InDevR מודה NIH / NIAID U01AI070276 ו R43AI077112 למימון עבודה זו.

1. לדוגמא הגברה באמצעות RT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית רנ&quot;א נגיפי מחומר קליני או נגיפי לבודד באמצעות MinElute ספין Qiagen ערכת וירוס בשיתוף עם פלטפורמה QIAcube אוטומטיות גרעין מיצוי חומצה. עקירות מבוצעות על דגימה 200 μl עם נפח elution הסופי של μl 60. תמציות חנות ב -70 ° C או נמוכה לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזור החופשי תבנית, להכין את תערובת RT-PCR מאסטר על הקרח על פי פרוטוקול של היצרן. כדי לשלב ביוטין במהלך RT-PCR, שימוש בתערובת dNTP biotinylated במקום היצרן סיפק לערבב dNTP. עלות באמצעות תערובת dNTP biotinylated הוא פחות מ 1 $ USD / assay. שיטות חלופיות ההתאגדות ביוטין כגון שימוש פריימר biotinylated יכול לשמש גם. הוסף פריימר מתערבב בריכוזים הסופי של 1.0 מיקרומטר עבור שפעת A, 1.0 מיקרומטר עבור שפעת B, ו - 0.14 מיקרומטר על הבקרה הפנימית. שפעת ערכה פריימר מגביר את הגן מטריצה ​​קטע (1032 מוצר NT) ואת ערכת שפעת תחל ב מגביר קטע הלא מבניים גן (811 מוצר NT). כל קבוצה פריימר FluChip מכיל פריימר עם קבוצת phosphoryl &#39;5 כדי להקל על דור ה-DNA גדילי יחיד באמצעות עיכול אנזימטי עם exonuclease למבדה הבאים PCR. המוצר שהתקבל תקועים אחד דורש פעמים הכלאה קצר בהרבה המקבילה גדילי כפול משמעותית מקצרת את זמן assay הכוללת. תערובת מוכנה מראש של primers אלה, כמו גם תבנית RNA פנימית מלאה זמינים InDevR לחוקרים המעוניינים על בסיס מוגבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת ולהפיץ 18 μl של האב לתוך תערובת דק דופן צינורות PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת צינורות על הקרח לאזור עבודה מתאימה בנוסף התבנית, ולהוסיף 2 תבנית μl אל צינור כל תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת צינורות PCR כדי Cycler תרמית, ולהפעיל את פרופיל תרמית הבאים: שעתוק לאחור על 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, איון אנזים / הפעלה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, 40 מחזורי PCR של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 ° C עבור ה -30, ו - 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, וכן הרחבה סופית ב 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li></ol> 2. הכלאה של RT-PCR מוצרים microarrays צפיפות נמוכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להפיק DNA גדילי יחיד עבור הכלאה FluChip, להכין את התערובת עיכול אנזימטי על ידי שילוב של 1.0 למבדה μl exonuclease האנזים, 2.2 μl של למאגר התגובה הנלווה, ו 0.8 μl מים nuclease חינם. כמויות אלה הן למדגם יחיד, אך ניתן לשנותם פשוט על המספר הכולל של הדגימות להתעכל. הסר דגימות Cycler תרמי להוסיף 4 μl של התערובת מוכנה התגובה לכל לעכל את גדיל פוספורילציה של המוצר PCR. חזור דגימות Cycler תרמי התוכנית Cycler תרמית 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ואחריו 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להשלים עיכול אנזימטי ופיצול צעדים חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microarrays שפעת אישית בשימוש מודפסות בשקופיות אלדהיד פונקציונליות זכוכית על ידי אפלייד microarrays Inc (בטמפה, AZ). 5&#39;-amino רצפים ללכוד הסתיים משולבים עם חיץ אכון אופטימיזציה מודפס בריכוז סופי של 20 מיקרומטר (למעט רצף הבקרה החיובית אשר בנוסף יש שינוי 3&#39;-ביוטין, והוא הבחין בריכוז הסופי של 500 ננומטר) . ללא מגע תצפית השיטה משמשת, בקוטר נקודה אופטימלית של 300 מיקרומטר מרכז אל מרכז המגרש 700 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר microarrays מתיבת אחסון להחיל לשימוש יחיד בארות הכלאה סביב microarrays על ידי הסרת סדין מגן לחיצה בחוזקה מסביב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום שקופיות לפח לשטוף המכילה 110 מ&quot;ל של מים מטוהרים במשך 5 דקות לשטוף מראש הכלאה באמצעות שייקר מסלולית בסל&quot;ד 60-90. יבש בעדינות את המערך על ידי נגיעה מגב רקמות לשפת הבאר ומאפשר למים להיות רשע משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 22 μl של הצפת הכלאה 2x עם כל המוצרים מקוטעת ssDNA, ו 40 pipet μl של פתרונות הכלאה לתוך בארות microarray. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שקופיות להכליא בתא לחות סגור למשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות מן החדר לחות, בקצרה לשטוף מערכים עם שטפי הצפת D בבקבוק לשטוף לפני הצבת למעמד שקופיות. בדרך כלל נפח שטיפה של שטפי הצפת D הוא 2 מ&quot;ל לכל המערך. שקופית המקום מדף המכיל שקופיות סל כביסה המכילה 110 מ&quot;ל לשטוף הצפת המקום א סל על מסלולית שייקר בסל&quot;ד 60-90 דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מתלה שקופיות הצפת לשטוף, בקצרה לשטוף עם שטפי הצפת D, החלק העברת מתלה לסל המכיל מאגר B לשטוף, ולנער בסל&quot;ד 60-90 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש בעדינות את המערך בכל שקופית, שקופיות מקום יבש בתא לחות לקראת השלבים ampliPHOX Colorimetric איתור. </li></ol> 3. ampliPHOX: תיוג המוצר הכלאה שבבי כיול עם ampliTAG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב<html> 10 μl של ampliTAG, 20 μl של חיץ ampliTAG 2x, ו - 10 μl של מים מטוהרים עבור כל מערך להיות מעובד. כרכים מגיב וניתן לשנותם פשוט על המספר הכולל של הדגימות. הקפד להכין תערובת תיוג מספיק כדי להסביר את כל מערכי המדגם מערכי כיול הצורך. מספר שבבי כיול צורך תלוי אם אתה מבצע כיול מלא (עבור מכשיר חדש, או הרבה החדשה של ריאגנטים), או פשוט לבדוק את המכשיר. עבור כיול מלא, 3 שבבי כיול צריך להיות מתויג, ואת לבדיקה מגיב, רק שבב יחיד כיול צריך להיות מתויג. שים לב לפני מערכי כיול מסומנים, הם צריכים לעבור שלב טרום הכלאה הכביסה אשר תוארה בעבר עבור מערכי שפעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 40 μl של תערובת תווית למערך כל ולאפשר תיוג התגובה להמשיך בתא לחות סגור במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לשטוף מערכים עם שטפי הצפת D בבקבוק לשטוף לפני הצבת שקופיות במעמד שקופיות. העברת מתלה לפח המכיל 110 מ&quot;ל של שטפי הצפת C, לנער בסל&quot;ד 60-90 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש סל לשטוף שני, מלא מים מטוהרים, לבצע שלוש מטבלים ברציפות מים קצרה כדי להסיר שאריות מלח. יבש מערכי בעדינות על ידי נגיעה מגב רקמות לקצה את הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microarrays כיום שכותרתו כראוי עם ampliTAG, והיתר של הליך זיהוי ampliPHOX יכול להתבצע. Photoactivation הדמיה של מערכי שכותרתו אמורה להסתיים בתוך 24 שעות, ומערכים נוספים ניתן לאחסן בתיבת שקופית כהה עד לשימוש. </li></ol> 4. ampliPHOX: כיול, הגברה אות, הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ampliPHOX הקורא ולהבטיח תוכנה ampliVIEW מוכן photoactivation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את זמן photoactivation אופטימלי באמצעות שבבי כיול. בנוסף במבוא קצר העוקב, הליך זה הוא התווה גם במדריך מבצע ampliPHOX בפירוט. שבבי כיול מכילים סדרה של דילולים של רצף בקרה biotinylated כי מנוצלים כדי לייעל את הרגישות של assay, במטרה למקסם את מספר השורות של השבב כיול המייצרים איתות חיובי כפי שנקבע על ידי התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ampliPHY מ 4 ° C, לאפשר לחמם לטמפרטורת החדר, והמערבולת בקצרה לערבב. 3 Pipet μl של ampliPHY משפר לתוך הבקבוקון ampliPHY, והמערבולת ביסודיות במשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן שווה להעביר 40 μl של פתרון ampliPHY לתוך microarray היטב המכיל את ampliTAG שכותרתו מערך, להבטיח כי בועות לא נוכחים. סגור את הבקבוקון ampliPHY בין כל יישום. הכנס את השקופית microarray למפרץ photoactivation של הקורא ampliPHOX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מערך הכיול הראשונה, להשתמש photoactivation ברירת המחדל זמן בתיבת &#39;זמן&#39; בלוח השמאלי של התוכנה, ולחץ על &#39;התחל&#39; הירוק כפתור כדי להפעיל את photoactivation. לאחר השלמת, הסר את מערך ולשטוף עם מים מטוהרים להסיר ampliPHY עודף. נקה היווצרות פולימר על כמה נקודות צריך עכשיו להיות גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר כתמים פולימר להתייבש במשך 2 דקות, ולאחר מכן להפיץ שתי טיפות ampliRED על מערך ולאפשר מכתים להמשיך במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, במהירות microarray לשטוף עם מים מטוהרים ויבש עם רקמות לנגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס microarray לתוך המפרץ הדמיה של Reader ampliPHOX, ולחץ על כפתור &#39;תמונה לכידה חדש&#39; בכרטיסייה הדמיה. צילמו פעם, להתאים את היבול ולשמור את התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסיה ניתוח, בחר את שבב כיול מסכה על כפתור &#39;מיקום אוטומטי &quot;כדי להתחיל את הניתוח. התוכנה באופן אוטומטי לייצר &quot;שיא סיכום &#39;מציג את תוצאות לכימות. בהתבסס על תוצאות אלו, בזמן photoactivation מותאם על ידי 10 שניות עבור מערך הכיול השני, הנוהל חזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן photoactivation האופטימלי נקבע, מערכי המדגם יכול להיות מעובד באמצעות הגברה אות באותו פרוטוקול הדמיה המשמש מערכי כיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתמונה כבשו עבור מערכי המדגם, מסכה עבור פריסת מערך מסוים שלך כגון הפריסה שפעת מערך המתואר כאן יכול להיות תוכנה created.The ampliVIEW הוא מסוגל לבצע ניתוח תמונת אוטומטיות להפקת התוצאות שפעת subtyping עבור כל דגימה. </li></ol> 5. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. איור סכמטי של שיטת זיהוי ampliPHOX colorimetric. (א) ה-DNA היעד Biotinylated הוא הכלאה לזהות כל אחד במערך, ו - (ב) שכותרתו עם ampliTAG. (ג) פתרון ampliPHY הוא הוסיף אז, (ד) חשיפה לאור כדי ליצור פולימר כתמים נראים לעין. (ה) נקודות הפולימר נוצר מוכתמות לאחר מכן עם צבע רעיל כדי לשפר את החדות. ontent &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. (א) שפעת פריסת microarray צפיפות נמוכה. רצפים 1-7 ו - 10-13 שפעת היעד, רצפים 8, 9 היעד שפעת B. (B) ampliPHOX ו (ג) תמונות הקרינה של 2009 הרומן H1N1 (&quot;שפעת החזירים&quot;) הדגימה מראה את דפוס זיהוי זהה על ידי שני שיטות. <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. משמאל לימין, תמונות מייצג ampliPHOX לשפעת H3N2, מוצא האדם, H1N1, H1N1 2009 רומן (החזירים המוצא), ו טיפוס שלילי. כל 3 תת מראים דפוסים ברורים ויזואלית במערך. שימו לב שלילית שרק הבקרה הפנימית MS2 נתפסת, המציין את ההגברה RT-PCR לא היה עצור.

<ol>
	<li>Kumar, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Widely+Used+Diagnostics+"DNA-Microarray"-A+Review.">The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review.</a> Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).</li><li>Miller, M. B., Tang, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Concepts+of+Microarrays+and+Potential+Applications+in+Clinical+Microbiology.">Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology.</a> Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).</li><li>Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+microarrays+in+the+clinic:+infectious+diseases.">DNA microarrays in the clinic: infectious diseases.</a> BioEssays. 30, 673-682 (2008).</li><li>Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+pathogen+detection+using+DNA+microarrays.">Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays.</a> Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).</li><li>Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+the+future+hold+for+clinical+microbiology.">What does the future hold for clinical microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).</li><li>Dawson, E. D., Rowlen, K. L., Wang, Q., Tao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MChip:+A+Single+Gene+Diagnostic+for+Influenza+A.">MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A.</a> Influenza: Molecular Virology. , (2010).</li><li>Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hemagglutinin+subtyping+and+pathotyping+of+avian+influenza+viruses+by+a+DNA+microarray.">Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray.</a> J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).</li><li>Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluChip:+Experimental+evaluation+of+a+diagnostic+influenza+microarray.">FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray.</a> J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).</li><li>Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+influenza+viruses+with+resequencing+arrays.">Identifying influenza viruses with resequencing arrays.</a> Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).</li><li>Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+DNA+Flow-Thru+Chip,+a+three-dimensional+biochip,+for+typing+and+subtyping+of+influenza+viruses.">Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses.</a> J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).</li><li>Kuck, L. R., Taylor, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymerization+as+an+innovative+detection+technique+for+low-density+microarrays.">Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays.</a> Biotechniques. 45, 179-186 (2008).</li><li>Avens, H. J., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fluorescent+polymerization-based+signal+amplification+for+sensitive+and+non-enzymatic+biodetection+in+antibody+arrays.">Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays.</a> Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).</li><li>Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+detection+using+polymerization-based+amplification.">Antigen detection using polymerization-based amplification.</a> Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).</li></ol>

כל הכותבים הם עובדי InDevR, Inc, גוף ללא מטרות רווח. InDevR הוא מסחור הטכנולוגיה ampliPHOX המתוארים להלן.

הטכנולוגיה colorimetric ampliPHOX זיהוי המוצגת כאן היא אלטרנטיבה מהירה, זולה זיהוי צבע פלואורסצנטי יחיד עבור יישומים microarray צפיפות נמוכה. מוצג באופן סכמטי באיור 1, עיקרון הזיהוי מבוסס על שימוש של תווית photoinitiator (1B). בנוכחות פתרון מונומר המכילים (1C), חשיפה לאור גורמת photoiniti...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב / ציוד </th><th> יצרן </th><th> קטלוג # </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Qiagen ספין MinElute וירוס Kit </td><td> Qiagen </td><td> 57704 </td><td> יחידה 60 μl elution </td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td> אופציונלי </td></tr><tr><td> ABI 9800 Fast Cycler תרמי </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4441166 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen OneStep RT-PCR ערכת </td><td> Qiagen </td><td> 210210 </td><td> ערכת dNTPs לא בשימוש </td></tr><tr><td> מאגר אכון 2x </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> MI-5007 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים Biotinylated dNTP </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> MI-5009 </td><td></td></tr><tr><td> Lambda exonuclease </td><td> Epicentre ביוטכנולוגיות </td><td> LE032K </td><td> 2500 U, 10U/μl </td></tr><tr><td> FluChip תערובת פריימר </td><td> InDevR </td><td> N / A </td><td> שאינם זמינים עדיין למכירה </td></tr><tr><td> Orbital שאכר </td><td> Madell טכנולוגיה </td><td> ZD-9556-A </td><td></td></tr><tr><td> לשטוף בינס </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> MI-4002 </td><td></td></tr><tr><td> לשטוף Racks </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> MI-4003 </td><td></td></tr><tr><td> הכלאה 2x הצפת </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> MI-5004 </td><td></td></tr><tr><td> כיול Chips </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> AP-5006 </td><td></td></tr><tr><td> לשטוף Buffers AD </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> MI-5005 </td><td></td></tr><tr><td> ampliRED </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> AP-5004 </td><td></td></tr><tr><td> ampliTAG </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> AP-5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2x ampliTAG הצפת </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> AP-5002 </td><td></td></tr><tr><td> ampliPHY, משפר ampliPHY </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> AP-5003 </td><td></td></tr></tbody></table>

ampliphox colorimetric detection on a dna microarray for influenza

Microarrays DNA התפתחו כמו כלי רב עוצמה לצורך זיהוי הפתוגן. 1-5 למשל, דוגמאות רבות של היכולת סוג נגיף שפעת תת הוכחו. 6-11 זיהוי subtyping של שפעת על microarrays DNA יש יישומים הן לציבור בריאות המרפאה לגילוי מוקדם, התערבות מהירה, למזער את ההשפעה של מגיפת שפעת. הקרינה מסורתית כיום זיהוי הנפוץ ביותר שיטת microarray. עם זאת, ככל שהטכנולוגיה מתקדמת לקראת microarray לשימוש קליני, 1 להחליף מכשור יקר עם טכנולוגיית זיהוי עלות נמוכה מפגין תכונות ביצועים דומים הקרינה יעשה מבחני microarray אטרקטיבי יותר וחסכונית. הטכנולוגיה colorimetric ampliPHOX זיהוי מיועד יישומי מחקר, יש מגבלה של גילוי בתוך סדר גודל אחד של הקרינה המסורתית 11, עם יתרון העיקרי להיות העלות המשוערת של פי עשרה כלי נמוך בהשוואה סורקים microarray confocal נדרש הקרינה microarray זיהוי. יתרון נוסף הוא הקומפקטיות של המכשיר אשר מאפשר ניידות וגמישות, בניגוד מכשירים פלואורסצנטי המסורתית. בגלל הטכנולוגיה פילמור הוא לא ליניארי מטבעם כמו גילוי הקרינה, לעומת זאת, היא המתאימה ביותר עבור יישומים צפיפות נמוכה microarray שבו כן / לא לענות על נוכחות של רצף מסוים הוא הרצוי, כגון מערכי זיהוי הפתוגן. כיום הצפיפות במקום מקסימלית תואם זיהוי ampliPHOX הוא ~ 1800 נקודות / מערך. בגלל המגבלות צפיפות נקודה, microarrays צפיפות גבוהה יותר אינם מתאימים לאיתור ampliPHOX. כאן, אנו מציגים טכנולוגיה ampliPHOX זיהוי colorimetric כשיטה הגברה אות על microarray צפיפות נמוכה פיתחה לגילוי ואפיון של נגיפי שפעת (FluChip). אף על פי פרוטוקול זה משתמש FluChip (microarray DNA) כיישום אחד ספציפי של ampliPHOX איתור, כל microarray שילוב היעד biotinylated ניתן שכותרתו זוהה באופן דומה. העיצוב microarray ו biotinylation יעד להישבות הם באחריות המשתמש. ברגע היעד biotinylated כבר שנתפסו על המערך, איתור ampliPHOX יכול להתבצע על ידי תיוג הראשון עם מערך המצומד streptavidin-תווית (ampliTAG). לאחר חשיפה לאור באמצעות Reader ampliPHOX, מכשיר פילמור של פתרון מונומר (ampliPHY) מתרחשת רק אזורים המכילים ampliTAG שכותרתו מטרות. הפולימר שנוצר יכול להיות מוכתם לאחר מכן עם פתרון רעיל כדי לשפר בניגוד חזותי, ואחריו הדמיה וניתוח באמצעות חבילת תוכנה פשוטה (ampliVIEW). Assay FluChip כולו ממדגם בלתי חילוץ לתוצאות יכול להתבצע על 6 שעות, הפעולות הגילוי ampliPHOX שתוארו לעיל ניתן להשלים כ -30 דקות.

Watch this Scientific Journal Video about ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza at JoVE.com

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX טכנולוגיית זיהוי colorimetric מוצג כחלופה זולה גילוי הקרינה עבור microarrays. בהתבסס על photopolymerization, ampliPHOX מייצר נקודות פולימר מוצק לעין עירומה רק כמה דקות. תוצאות הם צילמו אז לפרש באופן אוטומטי עם חבילת תוכנה פשוטה אך רבת עוצמה.

ampliPHOX איתור Colorimetric על ה-DNA microarray לשפעת

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

ampliphox-colorimetric-detection-on-a-dna-microarray-for-influenza

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Views.  InDevR Inc.. ampliPHOX טכנולוגיית זיהוי colorimetric מוצג כחלופה זולה גילוי הקרינה עבור microarrays. בהתבסס על photopolymerization, ampliPHOX מייצר נקודות פולימר מוצק לעין עירומה רק כמה דקות. תוצאות הם צילמו אז לפרש באופן אוטומטי עם חבילת תוכנה פשוטה אך רבת עוצמה.

Video: ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

איתור מולקולרית ראפיד והבחנה א נגיפי שפעת A ו- B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

קרינה המבוססת Assay Neuraminidase העיכוב להעריך את הרגישות של שפעת וירוסים אל Neuraminidase המונע המחלקה של תרופות אנטי-ויראליות

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...