הראינו שהגנומים הנגיפיים של הקבוצה הרביעית מקודדים קטעים קצרים של רצפי חלבונים מארחים. רצפים אלה ניתן למצוא בתוך אתרי מחשוף פרוטאז ויראלי. הם משמשים להרס ממוקד של חלבונים מארחים, בדרך כלל חלבונים המעורבים ביצירת התגובות החיסוניות.
היתרון העיקרי של שימוש ב- protease assays הוא שהוא מסיר את המורכבות של תא ומראה אם פרוטאז ויראלי יכול לחשוף רצף מסוים. לכן, כאשר ניתחנו רצפי זיקה SSHHPS, מצאנו כי פרוטאז יכול לחתוך רצפים חלבונים המעורבים ביצירת תגובות חיסוניות, כי חלק חלבונים אלה היו גם תפקידים בהתפתחות המוח והעין. בעת ביצוע טכניקה זו בפעם הראשונה, יש לזכור כי אם המחשוף לא נצפתה, כי זה יכול להיות בגלל מגוון רחב של גורמים כגון הפעילות של פרוטאז.
הדגימה של ההליך תהיה ג'יימי קומפטון, טכנאי מהמעבדה שלי. התחל על ידי פתיחת Protein BLAST ולשים את 20 חומצות האמינו המקיפות את הקשר מספריים ואת פוליפרוטאין ויראלי לבחור רצפי חלבון מיותרים ולאחר מכן להקליד את הגנום המארח כדי לחפש. במידת הצורך, בחר PHI-BLAST והקלד רצף דוגמאות מילוי שבו סוגריים מרובעים מציינים כי חומצת אמינו בתוך הסוגריים יכולים להיות במיקום המחליף, ולאחר מכן לחץ על BLAST.
סדר דירוג להיטי BLAST בהתבסס על מספר שאריות זהות או נסבלות רצופות התואמות לרצף אתר מחשוף. מהרשימה, בחר את החלבונים המכילים שש שאריות זהות או דומות יותר לניתוח בהמתזות הפרוטאז. בנו קידוד פלסמיד לחלבון פלואורסצנטי ציאן, עד 25 חומצות אמינו של רצף המחשוף, וחלבון פלואורסצנטי צהוב.
לאחר מכן, להכין את המצעים CFP ו- YFP על ידי חיטוי ארבעה ארבעה בקבוקונים ליטר עם 25 מיליליטר של תרבות לילה. לנער את התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס ולפקח על הצמיחה מדי שעה על ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis ב 600 ננומטר. כאשר החיידקים מגיעים לספיגה של כאחד, לגרום ביטוי חלבון על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של IPTG טוחן אחד לכל בקבוק, ולאחר מכן להוריד את הטמפרטורה של החממה רועדת ל 17 מעלות צלזיוס ולאפשר את הביטוי להמשיך לילה במשך 17 עד 20 שעות.
ביום שלמחרת, גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 7000 פעמים גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר והשליך את המדיה הנוזלית ולאחר מכן לאחסן את כדורי במינוס 80 מעלות צלזיוס או להמשיך עם תות התא. כדי lyse התאים, להכין 100 מיליליטר של חיץ תזה על פי הוראות כתב היד, להשתמש מחדש את כדורי במאגר, ולהעביר 25 עד 25 מיליליטר של ההשעיה ל 50 צינורות חרוט חד פעמיים מיליליטר.
מניחים את הצינורות ב פלסטיק עם מי קרח ואז להכניס את קצה sonicator לתוך הצינור, כך הקצה הוא כ סנטימטר אחד מתחתית הצינור sonicate 10 עד 20 פעמים עד שהוא הופך נוזל נוזלי נוזלי. לאחר sonication, להעביר את lysate לצינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה צנטריפוגה אותו ב 20, 500 x g במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את העל-טבעי לבקבוק נקי וזורקים את הכדורים.
טען את lysate על עמוד ניקל ולאחר מכן לשטוף את העמודה עם שני כרכים עמודה של מאגר A ואחריו חמישה כרכים עמודה של 20%מאגר B.Absorbance ב 280 ננומטר יגדל במהלך לשטוף כמו מזהמים לרחף מהעמודה. המשך לשטוף עד ש- A280 יחזור לערכי התוכנית הבסיסית. לאחר מכן ליטף את החלבון עם שניים עד שלושה נפחי עמודות של 100%buffer B ולאסוף 10 שברים מיליליטר, הקפד למדוד את A280 של כל שבר.
הכינו שמונה תערובות לפי הוראות כתב היד ופיגט 45 מיקרוליטרים של כל תערובת לשלושת בארות הראשונות של כל שורה של צלחת שחורה של חצי אזור 96 בארות. הגדר את קורא הלוחות לגילוי בו זמני של florescence בשני אורכי גל עם הגדרת צינור photomultiplier קבוע. תכנת את זמן הקריאה ל- 20 עד 30 דקות עם קריאה אחת לדקה ובחר את הבארים לקריאה.
הכנס את הלוחית למכונה והתחל את הקריאה, תוך ניטור יחסי הפליטה לאורך זמן. הפעל קריאת נקודת קצה של הלוח המכיל את המצע הלא חתוך. הסר את הצלחת ואת פיפטה חמישה microliters של אנזים לתוך כל באר.
ניתן לשמור את העמודה הראשונה כפקד ללא חיתוך. לאחר מכן קראו שוב את הלוח במשך 20 עד 30 דקות, ודאו להגדיר את קורא הלוחות לפלט ערכים מוחלטים. לאחר הקריאה הושלמה, לאטום את הצלחת עם הסרט כדי למנוע אידוי ולהשאיר אותו לילה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את האנזים לחתוך לחלוטין את המצע.
לאחר 24 שעות, להסיר את הסרט ולבצע קריאת נקודת קצה של הצלחת. ממוצע יחסי הפליטה ותקליט אותם כחתך. אשר את המחשוף של המצע באמצעות SDS-PAGE.
לטעון סמן משקל מולקולרי לנתיב הראשון או האחרון ולהעמיס חמישה microliters של כל תערובת תגובה לתוך נתיב של הג'ל, החל התגובה נימולים. חבר את האלקטרודות של מיכל הג'ל לאספקת החשמל והפעל את המוצרים ב 110 וולט במשך 60 דקות. מוציאים את הג'ל מהקלטת בעזרת כלי פיצוח ומטביעים אותו בחמישה עד עשרה מיליליטר של תותכת.
לאחר שעה עד 24 שעות, להסיר את הכתם העודף להטביע את הג'ל במים. ואז לצלם את הג'ל באמצעות תמונה ג'ל. כדי להכין את מבנה החלבון, לטעון את קובץ PDB חלבון לתוך MOE.
לחץ על בחר וממס ולאחר מכן מחק את הממס. פתחו את החלונית 'מבנה pPreparation' מ שורת התפריטים 'מיפוי עליון' ותיקנו אוטומטית את כל הפריטים המבניים בלחיצה על 'תקן'. פרוטונאט המבנה על ידי לחיצה על Protonate 3D.
הוסיפו לחלבון חיובים חלקיים על-ידי פתיחת החלונית 'חיובים חלקיים' ובחירה ב-AMBER 99 וכוונון המימן והזוגות הבודדים כנדרש. לאחר מכן שמור את קובץ המבנה. לבניית המבנה של פפטידי המצע ו-TRIM14, פתחו את החלונית 'בונה חלבונים', הזינו את רצף המצע ובחרו 'אריזה אוטומטית מחדש'.
לאחר מכן, הגדר גיאומטריה כמורחב ולחץ על לבנות. לבסוף למזער את המבנה ולשמור אותו כקובץ PDB. עגן את הפפטידים המצעיים ל- VEEV-nsP2 באמצעות תוכנת PyRx AudoDock 4.2.
טען את החלבון, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על השם ובחר הפוך את Macromolecule להכנת קובץ העגינה PDBQT. לאחר מכן טען את מולקולת המצע ובחר הפוך את Ligand כדי להכין את קובץ העגינה של הליגנד. הפעל את אשף ה-AutoDock בלוח העגינה בתחתית ובחר את קובצי הליגנד והחלבון המוכנים.
הגדר את הכיס מחייב החלבון על-ידי כוונון ידני של ממד הרשת ולאחר מכן הפעל את AuotGrid. לאחר מכן, הפעל את AutoDock ובחר את שיטת האלגוריתם הגנטי של למארקיאן. לחץ על פרמטרי עגינה והגדר את מספר ריצות GA ל- 50 ולאחר מכן לחץ על קדימה כדי להתחיל את הפעלת העגינה.
לאחר השלמת AutoDock, פתחו את החלונית 'נתח תוצאות' ובדקו את כל תנוחות האיגוד החזויות. בחר את המודל הטוב ביותר עם האנרגיה המחייבת החזויה הנמוכה ביותר ואינטראקציות מחייבות סבירות בין cis-477 לבין המצע באתר המחשוף ולאחר מכן שמור אותו כקובץ PDB לסימולציות MD נוספות. לאחר קריאת תנוחות הכריכה עם AutoDock, חשוב לבצע ניתוח שלאחר העגינה כדי לזהות את מודל מחייב מתקבל על הדעת עבור עידון עם סימולציות MD.
פרוטוקול זה שימש כדי למצוא קטעים קצרים של רצפי חלבון מארח פתוגן הומולוגי או SSHHPS ב ns2B/3 וירוס זיקה פרוטאז. זוהו ארבע מטרות חלבון מארחות. FOXGS, SFRP1, תת-אחת של Gsalpha מספריית cDNA ברשתית, והנוקלאוטידס המיטוכונדריאלי NT5M 5'3'.
יישורי רצף של SSHHPS אפשרו הבדלים ספציפיים למינים ברצפי אתר המחשוף. רצף SFRP1 היה זהה בבני אדם ותרנגולות וזה ראוי לציון כי וירוס זיקה יכול לגרום לתמותה ומיקרוסקפליה בעוברים עוף. ההסקה המתמשכת שימשה למדידת פרמטרים קינטיים של מצב יציב וקבועי עיכוב עבור רצפי הפוליפרוטאין הנגיפיים וההסקה הבלתי רציפה שימשה להשגת מידע מחשוף איכותי, כגון מחשוף של רצף מסוים או עיכוב הפרוטאז על ידי תרכובות שונות.
מודל של צומת דלקת המוח סוסים ונצואלה nsP1-nsP2 נעשה באמצעות שיטות סיליקו. עבור פרוטאז nsP2, הארכת רצף המצע והפחתת הכוח היוני של החיץ הובילו לירידה משמעותית קבוע מיכאליס של מחשוף של רצף וירוס יער סמליקי. בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב להפעיל את הפקדים.
מצעים המכילים את רצפי האתר מחשוף פרוטאז ויראלי צריך להיבדק לפני שתמשיך עם ניתוח רצף SSHHPS. אם מחשוף של חלבון מארח הוא ציין, ניסויים מעקב צריך להתבצע כדי לאשר כי חלבון המארח משפיע על שכפול ויראלי. זה יכול להיעשות על ידי overexpressing או השתקה של החלבון, ולאחר מכן בחינת ההשפעות על שכפול ויראלי.
קבוצה IV מכילה מספר רב של פתוגנים חדשים ומתפתחים. רצפי SSHHPS מקשרים חלבונים ומסלולים מארחים ספציפיים עם הפרוטאזות הנגיפיות בצורה צפויה מאוד.
