אנו מודים לחברים אחרים בצוות INSA-ENS iGEM ליון (ויויאן Chansavang, מתילדה דומונד, אלכסנדר Duprey, מלאני ז&#39;פרואה, קלמנס Gonthier, מרגו Jaulin, Aurélie Haag, קונג Goki, תומאס Poinsot, תרשיש Royer ברטרנד, ג&#39;ולי Soula, מיכאל Vonzy הפיר איב זונדל, Soufiane Bouhmadi, אוליבייה Brette, גאל Chambonnier, לורה אייזךד, Aurianne Kroiss, פיליפ ג&#39;ן, Agnès רודריג, ארנו Rondelet, סילבי Reverchon וואלרי Desjardin), הספונסרים שלנו לתמיכה הכספית שלהם (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-ליון והמחלקה לBiosciences INSA-ליון), פ Wisniewski-דיי לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה וSze CC ד&quot;ר למתנת לחץ. ב &#39;שרוול עוגן מקבל תואר דוקטור מלגה מאזור Rhône-Alpes.

1. עיצוב וסינתזה של Biobrick Curli אופרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הארגון הגנטי ולמקם את אותות התעתיק וtranslational אנדוגני של גני curli. ידיעות אלו נאספים במאגרי מידע מיוחדים כגון RegulonDB או EcoGene ב והשלימו על ידי קריאה מדוקדקת של פרסומים הנוגעים לעניין. ניהול נתונים ובpreanalysis סיליקו בוצע עם תוכנת מנהל המשובטים ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את רצפי קידוד הרלוונטיים. סט של חמישה גנים דרושים לחלוטין לcurli סינתזה (csgB ומונומרים סיבי קידוד csgA) ויצוא (csgE csgF וcsgG, קידוד מורכב ההפרשה התעגלה) נבחרו לבנות אופרון הסינטטי. חלץ את הרצפים שנבחרו ממאגר המידע בפורמט FASTA. כצביר csgGFE הוא antisense בE. גנום חיידק, להמיר את הרצף הזה לcounterp המשלים ההפוךאמנות באמצעות כלי תפעול המנהל המשובט&gt; מולקולת תהליך&gt; הפוך מולקולה. הדבק את רצף csgEFG מאחורי csgBA באמצעות הפונקציה &quot;לקשור&quot; (Clone&gt; לקשור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף האמרגן המתאים. על ידי צבת חמישה גני curli הנבחרים תחת שליטה של אמרגן P RCN, curli הם חזו להיות מיוצר מעל בנוכחותו של קובלט וניקל. RCN הלוקוס מקודד משאבה אחראית לסילוק הרעלים וניקל Co (rcnA) ורגולטור metallo מאותו המקור שלה (rcnR) זרימה. RcnR שולט ביטוי של rcnA וגן משלו בתגובה לניקל ולשיתוף 19. רצף RCN כולל CDS rcnR, כל אזור intergenic RCN בתוספת 41 נוקלאוטידים הראשונים של rcnA היה מול placedin של הרצף המתעתע csgBAEFG (1 איור, הרצף של כל המבנה מסופק כנתונים משלימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל את התעתיקאותות. אתר קישור הריבוזום מושלם (או RBS המושלם = AAGGAGGTATATA) נוסף בחזית ATG הראשון של רצף ה-DNA csgBA. RBS מושלם שני נוסף לפני רצף csgEFG. RBS אנדוגני לcsgB וגני csgF וcsgG היו נשמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתאים סטנדרטי iGEM, המכשיר חייב להיות מוקף בקידומת BioBrick סטנדרטית וסיומת, המכיל אתרי הגבלה לRI אקו, PST I (קידומת) וSPE אני וXba (סיומת). הדבק את הרצפים המתאימים בכל קצה של ד המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל כל RI אקו, PST, אני SPE ואתר ההכרה Xba במכשיר. כדי להקל על תהליך הרכבה נוסף, חלק BioBrick עצמו לא יכול להכיל כל ההגבלה של אתרים אלה. בניתוח הגבלת סיליקו של המכשיר מתגלה 1 Pst אני אתר ברצף csgA, אתר ש1 Pst ברצף rcnRואתר אחד Eco RI בגן csgE. אתרים אלה ממוקמים בהתאמה בעמדה 80 (Mut1), 1340 (Mut2) ו -1830 (Mut3) של רצף ההתקנים (נתונים משלימים) ושונו כפי בצע על ידי מוטציות שקטות. אתר Mut1 Pst אני CTGCAG השתנה בCGTCTG אתר Mut2 Pst אני CTGCAG השתנה בCAGCAG GAATTC Mut3 Eco RI האתר השתנה בGAATT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלה באמצעות סימולצית התרגום באמצעות תוכנת Clone Manager (המבצע&gt; מולקולות תהליך&gt; מולקולות תרגמו). השתמש יפציץ תכנית יישור הרצף כדי לוודא הומולוגיה המושלמת בין החלבון פרא סוג curli והחלבונים המקודדים על ידי אופרון הסינטטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזמן את אופרון הסינטטי. שירותי סינתזת גנים מסחריים זמינים מחברות רבות ברחבי העולם, השותף שלנו היה Genecust (לוקסמבורג). 4 מיקרוגרם של אופרון המלאכותי (3165 נ&quot;ב) התקבל כעבור כמה שבועות ונוספים לpUC57 (pIG2). </li></ol>2. המחש ולכמת חיידקי חסיד על פוליסטירן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא כל היטב של צלחת קלקר 24 היטב עם 2 מ&quot;ל של מדיום מינימאלי M63 (0.2% גלוקוז) ולחסן כל באר עם 106 תאים של תרבות לילה. חיידקים לגדול ב 30 מעלות צלזיוס במשך שעה 18-48 בלי לרעוד. כל עמודה (4 בארות) מייצגת אופנות. הוסף את הכמות הנכונה של קובלט (לפני 25 עד 100 מ&quot;מימ) ואנטיביוטיקה (אמפיצילין 100 μg.L -1) בעת צורך. את 3 השורות הראשונות של הצלחת 24 גם משמשות כדי לכמת את החיידקים חסידים על ידי חישוב ממוצע 3 חזרות, משמאל השורה האחרון משמש כדי להמחיש את biofilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 3 השורות הראשונות של הצלחת 24 היטב: לכל באר, לשחזר את supernatant המכיל את תאי פלנקטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לשטוף היטב עם כל 1 מ&quot;ל של M63 וברכה לשטוף 1 מ&quot;ל עם supernatant הראשוני שהתקבל ב2.2). ברכה זו מכונית תאים שחייה (= S). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזר biofilm במיליליטר o 1ו M63 על ידי הגירוד וpipetting למעלה ולמטה (= B). מערבולת 15 שניות. להעריך את מספר החיידקים מצורפים משטח ושחייה מהצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD600) לתת את אחוז ההיענות המתאים לכל ערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוז ההיענות מחושב על ידי שימוש בנוסחא: Bx100 / (3xS + B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לשורה האחרונה של הצלחת 24 היטב: למחוק תאי פלנקטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 1 מ&quot;ל של M63 biofilm שהתפתח בתחתית הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את הצלחת הפתוחה לשעה 1 ב 80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של 20% סגולים גביש עבור 2 דקות בכל אחד ואחרי כן על ידי שטיפות ענפות עם מים כדי להמחיש את חיידקי קרקע מצורפות. שלושה מבחנים עצמאיים (צלחות) יש לבצע כדי להבטיח שחזור. </li></ol> 3. דמיינו חיידקים חסידים על ידי זכוכית מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל מארז ניאון. ה זן דואר coli SCC1 שconstitutively מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ללא הבדל נצפה מזן ההורה MG1655 20 הוא מארח מתאים לנושא פלסמיד הסינטטי curli אופרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך SCC1 עם pIG2 פלסמיד (= הסינטטי curli אופרון מוכנס בRI אקו / Pst אני אתר של pUC57 פלסמיד) כדי להשיג את מתח S23. להפוך SCC1 עם שליטת פלסמיד (pUC18) כדי להשיג את לחץ שליטת S24 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול precultures הלילה של S23 ושל השליטה (S24) בזני 30 ° C בM63 בינוני בתוספת סוכר (0.2%) ואמפיצילין (100 μg.L -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 15 מ&quot;ל של אותו המדיום בצלחות פטרי עם 100 μl של precultures. הוסף את הריכוז המתאים של קובלט (25 מיקרומטר כלומר) ואל תשכח את השליטה השלילית ללא קובלט. להציג את coverslip זכוכית מלבנית 3 בכל צלחת פטרי. דגירת הלילה בשעת 30 ° C בלי לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslip הלוך ושובמ &#39;צלחת הפטר ולנקז אותו בזהירות. זהירות לנקות את פניו הנמוכות יותר עם דברים קטנים כותנה ספוגות אתנול ° 70 על ידי ניגוב כל שאריות חיידקים. לתצפית confocal, לנקות את שני קצוות העליונים בכמה מילימטרים כדי לאפשר קיבוע נוסף של coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיידקי חסיד ניתן דמיינו ישירות אלא במהירות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אבל בזהירות למנוע ייבוש של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתצפית confocal, להפקיד את coverslip בשקופית זכוכית עם הפנים העליונים מכוסים על ידי biofilm להציב את הפנים. אז biofilm מכוסה coverslip גדול יותר, שהוא קבוע לשקופית הזכוכית בלכה. הפוך את ההתקנה כך שbiofilm עכשיו יהיה בחלק התחתונה של פן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את ההתקנה מתחת למיקרוסקופ הליזר confocal. Axioplan2 LSM510 מיקרוסקופ ליזר ימין (Zeiss) confocal שמש באותה הפלטפורמה F Platim. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה. GFP Excite ב488 ננומטר, ולאסוף את קרינת החיידקים בטווח 500-600 ננומטר<html> . השתמש מטרת טבילת שמן 40X לרכישת תמונות בסריקת ליזר מצב confocal. סרוק את המבנים הכוללים תלת הממדיים של biofilms ממשטח המוצק לממשק עם מדיום הגידול, תוך שימוש בשלב של 1 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע תחזיות תלת ממדיות עם Imaris תוכנה (Bitplane, ציריך, שוויץ). לקבוע את עובי biofilm על ידי הניתוח של ערך z הממוצע לאורך חלקים אורכיים סטטיסטיים. כימות של biovolumes biofilm ניתן לחלץ מן confocal Z-ערימות כמתוארות במקום אחר 22. </li></ol> RegulonDB מספק מידע על ארגון המכניסטי אופרון ופירוקם ליחידות שעתוק, יזמים וסוג סיגמא, גנים והאתרים המחייבים הריבוזום, מחסלים, אתרים מחייבים של רגולטורי תעתיק ספציפיים, כמו גם הארגון שלהם לביטויים רגולטוריים.et = &quot;_blank&quot;&gt; http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp ב מסד נתוני EcoGene מכיל מידע עדכן אודות ה coli K-12 ורצפי הגנום Proteome, כולל ביבליוגרפיות גנים נרחבות. מוקד EcoGene גדול כבר ההערכה מחדש של אתרי התחלת תרגום. <a href="http://ecogene.org/" target="_blank">Http://ecogene.org/</a> ג <a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a> ד <a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix</a> מתנת דואר של צ&#39;ון צ&#39;או Sze, נאן יאנג אוניברסיטה הטכנית, סינגפור. ו Platim המיקרוסקופי פלטפורמה UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.

<ol>
	<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).</li><li>Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+sensor+cell+arrays.">Microbial sensor cell arrays.</a> Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).</li><li>Melamed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+printed+nanolitre-scale+bacterial+sensor+array.">A printed nanolitre-scale bacterial sensor array.</a> Lab Chip. 11, 139-146 (2011).</li><li>Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioremediation+of+trace+cobalt+from+simulated+spent+decontamination+solutions+of+nuclear+power+reactors+using+E.+coli+expressing+NiCoT+genes.">Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).</li><li>Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+binding+mediated+by+a+novel+class+of+surface+organelles+on+Escherichia+coli.">Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli.</a> Nature. 338, 652-655 (1989).</li><li>Prigent-Combaret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+pathway+for+biofilm+formation+in+curli-producing+Escherichia+coli+strains:+role+of+flagella,+curli+and+colanic+acid.">Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid.</a> Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).</li><li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Escherichia+coli+curli+operons+in+directing+amyloid+fiber+formation.">Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li><li>Vidal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Escherichia+coli+K-12+mutant+strain+able+to+form+biofilms+on+inert+surfaces:+involvement+of+a+new+ompR+allele+that+increases+curli+expression.">Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression.</a> J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).</li><li>Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+produced+by+Escherichia+coli+PHL628+provide+protection+from+Hg(II).">Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II).</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).</li><li>Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Zn(II),+Cu(II),+and+Fe(II)+ions+to+Alzheimer's+A+beta+peptide+studied+by+fluorescence.">Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).</li><li>Taylor, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+insights+into+curli+fiber+biogenesis.">Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis.</a> Structure. 19, 1307-1316 (2011).</li><li>Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+curli+biosynthesis+regulator+CsgD+co-ordinates+the+expression+of+both+positive+and+negative+determinants+for+biofilm+formation+in+Escherichia+coli.">The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli.</a> Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).</li><li>Pesavento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+regulatory+coordination+of+motility+and+curli-mediated+adhesion+in+Escherichia+coli.">Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli.</a> Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).</li><li>Dueholm, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillation+of+the+major+curli+subunit+CsgA+under+a+wide+range+of+conditions+implies+a+robust+design+of+aggregation.">Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation.</a> Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).</li><li>Jubelin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpxR/OmpR+interplay+regulates+curli+gene+expression+in+response+to+osmolarity+in+Escherichia+coli.">CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).</li><li>Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+biofilm+master+regulator+CsgD+in+cross-regulation+between+biofilm+formation+and+flagellar+synthesis.">Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis.</a> J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).</li><li>Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+mechanical+characterisation+of+amyloid+fibrils+discovered+in+a+natural+adhesive.">Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive.</a> J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).</li><li>Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+two+csg+operons+is+required+for+production+of+fibronectin-+and+congo+red-binding+curli+polymers+in+Escherichia+coli+K-12.">Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12.</a> Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).</li><li>Blaha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Escherichia+coli+metallo-regulator+RcnR+represses+rcnA+and+rcnR+transcription+through+binding+on+a+shared+operator+site:+Insights+into+regulatory+specificity+towards+nickel+and+cobalt.">The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt.</a> Biochimie. 93, 434-439 (2011).</li><li>Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+fluorescence+system+for+flow+cytometric+analysis+of+Escherichia+coli+transcriptional+response+in+multi-species+context.">Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context.</a> J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution.">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Perrin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+promotes+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+K-12+strains+that+produce+curli.">Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).</li><li>Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+populations+expressing+three+different+autofluorescent+proteins+in+the+rhizosphere:+new+perspectives+for+studying+microbial+communities.">Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).</li><li>Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C., Callow,, J., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological Adhesives. , (2006).</li><li>Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+architecture+of+sixty+opportunistic+pathogens+deciphered+using+a+high+throughput+CLSM+method.">The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method.</a> J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).</li><li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Calgary+Biofilm+Device:+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms.">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li><li>Harrison, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microscopy+and+three-dimensional+visualization+to+evaluate+the+structure+of+microbial+biofilms+cultivated+in+the+Calgary+Biofilm+Device.">The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device.</a> Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).</li><li>Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+device+for+rapid+evaluation+of+biofilm+formation+potential+by+bacteria.">A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria.</a> J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).</li><li>Miller, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experiments in molecular genetics. , (1972).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שלבים קריטיים השלב הקריטי ביותר בגישת הביולוגיה הסינטתית הזה הוא עיצוב הגן. עיצוב גן סינטטי יש להקפיד על מנת להבטיח ייצור מערכת יעילה. שני גנים המקודדים את מונומרים סיבים ושלושה גני מקודדי חלבונים מעורבים במערכת ההפרשה שלהם כבר ה?...

היצמדות חיידקים לתמיכת אביוטי ממלא תפקיד מרכזי בתאי דלק bioremediation, biocatalysis או חיידקים. תהליכי bioremediation להשתמש ביכולות של מיקרואורגניזמים לבזות חומרים אורגניים, או כדי לשנות את חלוקת המתכת (קיבוע, volatilization) או התפצלות. פעילויות מועילות אלו שנצפו במערכות אקולוגיות ימיות ויבשתיות, אלא גם במערכות המלאכותיות שפותחו לטיפול במים מזוהמים בפסולת תעשייתית וביתית. העצמה והאיכות של פעילות החיידקים תלויים בגורמים הפיסיקליים כימיים, אלא גם על אורח החיים של מיקרואורגניזמים (חסר בסיס או מוטבע לתוך biofilm). היווצרות biofilm קשורה חילוף חומרי קידום התנגדות לביוצידים ידי מנגנונים מגוונים. תופעה זו לכן יש לעודד ברוב תהליכי bioremediation. יתר על כן, תאי coli Escherichia הנדסה לשלוט על היווצרות biofilm כבר מיושמים בהצלחהחיישנים לשתק כל התאים בbiochips 2-3. הסתגלות של מיקרואורגניזמים לריכוז גבוה של מתכות מתרחשת באמצעות מנגנונים מגוונים כגון ספיחה למרכיבים תאיים מטריקס, הפעלת משאבת זרימה או לספקים מסוגלים להתרכז המתכת לתוך התא. גברת פעילות חיידקים אלה באמצעות הנדסה גנטית מאפשרת טיפול יעיל וזול של זיהום מתכות בקנה מידת המעבדה, במיוחד במקרה של מתכות רעילות ביותר בכמות חלשה כפי שתואר על ידי הראגו et al. 2008 4. תיקון חיידקים מייצג במקרה זה שיטת חיסכון תחרותית ועלות בהשוואה לתהליכים כימיים קלסיים באמצעות רפי חילוף יונים. החוקרים תארו א מארז coli מהונדס גנטי לספיגה ואצירה 1 קובלט יפרוץ את זרימת משאבת הקידוד הגנטי rcnA, ולאחר מכן על ידי שינוי עם עותק רב המאפשרים ייצור יתר של פלסמידטרנספורטר עם ספיגה מועדפת לקובלט. כזה מתח מופיע כחלופה יעילה לרפי חילוף יונים לטיפול בשפכים רדיואקטיביים, אך בעיה לא נפתרה מפתח היא ההתאוששות של חיידקים מזוהמים בסופו של התהליך 4. המטרה של העבודה שלנו הייתה אפוא מהנדסת זן מותאם אישית מעוצב תוכל להיצמד לתומך אביוטי כגון זכוכית או פלסטיק. בין המערך השלם של adhesins ונמצא מולת חסיד זיהתה בחיידקי גראם, בחרו לעצב מערכת המאפשרת ייצור curli. Curli הם סיבי עמילואיד דקים (2-5 קוטר ננומטר) ומדדים המאוד שבולט מE. חיידק סלמונלה ופני שטח כמטריצת גבישים שאינם מסיסה ו5-7. Curli מעורב גם בקולוניזציה של משטחי אביוטי והפיתוח של biofilms 8. Curli הוצגו לאחרונה לאגד כספיים יונים 9. Amyloids ידוע אכן להחזיק גבוהזיקה ליוני מתכות כגון Cu 2 +, Zn 2 + ו 3 + 10 פה. מאפיין זה עשוי לשפר עוד יותר את הטיהור של שפכים מזוהמים מתכת. אשכול CSG אחראי לייצור של סיבי curli והוא מכונן בשתי operons divergently תעתיקים (איור 1). CsgB, גני csgC csgA ומהווים אופרון התחושה, קידוד שתי יחידות curli, CsgA וCsgB. CsgC נראה שמעורב בפעילות חיזור בתוך מערכת biogenesis curli ולהשפיע על התנהגות CsgG נקבובית 11. עם זאת, היעדר csgC ברוב המכריע של חיידקי curli לייצור מצביע על כך שהחלבון המקביל מספק רק רמת secundary שליטת biogenesis curli. כדי לפשט את המערכת, אנחנו כבר בחרנו לעבוד עם המספר המינימאלי של גנים. CsgDEFG operonencodes חלבונים חיוניים בוויסות והתחבורהשל CsgA וCsgB על פני התא. CsgD הוא activator תעתיק של אופרון csgBAC וממלא תפקיד מרכזי בשליטה על היווצרות biofilm על ידי שליטה על הייצור של רכיבים ונמצא מולת curli biofilm אחרים כגון 12 תאיים ועל ידי דיכוי ייצור השוטון 13. CsgE, CsgF וCsgG מהווים מנגנון הפרשה curli ספציפי ב- הקרום החיצוני שדרכו החלבון העיקרי CsgA מקטע curli מופרש כחלבון מסיס. פילמור של CsgA תלוי in vivo על nucleator חלבון CsgB קרום הנכנס (שנסקר ב14). מסלולים רגולטוריים שונים הכוללים מספר מערכות שני מרכיבים הוכחו לשלוט ביטוי curli גן 15-16. תקנות מורכבות אלה מאפשרות לחיידקי טופס biofilms העבה באמצעות ייצור curli בתגובה לאותות סביבתיים, אך קשים לשלוט עבור יישומים תעשייתיים. כדי להקל על ההתאוששות נפגשהאל ממולא חיידקים בתהליך תעשייתי, קיבוע חיידקים לתמיכה מוצקה אכן צריך להיות מבוקר על ידי פרמטר מוגדר היטב (הים). המאפיינים החסידים של curli צמודים ל17 טבע עמילואיד ויכולים לשמש כדי לשפר את תהליכי bioremediation, אבל מכשיר פשוט ובקלות מבוקר יש ליצור. בין 7 גנים 18 אלה, קבוצה של 5 גנים נדרשת לcurli סינתזה (csgB ומונומרים סיבי קידוד csgA) ויצוא (csgE csgF וcsgG, קידוד מורכב הפרשת curli) בהחלט נבחרו לבנות אופרון הסינטטי. כדי להימלט מהרגולציה &quot;הטבעית&quot; של curli, אופרון סינטטי הכולל 5 גני CSG אלה תחת השליטה של אמרגן חזק וoverinducible קובלט (איור 2) תוכנן ומסונתז. ניתוח שלב אחר השלב באזור curli הקידוד ועיצוב ההליך לsyn פונקציונליהאוהד אופרון מתואר. שתי שיטות כדי לחזות ולכמת היצמדות חיידקים לקלקר וזכוכית מוסברות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td> pUC57 (pMB1 אורים, 2710 נ&quot;ב) עם בר 3165 נ&quot;ב EcoRI / PstI המכיל P RCN הסינטטי - csgBAEFG אופרון; Amp r </td></tr><tr><td> pUC18 </td><td></td><td></td><td> Multicopy פלסמיד (pMB1 אורים, 2686 נ&quot;ב), המגבר r </td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1 (= GFP מתויג-MG1655, מתנת CC Sze) / pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td> CoCl 2 </td><td> סיגמא </td><td></td><td> מניית פתרון 0,1 M נשמר בטמפרטורת חדר </td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </td&gt; </tr><tr><td> צלחת 24 היטב </td><td> Nunc </td><td> 55429 </td><td> צלחות קלקר 24 גם </td></tr></tbody></table>

engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon

השיטה המתוארת כאן מורכבת בעיצוב מחדש של ה תכונות היצמדות coli על ידי הרכבת המספר המינימאלי של גני curli תחת השליטה של אמרגן חזק והמתכת overinducible, ובהדמית וכימות הרווח כתוצאה של דבקות בקטריאלי. שיטה זו חלה עקרונות הנדסיים מתאימים של הפשטה ותקינה של ביולוגיה סינטתית, ותוצאות בBBa_K540000 Biobrick (המכשיר הכי חדש Biobrick, הנדסה, iGEM 2011). הצעד הראשון מורכב בעיצוב של אופרון הסינטטי מוקדש לייצור יתר curli בתגובה למתכת, ולכן בהגדלת יכולות ההיצמדות של הזן הפראי הסוג. המקורי curli אופרון שונה בסיליקון ועל מנת לייעל את אותות תעתיק וtranslational ולברוח רגולציה &quot;הטבעית&quot; של curli. גישה זו אפשרה לבדיקה בהצלחת ההבנה הנוכחית שלנו של ייצור curli. Moreover, לפשט את רגולצית curli ידי מעבר האמרגן המורכב אנדוגני (יותר מ 10 רגולטורי תעתיק מזוהה) לאמרגן פשוט מתכת מוסדרת גורם דבקות הרבה יותר קלה לשלוט. השלב השני כולל הערכה איכותית וכמותית של יכולות דבקות על ידי יישום של שיטות פשוטות. שיטות אלו חלות על מגוון רחב של חיידקים חסידים ללא קשר למבנים ביולוגיים המעורבים בהיווצרות biofilm. מבחן דבקות בצלחות קלקר 24 גם מספק הדמיה ראשונית מהירה של biofilm החיידקים לאחר צביעה סגולה גביש. מבחן איכותי זה יכול להיות מחודד על ידי הכימות של אחוז הדבקות. שיטה כזאת היא מאוד פשוטה אך מדויקת יותר מכתים סגולה גביש רק כפי שתואר לעיל 1 עם שתי דירות ושחזור טובים. ויזואליזציה של חיידקי ה-GFP-tagged על שקופיות זכוכית על ידי קרינה או conf הליזרמיקרוסקופיה ocal מאפשרת לחזק את התוצאות שהתקבלו במבחן הצלחת 24 היטב על ידי תצפית ישירה של התופעה.

בביאור סיליקו של רצף CSG הסוג הפראי של א &#39; coli K12 קשור עם אופטימיזציה של אותות תעתיק וtranslational אפשר לעצב היחיד הסינטטי curli אופרון P RCN-CSG מוצג באיור 3 (רצף מלא בנתונים משלימים). פרוטוקול 2 ו 3 פרוטוקול שמשו כדי להמחיש ולכמת דבקות ייצור הקשורים לcurli...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon at JoVE.com

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

העיצוב של קידוד סינטטי אופרון גם מנגנון ההפרשה ומונומרים המבניים של סיבי curli מתואר. ייצור יתר של amyloids אלה ופולימרי חסיד מאפשר מדידת רווח של היצמדות של<em&gt; א coli</em&gt; מארז<sup&gt; 1</sup&gt;. דרכים קלות כדי לחזות ולכמת דבקות מוסברות.

הנדסת חיידקי חסיד ידי יצירת Curli אופרון סינטטי יחיד

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

engineering-adherent-bacteria-creating-single-synthetic-curli

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K Views.  Université de Lyon. העיצוב של קידוד סינטטי אופרון גם מנגנון ההפרשה ומונומרים המבניים של סיבי curli מתואר. ייצור יתר של amyloids אלה ופולימרי חסיד מאפשר מדידת רווח של היצמדות של א coli מארז 1. דרכים קלות כדי לחזות ולכמת דבקות מוסברות.

Video: Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

נוהל הנדסה ריאות

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing material properties 1. Normal voice production relies on healthy tissue and vocal folds, and occurs as a result of complex coupling between aerodynamic, structural dynamic, and acoustic physical phenomena. Voice disorders affect up to 7.5 million annually in the United States alone 2 and often result in significant financial, social, and other quality-of-life difficulties. Understanding the physics of voice production has the potential to significantly benefit voice care, including clinical prevention, diagnosis, and treatment of voice disorders.
Existing methods for studying voice production include in vivo experimentation using human and animal subjects, in vitro experimentation using excised larynges and synthetic models, and computational modeling. Owing to hazardous and difficult instrument access, in vivo experiments are severely limited in scope. Excised larynx experiments have the benefit of anatomical and some physiological realism, but parametric studies involving geometric and material property variables are limited. Further, they are typically only able to be vibrated for relatively short periods of time (typically on the order of minutes).
Overcoming some of the limitations of excised larynx experiments, synthetic vocal fold models are emerging as a complementary tool for studying voice production. Synthetic models can be fabricated with systematic changes to geometry and material properties, allowing for the study of healthy and unhealthy human phonatory aerodynamics, structural dynamics, and acoustics. For example, they have been used to study left-right vocal fold asymmetry 3,4, clinical instrument development 5, laryngeal aerodynamics 6-9, vocal fold contact pressure 10, and subglottal acoustics 11 (a more comprehensive list can be found in Kniesburges et al. 12)
Existing synthetic vocal fold models, however, have either been homogenous (one-layer models) or have been fabricated using two materials of differing stiffness (two-layer models). This approach does not allow for representation of the actual multi-layer structure of the human vocal folds 1 that plays a central role in governing vocal fold flow-induced vibratory response. Consequently, one- and two-layer synthetic vocal fold models have exhibited disadvantages 3,6,8 such as higher onset pressures than what are typical for human phonation (onset pressure is the minimum lung pressure required to initiate vibration), unnaturally large inferior-superior motion, and lack of a "mucosal wave" (a vertically-traveling wave that is characteristic of healthy human vocal fold vibration).
In this paper, fabrication of a model with multiple layers of differing material properties is described. The model layers simulate the multi-layer structure of the human vocal folds, including epithelium, superficial lamina propria (SLP), intermediate and deep lamina propria (i.e., ligament; a fiber is included for anterior-posterior stiffness), and muscle (i.e., body) layers 1. Results are included that show that the model exhibits improved vibratory characteristics over prior one- and two-layer synthetic models, including onset pressure closer to human onset pressure, reduced inferior-superior motion, and evidence of a mucosal wave.

The methodology for fabricating synthetic vocal fold models is described. The models are life-sized and mimic the multi-layer structure of the human vocal folds. Results show the models to self-oscillate at pressures comparable to lung pressure and demonstrate flow-induced vibratory responses that are similar to those of human vocal folds.

סינטטי, רב שכבתיים, עצמי מתנודדת ווקאלי דגם Fold ייצור

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

שיפוע צפיפות רבה שכבתי פלמור (DGMP): שיטה חדשנית ליצירת תא בעל מספר, פיגומים להנדסת רקמות להתאמה אישית

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

זיהוי אופטי של<em&gt; א coli</em&gt; חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות על ידי מלקחיים אופטיים

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

הנדסת רקמות ידי עצמותי כלי דם בתוך<em&gt; In vivo</em&gt; הנדסת רקמות קאמרית

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

הכרה מולקולרית הנדסה עם פולימרים ביו-מימטיים על פחמן Walled יחיד

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.