이 작품은 호주 국립 보건 의학 연구위원회 (NHMRC # 559007) 및 아동 당뇨병 연구 재단 (JDRF 4-2006-1025)와 빅토리아 정부의 운영 인프라 계획의 보조금에 의해 지원됩니다. 우리는 인간의 조직을 제공하는 톰 Mandel 작은 섬 이식 프로그램 작은 섬 절연 팀의 구성원을 감사드립니다. 인간의 조직이 지역의 윤리적 승인을 수집하여 사용되었다 (세인트 빈센트 병원 HREC-A 011 / 04, 세인트 빈센트의 건강 HREC-A 135 / 08).

1. 비장 조직을 준비 <ol><li> 참고 - 모든 인간 자료는 잠재적으로 전염성이 모든 절차는 클래스 II의 층류 내각에서 실시되어야한다로 취급해야합니다. 멸균 가위와 집게를 사용하여, 비장 섹션 (크기 ~ 1~2센티미터)에서 지방과 섬유 조직을 제거하고 가능한 한 바깥 쪽 캡슐 소재의 많은을 잘라. </li><li> 비장 조직의 작은 조각 (1~2센티미터 3) 잘라 멸균 50 ML 팔콘 튜브에 각각의 조각을 배치합니다. </li><li> 액체 N 2 침수에 의해 조직의 조각을 스냅 - 고정. </li><li> -80에서 저장 ° C. 유사한 프로토콜은 다른 조직 (들)에 적합합니다. </li></ol> 2. 스토리지에 대한 인간의 작은 섬 준비 <ol><li> CMRL 미디어 문화 섬. 10 ML 원뿔 바닥 관에서 섬을 수집하고 5 분을 위해 1,500 rpm으로 centrifuging하여 PBS로 두 번 씻어. PBS를 넣어하고 종이 타월에 잠시 역 튜브를 삽입하여 잔류 버퍼를 배수한다. 주의하지 말아라섬를 제거합니다. </li><li> -80에서 액체 질소와 매장에서 일단 배수, 재 캡 튜브와 스냅 - 동결 ° C. </li></ol> 3. 추출 준비 <ol><li> 4에 BAW 믹스 (10:30:60 % V / V) 및 매장 ° C. 준비 </li><li> -80 ° C.에서 튜브를 제거 실온에서 해동. </li><li> 조직의 조각을 충당하기 위해 충분한 얼음처럼 차가운 BAW을 추가합니다. 섬 3-5 ML을 사용하십시오. 비장 조직의 경우 조직의 조각의 크기에 따라 10-20 ML을 사용합니다. </li><li> 조직 균질를 조립. 70 % 에탄올 / 물 10-20 ML &#39;을 homogenizing&#39;로 청소하십시오. </li><li> 조직 및 BAW 솔루션 관에 균질 프로브를 삽입 한 후 여러 뿜어의 조직을 균질화. 이후 얼음 양동이에 관세요. </li><li> 철저히 10-20 70 % 에탄올 / 물 ML 후 BAW 버퍼를 homogenizing하여 샘플 사이의 균질를 청소. 이것은 우리 한 후 70 % 에탄올 / 물 samples.Dismantleand 깨끗한 사이의 조직의 교차 오염을 방지5. </li><li> 만 수용성 물질을 포함하는 추출물이 필요한 경우 10 분 동안 RT에서 4,000 rpm으로 균질 조직 추출물을 원심 분리기. 더 많은 원유 추출물가 필요한 경우, 5 분 동안 RT에서 1,000 rpm으로 회전. BAW-불용성 단백질을 추출하기위한 가장 적합한 기술은 단백질의 하류 분석에 따라 달라집니다. 기능 면역의 assays에 사용하기 위해 우리는 우리가 이전에이 잘 6 용납 할 수 발견으로 8 M의 요소에 불용성 일부를 분해하려고 시도하는 것이 좋습니다 것입니다. </li><li> 깨끗한 튜브에 표면에 뜨는 전송과 얼음에 넣어. </li><li> BCA 분석 또는 이와 유사한을 사용하여 추출물의 단백질의 농도를 결정합니다. </li></ol> 4. 건조 추출물을 동결 <ol><li> 단백질 필수의 질량 (예, 튜브 당 100 μg)에 따라 적절하게 homogenate를 희석하여 표시 5.0 ML 멸균, 매 (12x75 mm) 튜브에 aliquots을 투여. 우리는 자주 100 μg / 튜브를 사용합니다. </li><li> 1을 사용각 튜브의 뚜껑에 3 개의 구멍을 만들 8-20 게이지 멸균 주사기 바늘. </li><li> ~ 10 분에 드라이 아이스 나&gt; 1 시간에 -80 ° C 냉장고에 그들을 배치하여 두 튜브를 고정. -80에서 저장 ° C lyophilizer에 넣어 준비가 될 때까지. </li><li> 냉동 건조기에 전환 (-100 ° C) 평형 할 수 있습니다. 이 약 30 분 정도 소요됩니다. </li><li> 볼륨에 따라 냉동 건조는 3 시간 이내에 완료하지만 우리는 정기적으로 하루 아침에 우리의 샘플을 떠날 수 있습니다. </li><li> 건조 사이클을 완료 한 후, 진공 펌프를 끄고 천천히 챔버로 압력을 수 있습니다. 랙을 제거합니다. </li><li> 멸균 후드에서 튜브에서 구멍 마개를 제거하고 새 (매 352,032)로 교체하십시오. </li><li> -20 ° C.에 상점 튜브 샘플은 문화 미디어, 또는 다른 버퍼에 재구성하고, 함수 또는 생화학 assays에서 사용할 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 그림 1은 단백질의 착색을 보여줍니다젤 비장 및 췌장 고갈 췌장 조직 (acinar 표시)에서 추출물과 인간의 섬을 (라벨 섬) 정화와 함께로드. 결과는 각 조직에 대해 서로 다른 분자량의 단백질의 좋은 표현을 보여줍니다. 인간 T-세포 증식을 자극하는 조직 추출물의 용량은 CFSE 기반 확산 분석 7 (그림 2)를 사용하여 테스트되었습니다. 이 분석에 사용 된 PBMC는 제 1 형 당뇨병과 개인으로부터 격리되었다. 응답의 크기는 항원이없는 5000 CD4 +, CFSE 밝은 세포 당 CFSE 흐린 세포의 수의 비율로 표시됩니다 : 5,000 CD4 당 CFSE 흐린 세포의 +, 세중의 샘플 7 항원과 CFSE 밝은 세포. 결과는 약한를 표시하지만, acinar에 대응 (CD1 = 3.5)와 작은 섬 추출물 (6.8)에 강한 반응 감지, 증식. Inactivated 인플루엔자 바이러스 (CDI = 142.6)이로 포함되어 있습니다긍정적 인 제어 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig1.jpg" /> 그림 1. 단백질 젤. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig2.jpg" /> acinar과 작은 섬 추출물에 대한 CFSE 기반의 확산 분석에서 그림 2. 결과. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4230/4230fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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	<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes.">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li><li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation.">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li><li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+CD4++T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes.">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4++T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes.">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified.">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li><li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays.">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy,+Pre-diabetic,+and+Diabetic+Donors.">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li><li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide.">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li><li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+preparations+of+GAD65,+proinsulin,+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes:+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes.">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li><li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation.">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 이러한 세제 등 독성 화학 물질에서 자유를 인간의 조직에서 추출을 생성 싶었 기 때문이 프로토콜은 개발되었습니다. 특히 우리는 체외에서 인간의 면역 기능의 assays에서 사용할 수있는 인체 조직의 추출물을 준비하는 데 사용했습니다. 이 프로토콜을 사용하여 준비 추출물은 똑같이 버퍼에 재구성 및 blotting 서쪽이나 액체 크로마토 그래피 등 여러 생화학 분석, 사용할 수 있습니...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 5 ML 12 X 75mm 멸균 폴리스티렌 튜브 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> 튜브의 폴리스티렌 튜브에 캡 (위) </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ml 멸균 튜브 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 아세토 니트릴 </td><td> Mallinckradt 화학 </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-좋았어요 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> 균질 : PRO200 </td><td> 바이오 전략 </td><td> 01-01200 </td><td> 10 × 115mm 톱니 생성기 </td></tr><tr><td> Lyophilizer </td><td></td><td></td><td> Virtis, Benchtop 4K </td></tr><tr><td> 멸균 니들 18-20 게이지 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> REF 302,032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 매체 </td><td> 시그마 </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> 시그마 </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 특정 시약 및 장비.

extraction of tissue antigens for functional assays

B와 T 세포에 의해 인식 적응 면역 반응의 항원 대상, 대부분은 1 정의되지 않았습니다. 이 면역 질환과 암 2 특히 사실입니다. 우리의 목적은 면역 질병 1 형 당뇨병 1,3,4,5 인간의 T 세포에 의해 인식 항원을 조사하는 것입니다. T 세포에 의해 인식 항원이 발견되지 않는 조직에 대한 인간 T-세포 반응을 분석하기 위해 우리는 기능 assays 6 호환되는 형식으로 인간의 조직에서 단백질 항원을 추출하는 방법을 개발했습니다. 추출 방법은 인간의 말초 혈액 mononuclear 세포에 독성했다 세제를 포함하는 lysate를 얻을 수 있기 때문에 unpurified 조직 추출물로 이전, T-세포 반응을 측정 할 수 없습니다. 여기 인간의 T 세포에 독성이없는 형식으로 인간의 조직에서 단백질을 추출하기위한 프로토콜을 설명합니다. 조직은 butan-1-안녕, 아세토 니트릴 및 와트의 혼합물에 균질하고 있습니다어 (BAW). 조직 추출물의 단백질 농도는 측정 및 단백질의 알려진 질량은 튜브에 aliquoted 있습니다. 추출 후, 유기 용제는 lyophilization에 의해 제거됩니다. 필요 할 때까지 동결 건조 된 조직 추출물은 저장 될 수 있습니다. 면역 기능, 면역 세포의 정지 assays에 사용하기 위해, 적절한 문화 미디어, 동결 건조 추출물에 직접 추가 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 준비 추출물에 대한 응답으로 PBMC의 시토 킨 생산 및 확산은, 쉽게 측정 하였다. 따라서, 우리의 방법은 T-세포 반응의 분석에서 항원의 소스로 사용할 수있는 인간의 조직 lysates의 급속한 준비를 할 수 있습니다. 이 방법은 이식, 암과 autoimmunity의 조직에 적응 면역 반응의 분석을 용이하게 할 것을 권장합니다.

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Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

기능 T-세포 assays에서 항원의 소스로 사용되는 인체 조직의 추출물을 준비하기위한 간단한 프로토콜은 설명되어 있습니다. 이 방법은 조직 유래 항원에 대한 T 세포 반응을 측정 할 수 있습니다<em&gt; 체외에서</em&gt;.

기능 Assays을위한 조직 항원의 추출

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

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10.8K 조회수.  St. Vincent's Institute of Medical Research. 기능 T-세포 assays에서 항원의 소스로 사용되는 인체 조직의 추출물을 준비하기위한 간단한 프로토콜은 설명되어 있습니다. 이 방법은 조직 유래 항원에 대한 T 세포 반응을 측정 할 수 있습니다 체외에서.