우리는 pCAG-mCherry가 만들지 제공해 주셔서 박사 Takahiko 마츠다 감사드립니다. YCM은 Schweppe 재단의 경력 개발 대상과 관청 재단의 교부금에 의해 지원됩니다.

1. (없는 동영상)를 준비를 공급 <ol><li> 1X PBS의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / Strep)의 신선한 1X 희석을 준비합니다. 더 이상 50 ML이 필요합니다. 0.22 μm의 주사기 필터로 필터링합니다. </li><li> 원하는 플라스미드 구조를 결합하여 사출 구조를 준비합니다. 우리는 ~ 10 μL의 최종 볼륨에 맞는 stoichiometry로 pCAG - 국기 벡터의 모든 구조를 넣어. 또한 pCAG-GFP 14 pCAG-mCherry는 추적 electroporation 효율과 electroporated 세포에 추가됩니다. 우리는이 실험 pCAG-mCherry을 사용합니다. 마지막으로, 태아의 여자는 midbrains로 주입 효율을 시각화하는 0.05 %의 최종 농도에서 플라스미드 DNA의 혼합물에 0.22 μm의 - 여과 빠른 그린 염료를 추가합니다. </li></ol> 2. 계란 준비 (비디오) <ol><li> HH 단계가 11 배아를 얻기 위해서는, 계란이 100에서 incubated해야 ° F (37.8 ° C) 25-40% 습도와 배입니다 41 시간 정도입니다. 장소그들의 측면에 계란 연필 대시로 각각의 상단을 표시합니다. 사전 예열, humidified 인큐베이터에서 트레이를 놓습니다. 천천히으로 인큐베이터 플랫폼의 회전 기능을 설정하여 난자를 흔들 &quot;자동.&quot; 습도와 물 수준의 24 시간마다 확인합니다. </li><li> 마우스 실험을 시작하기 전에, 인큐베이터에서 알을 제거하고 실온에 둡니다. 이것은 개발 속도를 느리게하고 개발을 통해 방지하는 데 도움이 될 것입니다. </li><li> 70 % 에탄올로 각 계란의 표면을 깨끗이하고 Kimwipe로 아래로 닦으십시오. </li><li> 스카치 테이프의 두 4cm의 조각을 가지고 연필 대쉬 이상의 큰 사각형을 만들기 위해 계란 위에 나란히 붙어 있어라. 계란에 대한 테이프를 부드럽게. 창이 이루어집니다 곳입니다. 테이프 창이 열려있는자를 때 떨어지부터 달걀 껍질의 작은 조각을 방지할 수 있습니다. </li><li> 10 ML의 주사기와 18시 계란의 알부민 밖의 5 ML을 그릴 수있는 게이지 바늘을 사용합니다. 방해하지 않도록로 쉘을 피어싱 후, 노른자에서 떨어져 바늘 각도알부민 제거하는 동안이나 배아가 손상될. 계란 사이에 70 % 에탄올로 바늘을 청소하지만 바늘이 다음 계란을 피어싱하기 전에 건조해야합니다. </li></ol> 3. 유리 사출 니들 준비 (비디오) <ol><li> 주입 바늘이에서 다음 설정을 사용하여 만들어진 브라운 Micropipette 풀러 (셔터의 인스 트루먼트 모델 P-97) / 불타는 : 열량 670, 끌어 오기 120 벨 40 시간 165가. 세계 정밀 계측기 (API) 4 인치 1.0 mm 얇은 벽을 모세관 유리 (API TW100F-4)은 바늘을 만드는 데 사용됩니다. </li><li> P10 피펫과 장기 팁 모세관로드 피펫 팁 (Eppendorf 5242956.003)을 사용하여 가져온 유리 바늘을로드합니다. 주입해야 얼마나 많은 계란에 따라 5-10 μL를로드합니다. 공기 거품의 부재 플라스미드 솔루션의 지속적인 열을 만드는 천천히 유리 바늘을 채웁니다. </li><li> micromanipulator (Narishige MM3)와 Picospritzer III microinjector에 부착된 바늘 홀더에 로드된 바늘을 놓습니다. dissecti 아래 바늘보기현미경에서와 녹색 액체가 중지 지점에서 바늘을 잘라. 그것은 더 바늘을 시각화하기 위해 어두운 배경을 사용하는 데 도움이됩니다. 트리밍 적절한 바늘 연습이 함께 제공됩니다. </li></ol> 4. Midbrain / 신경 튜브 주입 (비디오) <ol><li> 계란의 2-2.5 cm 직경 창을 잘라 봄 가위를 사용하십시오. 알부민을 그릴 때 만든 이전 바늘 구멍에서 윈도우를 시작하고 잘라내으로 손에 계란을 돌린다. 계란 사이에 70 % 에탄올에 포화 Kimwipe으로 가위를 청소해야합니다. </li><li> 해부 현미경 하에서 여자의 배아를 볼 수 있습니다. 그것은 눈을 훈련해야 할 수도 있습니다. 그것은 여자의 배아 아래 PBS에 0.​​22 μm의 - 여과 20% 인도 잉크를 주입함으로써 배아를 시각화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 가능하다면 그것이 생존을 감소시키는 경향으로이 조치는, 피해야만 것으로 나타났습니다. </li><li> 태아가 바늘의 경로를 병렬로 배치되는 경우 사출 거리 바늘의 머리와 함께 잘 작동됩니다.천천히 피어스 midbrain-hindbrain 접합에 45도 각도로 신경 튜브. 단지 forebrain 및 hindbrain 지역으로 크게 확산없이 플라스미드 DNA와 빠른 그린 염료로 midbrain을 나타내는 신경 소포를 작성하는 것은 매우 중요합니다. 25 MS에서 Picospritzer microinjector의 기간 세트 주사 시작, 이것은 바늘이 트리밍에 따라 변경해야 할 수도 있습니다. 일반적으로 10-50 MS 사이에 사용하십시오. </li></ol> 5. Electroporation (동영상) <ol><li> 주사 바늘을 검색합니다. 장 소 배아에서 난자의 PBS 용액에서 1X 펜 / Strep의 3 드랍스. </li><li> BTX EMC830의 electroporator의 설정을 확인하십시오 : <table border="1"><tbody><tr><td> 전압 : </td><td> 20 V </td></tr><tr><td> 펄스 길이 : </td><td> 25 MS </td></tr><tr><td> # 펄스 : </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 간격 : </td><td> 500 MS </td></tr><tr><td> 극성 : </td><tD&gt; UNIPOLAR </td></tr></tbody></table></li><li> 둘을 갈라놓 3mm 전극 사이의 중간에 앉아 배아 midbrain과 함께 신경 튜브의 바닥과 같은 수평 레벨에서 2mm L-모양의 긴 백금 전극을 배치합니다. 신경 튜브의 바닥과 함께 전극을 정렬하면 복부 midbrain의 효율적인 electroporation에 중요합니다. midbrain 특정 electroporation을 달성하기 위해, 우리는 짧은 2mm 길이 팁 두 개의 사용자 정의 만든 백금 L-모양의 전극으로 원래 BTX 전극을 대체했습니다. 이러한 백금 전극은 0.5mm 직경 백금 와이어 (알파 Aesar)으로 만들어집니다. 이러한 백금 전극은 충분히 많은 forebrain 또는 hindbrain 지역의 타겟팅을하지 않고 길이 약 0.9 mm이며 무대 11 여자의 배아의 midbrain을 가릴 수 있습니다. BTX footswitch을 한 번 누르십시오. 공기 방울은 각 성공적인 electroporation과 전극 주위에 생성되어야한다. 조심스럽게 난자에서 전극을 제거하고 electr 닦아70 % 에탄올 덮여 Kimwipe 달아 odes. 배아에서 난자의 1X 펜 / Strep 솔루션의 또 다른 3 방울을 넣으십시오. </li><li> 투명 포장 테이프 X 5cm 조각 5cm로 창을 커버. 물론 그 달걀을 봉쇄하라는 계란 내용이 테이프와 접촉하지 않도록하십시오. </li></ol> 6. 부화 및 수확 <ol><li> 인큐베이터에 다시 계란을 넣습니다. 인큐베이터 플랫폼의 모퉁이가 꺼져 있는지 확인하십시오. 원하는 HH 단계 23이 달성될 때까지 알을 품어. </li><li> 추수 생활 배아는 각각의 조건에 관한 일반적인 PBS-채워진 배양 접시에 넣어. 화면 mCherry 표현식에서만 배아를 유지, 형광 해부 현미경 하에서 배아를 수확. </li><li> 24 잘 요리의 개별 우물로 배아를 전송합니다. 갓 만들어진 2 % paraformaldehyde (PFA) 1 ML 각 우물을 입력하고 4에 2~3시간를 해결할 수 있도록 ° C. </li><li> 십분 PBS에 각각 고정 배아 세 번 씻는다. 장소 배아 순차적 IN 15% 및 equilibrated까지 30 % 자당. 태아는 처음 자당에 떠 있지만 평균시 싱크됩니다. </li><li> 각각의 배아에 대한 mCherry 표현 패턴과 수준에 메모를 복용, 형광 해부 현미경 하에서 배아를 확인하십시오. 10월 각 배아를 포함시킵니다. 그것은 제대로 후속 분석 (그림 1)에 대한 최적의 midbrain의 크로스 섹션을 생성하여 동양의 배아에 매우 중요합니다. </li><li> Leica CM3050S의 그라 이오 스탯을 사용하여 18 μm의 두께 midbrain 섹션을 준비합니다. 적절한 셀 타입의 마커로 immunostaining하여 midbrain 개발 및 dopaminergic 신경 세포의 분화를 분석합니다. </li></ol> 7. 대표 결과 태아의 여자는 midbrain을 electroporating 및 분석 도표 표현은 그림 1에 표시됩니다. 성공적으로 주입하고 electroporated 여자는 배아에서 mCherry 표현은 앞으로의 개발 이후 midbrain 지역에서 볼 수 있어야합니다 ( <stronG&gt; 그림 2A, B, C). mCherry 다른 공동 electroporated 유전자의 표현과 연결합니다라고 가정한다면 적절한 mCherry 표현을 전시 배아 그런 다음 고정 및 진학 (그림 2D)에 midbrain의 cryosections을 준비하기 위해 임베디드 수 있습니다. 일반적으로 복부 midbrain 신경 progenitors의 약 50 %가 효율적으로 위의 프로토콜로 transfected 수 있습니다. electroporated 신경 progenitors의 dopaminergic 운명의 사양 mCherry의 공동 지방화 검사를받을 수 같은 티로신 Hydroxylase (TH) (그림 3)와 같은 dopaminergic 신경 세포 마커와 함께 유전자를 깃발 태그를 지정했습니다. 복부 midbrain의 시조 도메인의 patterning이 다른 시조 도메인 마커와 공동 immnostaining의 cryosections 조사 수 있습니다. 부족 mCherry 표현은 자궁외 유전자 가능성이 효과적으로 표현하지 않는 것이 좋습니다. 이 조건 하에서 태아도 더 공부를 사용할 수 없습니다. 마찬가지로, 배아 그실험 절차의 끝에 생존하지 않은 것은 데이터 수집 및 분석을 위해 사용할 수 없습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig1.jpg" /> 그림 1. 비켜 electroporation 분석의 배아 여자는 midbrain의 일러스트. HH 단계 11 배아 여자는 배아는 () 사출 공정을 시각화하는 빠른 녹색 섞인 관심있는 유전자 함께 pCAG-mCherry으로 주입됩니다. DNA의 구조 가득 후 midbrains는 사각형 웨이브 electroporator로 electroporated있다. 원하는 HH 단계 23에 도달할 때까지 태아도 더 incubated됩니다. 그런 다음 mCherry - 긍정적인 배아는 수확 고정 및 임베디드 (B)됩니다. Midbrain의 cryosections는 그림 1B의 흰색 라인에 표시된 비행기를 절단으로 준비하고, 같은 티로신 Hydroxylase (TH) (C)와 같은 midbrain 표시에 immunostaining으로 분석된다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig1large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오</a>큰 그림을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig2.jpg" /> 그림 2. 배아 여자는 midbrain에서 cryosections의 작성. 41시간 보육 후에 mCherry 및 관심있는 유전자를 표현 HH 단계 23 여자의 배아는 PFA로 고정되어 자당로 치료하고, cryosectioning 위해 10월에 박혀 (A, B 및 C) 수확한다. 칙의 배아는 신중 midbrain 섹션의 준비를 보장하기 위해 지향하고 있습니다. midbrain 섹션을 얻기위한 전형적인 배아 형태 및 절단 비행기 (D) 표시됩니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig3.jpg" /> 그림 3. electroporated midbrain 섹션의 분석. mCherry 표현의 높은 수준과 배아에서 Cryosections은 () antibod 함께 준비하고 묻은 게있다관심의 국기 태그가 추가된 유전자 (B) 및 midbrain dopaminergic 신경 세포 마커 TH (C)를 인식 이거야. pCAG - mCherry 및 pCAG - 국기 빈 벡터 제어의 역할과 electroporated 배아의 midbrains 있습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> .

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Ovo+Electroporations+of+HH+Stage+10+Chicken+Embryos.">In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).</li><li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo.">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39, 73-78 (2004).</li></ol>

저자는 공개하지 잠재적인 충돌 관심이 없습니다.

태아의 여자는 midbrain의 비켜 electroporation의는 낮은 비용과 midbrain dopaminergic 신경 세포 개발의 유전자 기능의 생체내 연구에서 수행하는 유전자 변형 또는 녹아웃 동물의 생성에 대한 빠른 대안을 제공합니다. 배아 midbrain 특정 DNA를 주입 함께 짧은 2mm에게 패 모양의 긴 백금 전극을 사용하면 midbrain dopaminergic 신경 세포의 progenitors에 대한 관심의 유전자의 효율적인 표현을 달성하기위?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 수정된 닭고기 달걀 </td><td> 찰스 리버 연구소 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 계란 인큐베이터 </td><td> GQF 제조 </td><td> 1502 운동가 </td><td></td></tr><tr><td> BTX Electroporator </td><td> BTX 하버드 장치 </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> 전극 </td><td> BTX 하버드 장치 </td><td> 45-0162 L-모양의 genetrodes </td><td> ECM830 electroporator 함께 사용하기위한 </td></tr><tr><td> 플래티넘 이리듐 와이어 </td><td> 알파 Aesar </td><td> # 10056 </td><td> 0.5 밀리미터 직경 2mm 긴 전극을 만들기위한 </td></tr><tr><td> 유리 모세관 </td><td> 세계 정밀 악기 </td><td> TW100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader 피펫 팁 </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956.003 </td><td></td></tr><tr><td> 먹물 </td><td> 스테이플 </td><td></td><td> 사용하기 전에 20 %를 필터링 </td></tr><tr><td> Microinjector </td><td> 파커 자동화, 파커 Hannifin 협력 </td><td> Picospritzer III </td><td></td></tr><tr><td> 형광등 해부 현미경 </td><td> Leica </td><td> MZ16F </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette 풀러 </td><td> 셔터의 악기 </td><td> D-97 </td><td></td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation in chick midbrain for studying gene function in dopaminergic neuron development

복부 midbrain 제어 운동에 위치 Dopaminergic 뉴런, 정서적 행동, 및 보상 메커니즘 1-3. 복부 midbrain dopaminergic 신경 세포의 기능 장애는 파킨슨병, 정신 분열증, 우울증 및 치매 1-5 연관되어 있습니다. 따라서, midbrain dopaminergic 신경 세포의 분화의 조절을 연구하는 것은 midbrain 개발 및 신경 전구 운명 사양을 조절 메커니즘에 중요한 통찰력을만을 제공할 수 없습니다뿐만 아니라, 인간의 신경 장애의 다양한 치료를위한 새로운 치료 전략을 개발하는 데 도움이됩니다. Dopaminergic 뉴런은 배아 복부 midbrain의 심실 영역에 즐비한 신경 progenitors에서 차별화. 신경 progenitors의 개발은 유전자 발현 프로그램 6,7에 의해 제어됩니다. 여기 (일 햄버거 해밀턴 (HH) 무대 11 midbrain에서 구체적으로 유전자를 표현하는 electroporation을 활용한 기술을보고irteen somites, 42 시간) 여자는 배아 8,9. 여자는 태아의 외부 개발은 나중에 발달 타임 포인트 10-13에서 결정된 효과를 특정 배아 단계에서의 편리하고 실험적인 조작을 위해 수 있습니다. 이전 HH 스테이지 13 (열아홉 somites 48 시간)보다 칙 배아 신경 튜브는 신경 시스템의 서로 다른 세포 유형으로 구별 능력이있다 multipotent 신경 progenitors로 이루어져 있습니다. CMV 프로 모터와 여자는 β-actin 향상제 모두 포함 pCAG 벡터는 국기 또는 배아 병아리 신경 튜브 14 기타 에피토프 태그가 추가된 구조의 강력한 표현을 허용합니다. 이 보고서에서 우리는 유전자가 배아 midbrain 지역으로 구체적으로 구성하고 어떻게 소규모 맞춤 전극과 electroporation를 정확하게하는 투입 방법을 포함하여 배아 midbrain dopaminergic 신경 세포의 progenitors에서 지역 제한된 유전자 발현을 달성할 수 있도록 특별한 조치를 강조한다. C 분석나중 단계에서 시골 midbrain는 플라스미드 벡터 중재의 이득의 기능 및 midbrain 개발 손실의 기능 연구를위한 생체내 시스템에 탁월한를 제공합니다. 실험 시스템의 변경은 운명 매핑 분석을 수행과 유전자 발현의 규정을 조사하는 신경계의 다른 부분에 검정을 연장할 수 있습니다.

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In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

기능과 midbrain dopaminergic 뉴런의 발달 동안 유전자의 규정을 평가하기 위해 관련된 방법을 설명<em&gt; 비켜에서</em배아 병아리 복부 midbrain의 dopaminergic 신경 세포의 progenitors로 플라스미드의 DNA 구조의&gt; electroporation. 이 기술은 midbrain 개발 및 dopaminergic 신경 세포의 분화의 다양한 측면을 연구하는 데 관심있는 유전자의 효율적인 표현을 달성하는 데 사용할 수 있습니다.

Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

in-ovo-electroporation-chick-midbrain-for-studying-gene-function

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

11.4K 조회수.  Children's Hospital of Chicago Research Center. 기능과 midbrain dopaminergic 뉴런의 발달 동안 유전자의 규정을 평가하기 위해 관련된 방법을 설명 비켜에서 electroporation. 이 기술은 midbrain 개발 및 dopaminergic 신경 세포의 분화의 다양한 측면을 연구하는 데 관심있는 유전자의 효율적인 표현을 달성하는 데 사용할 수 ?...

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

연구

신경과학

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

복부 병아리 중뇌에있는 마이크로 RNA의 오보, 식

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

애벌레 Zebrafish의 측면 라인 세포의 생체 내 칼슘 이미징

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

Magnetoencephalography를 사용 하 여 아이 들에 있는 두뇌 기능을 공부

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Sciatic 신경 호감 상해의 쥐 모형에 있는 기능 평가를 위한 3D 운동학 분석

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...