עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהבריאות האוסטרלית הלאומיות והמועצה למחקר רפואי (NHMRC # 559007) וסוכרת נעורי Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) ותכנית התשתיות התפעולית של הממשלה ויקטוריאני. אנו מודים לחברי צוות טום מנדל איילט להשתלות תכנית איילט הבידוד למתן רקמות האדם. רקמות אדם נאספו ושימוש באישור אתי מקומי (בית חולי סנט וינסנט HREC-הבריאות של סנט וינסנט 011/04 וHREC-135/08).

1. הכנת רקמת טחול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההערה, כל החומר האנושי יש להתייחס כאל פוטנציאל מדבק וכל ההליכים צריכים להתנהל בקבינט זרימה למינרית שנייה ייצוגי. בעזרת מספריים ומלקחיים סטריליים, הסרת רקמת שומן וסיבית מסעיפי טחול (~ 1-2 סנטימטר בגודל) וחתוך אותו במידה של חומר הכמוסה החיצוני ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חתיכה קטנה (1-2 סנטימטר 3) של רקמת טחול ולמקם את כל חתיכה לתוך צינור סטרילי 50 מ&quot;ל פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Snap-להקפיא את החתיכות של רקמות על ידי טבילה בנוזל N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב -80 ° C. פרוטוקול דומה מתאים לרקמות אחרות (הים). </li></ol> 2. הכנת איילט אנוש לאחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איוני תרבות בתקשורת CMRL. איסוף איונים בצינור תחתון 10 מיליליטר חרוטים ולשטוף פעמים ב PBS על ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 1500 למשך 5 דקות. יוצק את PBS ולנקז את החיץ שיורית על ידי נחת הצינור ההפוך בקצרה על מגבת נייר. היזהר שלאכדי לסלק את האיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמרוקן, מחדש כובע צינור ונצמד הקפאה בחנקן נוזלי ובחנות -80 ° C. </li></ol> 3. הכנת תמצית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Baw תמהיל (10:30:60% v / v) וחנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור מ-80 ° C. להפשיר בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף Baw מספיק קרה כקרח כדי לכסות את פיסת הרקמה. לאיים להשתמש 3-5 מ&quot;ל. לרקמת טחול להשתמש 10-20 מ&quot;ל תלוי בגודל של פיסת הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב homogenizer הרקמות. נקה ידי &#39;מאחד&#39; 10-20 מ&quot;ל של אתנול 70% / מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הומוגני הרקמה בצרורות מרובות, לאחר ביצוע בדיקת homogenizer לתוך הצינור עם פתרון Baw רקמות ו. לשמור על הצינור בדלי קרח לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות ביסודיות homogenizer בין דגימות, על ידי מאחד 10-20 מ&quot;ל של אתנול 70% / מים ולאחר מכן חיץ Baw. זה מונע זיהום צולב של רקמה בין samples.Dismantleand נקי עם אתנול 70% / מים אחרינודואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תמצית מכילה חומר מסיס רק נדרשה, חובצה את תמצית רקמה הומוגני ב4000 סל&quot;ד בRT למשך 10 דקות. אם תמצית גולמית יותר נדרשת, להסתובב בסל&quot;ד 1000 בRT למשך 5 דקות. הטכניקה המתאימה ביותר לחילוץ החלבונים Baw המסיס תלויה בניתוח במורד הזרם של החלבונים. לשימוש במבחנים אימונולוגיים פונקציונליים אנחנו היינו מציעים שננסה לפרק את החלק המסיס באוריאת ז 8 כפי שמצאנו בעבר זה להיות נסבל היטב 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור נקי ולשים אותו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הריכוז של חלבון בתמצית באמצעות assay BCA או דומה. </li></ol> 4. הקפא תמציות ייבוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם המסה של חלבון הנדרש (כלומר, 100 מיקרוגרם לצינור), לדלל את homogenate בהתאם ולוותר aliquots ל5.0 כותרת המ&quot;ל סטרילי, פלקון (12x75 מ&quot;מ) צינורות. לעתים קרובות אנו משתמשים ב100 מיקרוגרם / צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1מחט סטרילית 8-20 מד מזרק לעשות 3 חורים בכובע של כל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפא צינורות או על ידי הצבתן בקרח יבש ל~ 10 דקות או במקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך&gt; 1 שעה. חנות ב -80 ° C עד מוכן לשים על lyophilizer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על הקפאה יבשה יותר ומאפשר לאזן (-100 ° C). זה לוקח בערך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לנפח, ייבוש בהקפאה יכול להסתיים בתוך 3 שעות אבל באופן שגרתי להשאיר הדגימות שלנו בן לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיומו של מחזור הייבוש, לכבות משאבת ואקום ולאפשר לחץ לאט לאט אל תוך החדר. הסר מדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במכסת מנוע סטרילי, להסיר את המכסים המחוררים מהצינורות ולהחליף בחדשים (פלקון 352032). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות חנות ב -20 ° C. דוגמאות ניתן לשחזר בתרבית, או חוצצים אחרים, ולהשתמש בפונקציה או מבחנים ביוכימיים. </li></ol> 5. נציג תוצאות איור 1 מציג את ההכתמה של חלבוןנטען ג&#39;ל עם תמצית מרקמת לבלב מדולדל איון (שכותרת acinar) טחול ומטוהרים ואיי איוני אדם (שכותרת). התוצאות מראות ייצוג טוב של חלבונים בעלי משקל מולקולרי שונה לכל רקמות. הקיבולת של תמציות רקמה כדי לעורר שגשוג תאי T אנושי נבדקה באמצעות assay CFSE מבוסס התפשטות 7 (איור 2). PBMC משמש assay זה בודד מאדם עם סוכרת מסוג 1. עוצמת התגובה מתבטאת כיחס בין מספר תאים עמומים CFSE ל5000 CD4 +, תאי CFSE בהירים ללא אנטיגן: תאים עמומים CFSE ל5000 CD4 +, תאים בהירים CFSE עם האנטיגן מדגימות שלושה עותקים 7. התוצאות מראות חלשה, אבל, ריבוי זיהוי בתגובה לacinar (CD1 = 3.5) ותגובה חזקה לתמצית איון (6.8). נגיף שפעת מומת (CDI = 142.6) כלול כביקורת חיובית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig1.jpg" /> איור 1. ג&#39;ל חלבון. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig2.jpg" /> איור 2. תוצאות מבדיקת תפוצה CFSE מבוססת נגד acinar ותמצית איון. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4230/4230fig2large.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

<ol>
	<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes.">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li><li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation.">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li><li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+CD4++T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes.">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4++T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes.">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified.">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li><li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays.">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy,+Pre-diabetic,+and+Diabetic+Donors.">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li><li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide.">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li><li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+preparations+of+GAD65,+proinsulin,+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes:+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes.">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li><li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation.">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

פרוטוקול זה פותח בגלל שרצינו להפיק תמצית מרקמה האנושית שהייתה חופשי מכימיקלים רעילים כגון חומרי ניקוי. באופן ספציפי יש לנו השתמשנו בו כדי להכין תמצית של רקמה האנושית שניתן להשתמש במבחנים של תפקוד מערכת חיסון של אדם במבחנה. תמציות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה באו?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל 12 75 צינורות קלקר סטריליים מ&quot;מ x </td><td> BD פלקון </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> כובעים לצינורות צינורות קלקר (לעיל) </td><td> BD פלקון </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50 מיליליטר צינורות סטריליים </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrile </td><td> כימיקלי Mallinckradt </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-ol </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> Homogenizer: PRO200 </td><td> Bio-אסטרטגיה </td><td> 01-01200 </td><td> 10 המ&quot;מ x 115 גנרטור משונן </td></tr><tr><td> Lyophilizer </td><td></td><td></td><td> Virtis, Benchtop 4K </td></tr><tr><td> 18-20 מד מחט סטרילית </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> בינוני CMRL-1066 </td><td> סיגמא </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> סיגמא </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלת 1. ריאגנטים וציוד ספציפיים.

extraction of tissue antigens for functional assays

רבים מיעדי אנטיגן של תגובה חיסונית אדפטיבית, המוכרים על ידי תאי T, B ולא הוגדרו 1. זה נכון במיוחד במחל אוטואימוניות וסרטן 2. המטרה שלנו היא לחקור את האנטיגנים מוכרים על ידי תאי T אנושיים בסוג המחלה אוטואימונית 1 הסוכרת 1,3,4,5. כדי לנתח את התגובות אנושיות תא T נגד רקמות שבו אנטיגנים המוכרים על ידי תאי T אינם מזוהים פתחנו שיטה לחילוץ אנטיגנים חלבון מרקמה אנושית בתבנית תואמת עם מבחנים תפקודיים 6. תגובות בעבר, תאים-T לתמציות רקמות unpurified לא ניתן היו למדוד, משום ששיטות החילוץ להניב lysate שהכיל חומרי ניקוי שהיו רעילים לתאי דם היקפי אדם mononuclear. כאן אנו מתארים פרוטוקול לחילוץ חלבונים מרקמות אדם בתבנית שאינה רעיל לתאי T אנושיים. רקמת homogenized בתערובת של, אצטוניטריל butan-1-ol וואטאה (Baw). ריכוז החלבון בתמצית הרקמה נמדד ומסה ידועה של חלבון aliquoted לתוך צינורות. לאחר חילוץ, הממסים האורגניים יוסרו על ידי lyophilization. תמציות רקמות Lyophilized ניתן לאחסן עד נדרשים. לשימוש במבחנים של תפקוד מערכת חיסוני, השעיה של תאי חיסון, בתקשורת התרבות המתאימה, ניתן להוסיף ישירות לתמצית lyophilized. ייצור ציטוקינים ושגשוג על ידי PBMC, בתגובה לתמציות שהוכנו באמצעות שיטה זו, נמדדו בקלות. לפיכך, השיטה שלנו מאפשרת הכנה המהירה של lysates רקמות האנושיים שיכול לשמש כמקור לאנטיגנים בניתוח של תגובות תא T. אנו ממליצים כי שיטה זו תאפשר הניתוח של תגובות חיסוניות מסתגלות לרקמות בהשתלה, סרטן והתפתחות מחלה.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays at JoVE.com

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

פרוטוקול פשוט להכנת תמציות של רקמה אנושית שתשמש כמקור לאנטיגנים במבחנים תפקודיים תא T מתואר. שיטה זו מאפשרת תגובות תא T לאנטיגנים המופקים מרקמות כדי להימדד<em&gt; במבחנה</em&gt;.

הפקת אנטיגנים רקמות למבחנים פונקציונליים

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

extraction-of-tissue-antigens-for-functional-assays

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Views.  St. Vincent's Institute of Medical Research. פרוטוקול פשוט להכנת תמציות של רקמה אנושית שתשמש כמקור לאנטיגנים במבחנים תפקודיים תא T מתואר. שיטה זו מאפשרת תגובות תא T לאנטיגנים המופקים מרקמות כדי להימדד במבחנה.

Video: Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against human leukocyte antigens (HLA). Histocompatibility guidelines are based on laboratory tests of anti-HLA immunity, which presents either as pre-existing or de novo generated HLA antibodies that constitute a major transplantation barrier. Current tests are built on a single-antigen beads (SAB) platform using a fixed set of ~100 preselected recombinant HLA antigens to probe transplant sera. However, in humans there exist a far greater variety of HLA types, with no two individuals other than identical twins who can share the same combination of HLA sequences. While advanced technologies for HLA typing and direct sequencing can precisely capture any mismatches in DNA sequence between a donor's and recipient's HLA, the SAB assay, due to its limited variety in sequence representation, is unable to precisely detect alloantibodies specifically against the donor HLA mismatches. We sought to develop a complementary method using a different technology to detect and characterize anti-donor HLA antibodies on a personalized basis. The screening tool is a custom peptide array of donor HLA-derived sequences for probing post-transplant sera of the organ recipient to assess the risk for antibody-mediated rejection. On a single array for one donor-recipient pair, up to 600 unique peptides are made based on the donor's HLA protein sequences, each peptide carrying at least one mismatched residue in a 15-amino acid sequence. In our pilot experiments to compare antigen patterns for pre- and post-transplant sera on these arrays, we were able to detect anti-HLA signals with the resolution that also allowed us to pinpoint the immune epitopes involved. These personalized antigen arrays allow high-resolution detection of donor-specific HLA epitopes in organ transplantation.

Mismatches in human leukocyte antigen (HLA) sequences between organ donor and recipient pairs are the major cause of antibody-mediated rejection in organ transplantation. Here we present the use of custom antigen arrays that are based on individual donors' HLA sequences to probe anti-donor HLA alloantibodies in organ recipients.

אישית פפטיד מערכים גילוי של Alloantibodies הלע בהשתלת איברים

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Biochemistry

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Neuroscience

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Immunology and Infection

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

עבודה עם רקמות אנושיות לחקר סרטן Translational

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Medicine

Tetrameric Fluorescent Antigen Arrays for Single-Step Identification of Antigen-Specific B Cells

Fluorescent antigen production is a critical step in the identification of antigen-specific B cells. Here, we detailed the preparation, purification, and the use of four-arm, fluorescent PEG-antigen conjugates to selectively identify antigen-specific B cells through avid engagement with cognate B cell receptors. Using modular click chemistry and commercially available fluorophore kit chemistries, we demonstrated the versatility of preparing customized fluorescent PEG-conjugates by creating distinct arrays for proteolipid protein (PLP139-151) and insulin, which are important autoantigens in murine models of multiple sclerosis and type 1 diabetes, respectively. Assays were developed for each fluorescent conjugate in its respective disease model using flow cytometry. Antigen arrays were compared to monovalent autoantigen to quantify the benefit of multimerization onto PEG backbones. Finally, we illustrated the utility of this platform by isolating and assessing anti-insulin B cell responses after antigen stimulation ex vivo. Labeling insulin-specific B cells enabled the amplified detection of changes to co-stimulation (CD86) that were otherwise dampened in aggregate B cell analysis. Together, this report enables the production and use of fluorescent antigen arrays as a robust tool for probing B cell populations.

This protocol details the customizable production and use of fluorescent probes for labeling antigen-specific B cells.

Fluorescent antigen production is a critical step in the identification of antigen-specific B cells. Here, we detailed the preparation, purification, and ...

Bioengineering

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

בקנה מידה קטן תמציות גרעיני עבור מבחני פונקציונלית של הגן ביטוי Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

יעילות גבוהה הדור של העכבר העיקרי של אנטיגן בתאי T ציטוטוקסיים לבדיקות פונקציונליות במודל סוכרת אוטואימוניות

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

בידוד ואפיון תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות עכבר

Identification of Rare Antigen-Specific T Cells from Mouse Lungs with Peptide:Major Histocompatibility Complex Tetramers

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune pathophysiology. The technical challenges of tracking antigen-specific T cell populations within the endogenous T cell repertoire have been greatly advanced by the development of peptide:MHC tetramer reagents. These fluorescently labeled soluble multimers of MHC class I or class II molecules complexed to antigenic peptide epitopes bind directly to T cells with corresponding T cell receptor (TCR) specificity and can, therefore, identify antigen-specific T cell populations in their native state without a requirement for a functional response induced by ex vivo stimulation. For exceedingly rare populations, tetramer-bound T cells can be magnetically enriched to increase the sensitivity and reliability of detection.
As the investigation of tissue-resident T cell immunity deepens, there is a pressing need to identify antigen-specific T cells that traffic to and reside in nonlymphoid tissues. In this protocol, we present a detailed set of instructions for the isolation and characterization of antigen-specific T cells present within mouse lungs. This involves the isolation of T cells from digested lung tissue followed by a general T cell magnetic enrichment step and tetramer staining for flow cytometry analysis and sorting. The steps highlighted in this protocol utilize common techniques and readily available reagents, making it accessible for nearly any researcher engaged in mouse T cell immunology, and are highly adaptable for a variety of downstream analyses of any low frequency antigen-specific T cell population residing within the lungs.

Author Spotlight: פרוטוקול ממוטב לאיתור תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות עכבר באמצעות טטרמרים

We provide a detailed protocol for isolating and identifying rare antigen-specific T cell populations in mouse lungs through magnetic bead-based T cell enrichment and peptide:major histocompatibility complex (MHC) tetramers.

זיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מריאות עכבר באמצעות פפטיד:טטרמרים מורכבים עיקריים של היסטותאימות

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune ...

הפקת אנטיגנים רקמות למבחנים פונקציונליים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אישית פפטיד מערכים גילוי של Alloantibodies הלע בהשתלת איברים

Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

עבודה עם רקמות אנושיות לחקר סרטן Translational

Tetrameric Fluorescent Antigen Arrays for Single-Step Identification of Antigen-Specific B Cells

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

בקנה מידה קטן תמציות גרעיני עבור מבחני פונקציונלית של הגן ביטוי Machineries

יעילות גבוהה הדור של העכבר העיקרי של אנטיגן בתאי T ציטוטוקסיים לבדיקות פונקציונליות במודל סוכרת אוטואימוניות

זיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מריאות עכבר באמצעות פפטיד:טטרמרים מורכבים עיקריים של היסטותאימות

זיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מריאות עכבר באמצעות פפטיד:טטרמרים מורכבים עיקריים של היסטותאימות