Ringraziamo il Dott. Takahiko Matsuda per la fornitura del pCAG-mCherry costruire. YCM è supportata da un Career Development Award da parte della Fondazione Schweppe e una sovvenzione dalla Fondazione Whitehall.

1. Preparazione di alimentazione (non in video) <ol><li> Preparare una diluizione fresca 1X della penicillina / streptomicina (Pen / Strep) in 1X PBS. Non più di 50 mL è necessario. Filtrare con un filtro di 0,22 micron siringa. </li><li> Preparare costrutti iniezione combinando desiderati costrutti plasmidici. Abbiamo messo tutti i costrutti nel pCAG-Flag vettore con stechiometria appropriata per un volume finale di circa 10 L. Inoltre, pCAG GFP-14 o pCAG-mCherry dovrebbe essere aggiunto per il monitoraggio e l&#39;efficienza elettroporazione cellule elettroporate. Usiamo pCAG-mCherry per questo esperimento. Infine, aggiungere 0,22 pm di colorante filtrata Fast Green nella miscela di DNA plasmidico ad una concentrazione finale di 0,05% per visualizzare l&#39;efficienza di iniezione in midbrains pulcino embrionali. </li></ol> 2. Egg Preparazione (in video) <ol><li> Al fine di acquisire fase HH 11 embrioni, le uova devono essere incubate a 100 ° F (37,8 ° C) per circa 41 ore dopo la fecondazione con il 25-40% di umidità. Postouova dalla loro parte e segnare l&#39;inizio di ciascuna con un trattino matita. Mettere vassoi in un pre-riscaldato, incubatore umidificato. Lentamente oscillare uova impostando la funzione di incubatore di svolta delle piattaforme su &quot;Automatico&quot;. Controllare il livello di umidità e acqua ogni 24 ore. </li><li> Proprio prima di iniziare l&#39;esperimento, togliere le uova dal incubatore e lasciare a temperatura ambiente. Ciò contribuirà a rallentare lo sviluppo e prevenire sullo sviluppo. </li><li> Pulire la superficie di ciascun uovo con il 70% di etanolo e pulire con un Kimwipe. </li><li> Prendete due pezzi 4 cm di nastro adesivo e attaccarli side-by-side sulle uova per fare un grande rettangolo sopra il cruscotto matita. Lisciare il nastro contro l&#39;uovo. Questa è la finestra in cui sarà fatto. Il nastro impedirà piccoli pezzi di guscio d&#39;uovo di cadere quando la finestra è tagliata aperta. </li><li> Utilizzare una siringa da 10 ml e 18 ½ gauge per disegnare 5 ml di fuori albumina dell&#39;uovo. Dopo aver forato il guscio, inclinare l&#39;ago dal tuorlo per non disturbareo danneggiare l&#39;embrione durante la rimozione di albumina. Pulire l&#39;ago con etanolo al 70% tra le uova, ma essere sicuri che l&#39;ago sia asciutto prima di forare l&#39;uovo successivo. </li></ol> 3. Glass Needle preparazione di iniezione (in video) <ol><li> Gli aghi da iniezione sono realizzati utilizzando le seguenti impostazioni su un Flaming / Brown Micropipetta Puller (modello Instrument Sutter P-97): Heat 670, Pull 120, Vel 40, ora 165. Mondiale Precision Instruments (API) 4 pollici 1,0 millimetri di vetro sottile parete capillare (API TW100F-4) è usato per fare gli aghi. </li><li> Caricare un ago di vetro tirato con una pipetta P10 e la lunga punta capillare carico della punta di pipetta (Eppendorf 5.242.956,003). Caricare pl 5-10, a seconda di quanti uova deve essere iniettato. Riempire l&#39;ago vetro lentamente, creando una colonna continua di soluzione plasmide assente di bolle d&#39;aria. </li><li> Posizionare l&#39;ago caricato nel supporto dell&#39;ago attaccato al micromanipolatore (Narishige MM3) e la Picospritzer III microiniettore. Visualizza l&#39;ago sotto uno dissectiil microscopio e tagliare l&#39;ago nel punto in cui il fluido verde si arresta. Aiuta ad utilizzare uno sfondo scuro per visualizzare meglio l&#39;ago. Dell&#39;ago corretta rifilatura viene con la pratica. </li></ol> 4. Mesencefalo / iniezione tubo neurale (in video) <ol><li> Usare le forbici per tagliare una molla finestra 2-2,5 cm di diametro nell&#39;uovo. Avviare la finestra dal foro dell&#39;ago precedente fatta al momento dell&#39;elaborazione di albumina, e ruotare l&#39;uovo in mano, come si taglia. Assicurarsi di pulire le forbici con un Kimwipe saturo in etanolo al 70% tra le uova. </li><li> Visualizza embrioni di pollo al microscopio di dissezione. Può essere necessario formare gli occhi. Può essere utile per visualizzare l&#39;embrione iniettando 0,22 micron-filtrata inchiostro del 20% in India PBS sotto dell&#39;embrione di pollo. Tuttavia, abbiamo trovato che questo passo dovrebbe essere evitato se possibile, in quanto tende a diminuire sopravvivenza. </li><li> Iniezione funziona meglio se l&#39;embrione è posizionato parallelamente al percorso dell&#39;ago, con la testa fuori dall&#39;ago.Lentamente forare il tubo neurale con un angolo di 45 gradi al mesencefalo-rombencefalo giunzione. E &#39;molto critico di compilare solo la vescicola neurale che rappresenta il mesencefalo con il DNA plasmidico e Fast colorante verde, senza diffusione significativa nelle regioni del proencefalo e rombencefalo. Iniziare l&#39;iniezione con la durata del set microiniettore Picospritzer presso 25 ms, che può essere necessario modificare a seconda del taglio dell&#39;ago. In generale, utilizzare tra i 10-50 ms. </li></ol> 5. Elettroporazione (in video) <ol><li> Recuperare l&#39;ago di iniezione. Luogo 3 gocce di 1X Pen / Strep in soluzione PBS nell&#39;uovo sull&#39;embrione. </li><li> Controllare le impostazioni del elettroporatore BTX EMC830: <table border="1"><tbody><tr><td> TENSIONE: </td><td> 20 V </td></tr><tr><td> PULSE LUNGHEZZA: </td><td> 25 ms </td></tr><tr><td> N. impulsi: </td><td> 3 </td></tr><tr><td> INTERVALLO: </td><td> 500 ms </td></tr><tr><td> POLARITA: </td><td&gt; UNIPOLARE </td></tr></tbody></table></li><li> Posizionare gli elettrodi 2 mm platino lunghezza L forma allo stesso livello orizzontale il fondo del tubo neurale, con il mesencefalo embrionale seduto nel mezzo tra due 3 mm di distanza elettrodi. Allineamento gli elettrodi con il fondo del tubo neurale è critico per elettroporazione efficiente del mesencefalo ventrale. Per ottenere mesencefalo-specifica elettroporazione, abbiamo sostituito gli elettrodi originali BTX con due custom-made platino a forma di L-elettrodi con punte corte 2 mm di lunghezza. Questi elettrodi di platino sono fatti di fili di platino 0,5 mm di diametro (Alfa Aesar). Questi elettrodi di platino sono solo abbastanza a lungo per coprire il mesencefalo di un embrione stadio 11 pulcino, che è di circa 0,9 mm di lunghezza, senza prendere di mira la maggior parte del prosencefalo o le regioni rombencefalo. Premete l&#39;interruttore a pedale BTX una volta. Le bolle d&#39;aria deve essere generato attorno agli elettrodi con ogni elettroporazione di successo. Rimuovere con cautela gli elettrodi dall&#39;uovo e pulire il elettrodi con un Kimwipe etanolo al 70% coperto. Posizionare un altro 3 gocce di 1X Pen / Strep soluzione nell&#39;uovo, sull&#39;embrione. </li><li> Coprire la finestra con un 5 cm x 5 cm pezzo nastro da imballaggio trasparente. Accertarsi di sigillare l&#39;uovo bene e che il contenuto delle uova non vengano a contatto con il nastro. </li></ol> 6. Incubare e Harvest <ol><li> Mettere le uova nuovamente dentro l&#39;incubatrice. Assicurarsi che la svolta delle piattaforme incubatore è OFF. Incubare le uova fino allo stadio desiderato HH 23 è raggiunto. </li><li> Harvest embrioni vivi e metterli in comune PBS-riempite piastre di Petri per ogni condizione. Schermo embrioni raccolti sotto un microscopio a fluorescenza dissezione, mantenendo solo gli embrioni con l&#39;espressione mCherry. </li><li> Trasferire embrioni nei pozzetti individuali di un piatto ben 24. Riempire ogni pozzetto con 1 mL di appena fatto paraformaldeide al 2% (PFA) e consentono di fissare 2-3 ore a 4 ° C. </li><li> Lavare embrioni fissi tre volte per 10 minuti ciascuno in PBS. Embrioni Luogo in sequenza in 15% e 30% saccarosio fino equilibrata. Gli embrioni inizialmente galleggerà in saccarosio, ma affonderà sulla equilibrio. </li><li> Controllare gli embrioni sotto un microscopio a fluorescenza dissezione, prendendo appunti sul modello di espressione mCherry e il livello per ogni embrione. Incorpora ogni embrione in ottobre E &#39;molto critico per orientare correttamente gli embrioni per generare ottime sezioni trasversali del mesencefalo per le analisi successive (Figura 1). </li><li> Preparare 18 sezioni del mesencefalo micron di spessore utilizzando un criostato Leica CM3050S. Analizzare lo sviluppo mesencefalo e la differenziazione dei neuroni dopaminergici da immunocolorazione con i marcatori appropriati tipo di cellula. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi Una rappresentazione schematica di electroporating e analizzare mesencefalo embrionale pulcino è mostrato in Figura 1. In embrioni di pollo con successo iniettati ed elettroporati, espressione mCherry dovrebbe essere visibile nella regione del mesencefalo, dopo un ulteriore sviluppo ( <strong&gt; Figura 2A, B, C). Supponendo che mCherry correla con l&#39;espressione di altri geni co-elettroporate, embrioni espongono espressione corretta mCherry può quindi essere fissato e incorporato per preparare criosezioni mesencefalo per ulteriore studio (Figura 2D). Generalmente, circa il 50% dei progenitori mesencefalo ventrale neurali possono essere efficacemente trasfettate con il protocollo sopra. La specificazione del destino dopaminergica in elettroporate progenitori neurali possono essere esaminato dalla co-localizzazione di mCherry, Flag-tag gene, con marcatori neurone dopaminergico, quali tirosina idrossilasi (TH) (Figura 3). Il patterning dei domini progenitrici nel mesencefalo ventrale può essere indagato dalla co-immnostaining criosezioni con diversi marcatori di dominio progenitrici. Espressione mCherry insufficiente suggerisce che i geni ectopici sono probabilmente non ha espresso in modo efficiente. Gli embrioni in questa condizione non deve essere utilizzato per ulteriori studi. Allo stesso modo, gli embrioni chenon sopravvivono alla fine della procedura sperimentale non può essere utilizzata per la raccolta e l&#39;analisi dei dati. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig1.jpg" /> Figura 1. Illustrazione del mesencefalo pulcino embrionale nel test elettroporazione ovo. HH stadio 11 embrioni di pollo embrionali sono iniettati con pCAG-mCherry insieme a geni di interesse mescolato con il verde veloce per visualizzare il processo di iniezione (A). Dopo aver riempito di costrutti di DNA, sono midbrains elettroporate con un elettroporatore onda quadra. Gli embrioni sono ulteriormente incubati fino desiderata fase HH 23 è raggiunto. Poi mCherry-positivi embrioni vengono raccolte, fisso e integrato (B). Criosezioni mesencefalo sono preparati con taglio piani indicati dalla linea bianca in figura 1B, e analizzati mediante immunocolorazione con marcatori mesencefalo come tirosina idrossilasi (TH) (C). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig1large.jpg" target="_blank">clic qui</a>per ingrandire figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig2.jpg" /> Figura 2. Preparazione di criosezioni da mesencefalo pulcino embrionale. Dopo 41 ore di incubazione, HH stadio 23 embrioni di pollo e mCherry esprimono geni di interesse vengono raccolte (A, B e C), fissato con PFA, trattata con saccarosio, e incorporato in OCT per criosezionamento. Embrioni di pollo sono accuratamente orientato da garantire la preparazione di sezioni mesencefalo. Una morfologia tipica embrione e il piano di taglio per ottenere sezioni del mesencefalo sono mostrati (D). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig3.jpg" /> Figura 3. Analisi di sezioni elettroporate mesencefalo. Criosezioni da embrioni con alti livelli di espressione mCherry (A) sono preparati e colorati con anticorpiies che riconoscono il Flag-tag gene di interesse (B) e il mesencefalo marcatore dei neuroni dopaminergici TH (C). Midbrains embrionali elettroporate con pCAG-mCherry e pCAG-Flag vettore vuoto servono come controllo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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Gli autori non hanno interessi in conflitto potenziale da dichiarare.

L&#39;elettroporazione in ovo di mesencefalo pulcino embrionale offre un basso costo e rapida alternativa alla generazione di animali transgenici o knockout per eseguire studio in vivo delle funzioni geniche in sviluppo mesencefalo dopaminergica neurone. Uso breve 2 millimetri elettrodi di platino lunghezza L-forma insieme embrionale mesencefalo-specifica iniezione del DNA è la chiave per ottenere l&#39;espressione efficiente del gene di interesse in mesencefalo progenitori neuroni dopaminergici. Inol...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Uova di gallina fecondate </td><td> Charles River Laboratories </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Egg incubatore </td><td> GQF Manufacturing </td><td> 1502 Sportsman </td><td></td></tr><tr><td> BTX Elettroporatore </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> Elettrodi </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> 45-0162 a forma di L genetrodes </td><td> Per l&#39;utilizzo con ECM830 elettroporatore </td></tr><tr><td> Platinum filo di iridio </td><td> Alfa Aesar </td><td> # 10056 </td><td> 0,5 millimetri di diametro Per rendere i 2 mm di lunghezza elettrodi </td></tr><tr><td> Vetro tubo capillare </td><td> Mondo Precision Instrument </td><td> TW100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader punta di pipetta </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956.003 </td><td></td></tr><tr><td> Inchiostro di china </td><td> Staples </td><td></td><td> Filtrare il 20% prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Microiniettore </td><td> Parker Automation, Parker Hannifin cooperazione </td><td> Picospritzer III </td><td></td></tr><tr><td> Dissezione microscopio a fluorescenza </td><td> Leica </td><td> MZ16F </td><td></td></tr><tr><td> Micropipetta puller </td><td> Sutter Instrument </td><td> D-97 </td><td></td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation in chick midbrain for studying gene function in dopaminergic neuron development

Neuroni dopaminergici situati nel movimento mesencefalo ventrale di controllo, il comportamento emozionale e meccanismi di ricompensa 1-3. La disfunzione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo ventrale è implicata nella malattia di Parkinson, la schizofrenia, la depressione e la demenza 1-5. Così, studiando la regolazione della differenziazione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo non ha potuto fornire solo informazioni importanti meccanismi che regolano lo sviluppo mesencefalo e il destino progenitrici neurali specifiche, ma anche contribuire a sviluppare nuove strategie terapeutiche per il trattamento di una varietà di malattie neurologiche umane. Neuroni dopaminergici differenziarsi dai progenitori neurali che rivestono la zona ventricolare del embrionale mesencefalo ventrale. Lo sviluppo di progenitori neurali è controllato da programmi di espressione genetica 6,7. Qui segnaliamo che utilizzano tecniche di elettroporazione ad esprimere geni in particolare nel mesencefalo di Hamburger Hamilton (HH) stadio 11 (thsomiti irteen, 42 ore) 8,9 embrioni di pollo. Lo sviluppo degli embrioni di pollo esterna consente una comoda manipolazioni sperimentali in specifiche fasi embrionali, con gli effetti determinati in tempi successivi di sviluppo 10-13. Chick tubi embrionali neuronali precedenti alla fase di HH 13 (diciannove somiti, 48 ore) sono costituiti da multipotenti progenitori neurali che sono in grado di differenziarsi in diversi tipi di cellule del sistema nervoso. Il vettore pCAG, che contiene sia un promotore CMV e un pulcino β-actina enhancer, permette l&#39;espressione solida di bandiera o di altri costrutti epitopo-tag in tubi neurali embrionali di pollo 14. In questa relazione, vogliamo sottolineare misure speciali per realizzare l&#39;espressione genica regionalmente limitato embrionali progenitori dei neuroni dopaminergici del mesencefalo, tra cui come iniettare DNA costruisce in particolare nella regione del mesencefalo embrionale e come individuare elettroporazione con piccoli elettrodi di misura. Analisi cmesencefalo Hick nelle fasi successive fornisce un ottimo sistema di vivo per vettore plasmidico-mediata guadagno di funzione e la perdita di funzione studi di sviluppo mesencefalo. Modifica del sistema sperimentale può estendere il saggio in altre parti del sistema nervoso per eseguire la mappatura analisi destino e per indagare la regolazione dell&#39;espressione genica.

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In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Per valutare la funzione e la regolazione dei geni durante lo sviluppo dei neuroni dopaminergici mesencefalo, si descrive un metodo che comporta<em&gt; In ovo</emElettroporazione&gt; di costrutti di DNA plasmidico in mesencefalo ventrale embrionali di pollo progenitori dei neuroni dopaminergici. Questa tecnica può essere utilizzata per ottenere l&#39;espressione efficiente di geni di interesse per studiare diversi aspetti dello sviluppo e differenziamento mesencefalo neuroni dopaminergici.

In elettroporazione ovo nel mesencefalo Chick per lo Studio la funzione dei geni nello sviluppo dopaminergici Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

11.4K Views.  Children's Hospital of Chicago Research Center. Per valutare la funzione e la regolazione dei geni durante lo sviluppo dei neuroni dopaminergici mesencefalo, si descrive un metodo che comporta In ovo di costrutti di DNA plasmidico in mesencefalo ventrale embrionali di pollo progenitori dei neuroni dopaminergici. Questa tecnica può essere utilizzata per ottenere l'espressione efficiente di geni di interesse per studiare diversi aspetti dello sviluppo e differenziamento mesencefalo neu...

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Ricerca

Neuroscienze

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Culture Slice organotipica del mesencefalo ventrale embrionali: un sistema per studiare dopaminergici sviluppo neuronale In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

In Expression Ovo di MicroRNA in Ventrale Chick Mesencefalo

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

Nel calcio in Vivo Imaging delle cellule ciliate linea laterale in Zebrafish larvale

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

Studiare la funzione del cervello in bambini che usando magnetoencefalografia

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Analisi kinematica 3D per la valutazione funzionale nel modello di ratto di lesioni da schiacciamento del nervo sciatico

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...