecular pathophysiology of Parkinson's disease.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).</li><li>Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine,+depression+and+antidepressants.">Dopamine, depression and antidepressants.</a> Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).</li><li>Sesack, S. R., Carr, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+prefrontal+cortex+inputs+to+dopamine+cells:+implications+for+schizophrenia.">Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia.</a> Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).</li><li>Ang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+midbrain+dopaminergic+neuron+development.">Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development.</a> Development. 133, 3499-3506 (2006).</li><li>Andersson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intrinsic+determinants+of+midbrain+dopamine+neurons.">Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons.</a> Cell. 124, 393-405 (2006).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Series+of+Normal+Stages+in+the+Development+of+the+Chick+Embryo.">A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo.</a> J. Morphol. 88, 49 (1951).</li><li>Bellairs, R., Osmond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The atlas of chick development. , (2005).</li><li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Shocking'+developments+in+chick+embryology:+electroporation+and+in+ovo+gene+expression.">'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li><li>Momose, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+in+vivo+gene+transfer+using+intraarterial+plasmid+DNA+injection+following+in+vivo+electroporation.">High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation.</a> Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).</li><li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Ovo+Electroporations+of+HH+Stage+10+Chicken+Embryos.">In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).</li><li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo.">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39, 73-78 (2004).</li></ol>

החוקרים אין אינטרסים מנוגדים פוטנציאליים לחשוף.

ב electroporation לג&#39;ימי של המוח התיכון חומוס עובריים מציע עלות נמוכה אלטרנטיבה מהירה לדור של בעלי חיים מהונדס או בנוקאאוט לבצע מחקר vivo של פונקציות גנים בהתפתחות המוח התיכון דופאמין נוירון. שימוש מ&quot;מ קצר 2 אלקטרודות פלטינה ארוכים בצורת יחד עם הזרקת ה?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> עוף ביצים מופרות </td><td> צ&#39;ארלס ריבר מעבדות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ביצה חממה </td><td> GQF ייצור </td><td> 1502 ספורטאי </td><td></td></tr><tr><td> BTX Electroporator </td><td> BTX הרווארד Apparatus </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> אלקטרודות </td><td> BTX הרווארד Apparatus </td><td> 45-0162 L בצורת genetrodes </td><td> לשימוש עם electroporator ECM830 </td></tr><tr><td> אירידיום פלטינום חוט </td><td> אלפא Aesar </td><td> # 10056 </td><td> 0.5 מ&quot;מ קוטר להכנת 2 אלקטרודות ארוכות מ&quot;מ </td></tr><tr><td> צינור זכוכית נימי </td><td> Precision העולם כלי </td><td> TW100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader פיפטה עצה </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956.003 </td><td></td></tr><tr><td> הודו דיו </td><td> סטייפלס </td><td></td><td> לסנן 20% לפני השימוש </td></tr><tr><td> Microinjector </td><td> פארקר אוטומציה, פארקר Hannifin שיתוף פעולה </td><td> Picospritzer III </td><td></td></tr><tr><td> דיסקציה מיקרוסקופ פלואורסצנטי </td><td> Leica </td><td> MZ16F </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette חולץ </td><td> סאטר Instrument </td><td> D-97 </td><td></td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation in chick midbrain for studying gene function in dopaminergic neuron development

נוירונים דופאמינרגיים הנמצאים בתנועה המוח התיכון הגחון שליטה, התנהגות רגשית, מנגנוני תגמול 1-3. תפקוד לקוי של המוח התיכון הגחון דופאמין נוירונים הוא מעורב מחלת פרקינסון, סכיזופרניה, דיכאון, דמנציה 1-5. לכן, לימוד ויסות התמיינות המוח התיכון דופאמין נוירון לא רק מספקים תובנה חשובה לתוך מנגנוני ויסות התפתחות המוח התיכון ואת המפרט עצבית גורל אבי, אלא גם לעזור לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול במגוון הפרעות עצביות אדם. נוירונים דופאמינרגיים להבדיל בין אבות עצביים המצפים את אזור החדר של המוח התיכון הגחון העוברית. הפיתוח של אבות עצביים נשלטת על ידי תוכניות ביטוי גנים 6,7. כאן אנו מדווחים על ניצול טכניקות electroporation לבטא גנים בפרט המוח התיכון הבמה המילטון (HH) המבורגר 11 (הsomites irteen, 42 שעות) ועוברים חומוס 8,9. פיתוח חיצוני של עוברים חומוס מאפשר מניפולציות ניסיוניים נוחים בשלבים עובריים ספציפיים, עם השפעות שנקבעו בנקודות זמן ההתפתחות לאחר מכן 10-13. חומוס צינורות עובריים עצביים מוקדמים יותר בשלב HH 13 (תשע עשרה somites, 48 ​​שעות) מורכב אבות עצביים multipotent המסוגלים להבדיל את סוגי תאים שונים של מערכת העצבים. וקטור pCAG, המכיל גם מקדם CMV ו חומוס β-אקטין משפר, מאפשר ביטוי חזק של דגל או בונה epitope-מתוייגים אחרים צינורות חומוס עובריים עצביים 14. בדו&quot;ח זה, אנו מדגישים באמצעים מיוחדים על מנת להשיג ביטוי גנים מוגבל לאזור של המוח התיכון עובריים אבות דופאמין נוירונים, כולל כמה להזריק DNA בונה במיוחד לאזור המוח התיכון עובריים וכיצד לאתר electroporation עם מחוייט אלקטרודות קטנות. ניתוח גהמוח התיכון כפרי בשלבים מאוחרים יותר מספק מצוין במערכת vivo עבור וקטור פלסמיד בתיווך רווח פונקציה של ואובדן-of-פונקציה מחקרים של התפתחות המוח התיכון. שינוי של מערכת הניסוי רשאי להאריך את assay לחלקים אחרים של מערכת העצבים לביצוע מיפוי וניתוח גורל לחקירת ויסות של ביטוי גנים.

Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development at JoVE.com

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

כדי להעריך את תפקוד רגולציה של גנים במהלך ההתפתחות של נוירונים המוח התיכון דופאמין, אנו מתארים שיטה המערבת<em&gt; ב לג&#39;ימי</em&gt; Electroporation של מבנים DNA פלסמיד לתוך עובריים הגחון חומוס המוח התיכון אבות נוירונים דופאמין. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי להשיג ביטוי יעיל של גנים בעלי עניין לחקור היבטים שונים של התפתחות המוח התיכון והבחנה נוירון דופאמין.

ב electroporation לג&#39;ימי של המוח התיכון צ&#39;יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

in-ovo-electroporation-chick-midbrain-for-studying-gene-function

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

11.3K Views.  Children's Hospital of Chicago Research Center. כדי להעריך את תפקוד רגולציה של גנים במהלך ההתפתחות של נוירונים המוח התיכון דופאמין, אנו מתארים שיטה המערבת ב לג'ימי Electroporation של מבנים DNA פלסמיד לתוך עובריים הגחון חומוס המוח התיכון אבות נוירונים דופאמין. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי להשיג ביטוי יעיל של גנ?...

Video: In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

יישום של מוליכות קולטן NMDA במוח התיכון נוירונים עכברוש דופאמין באמצעות טכניקה הצמד הדינמי

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

בביטוי אוב של microRNA בגחון צ&#39;יק מוח התיכון

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In vivo ג&#39;ין העברה בתאי שוואן בעצב מכרסמים Sciatic ידי Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

בתחום ההדמיה סידן Vivo של קו הצד תאים שיער בזחל דג זברה

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

תפקוד המוח לומד אצל ילדים באמצעות מגנטואנצפלוגרפיה

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...