עבודה זו נתמכה על ידי התרומות הפילנתרופיות של ג&#39;ון ג &#39;וקרן מארי סטלה Kenedy זיכרון (גרנט # 0,727,033) והברית המחקר מלנומה. המחברים מבקשים להודות לאוניברסיטה של ​​רקמות טקסס MD Anderson Cancer Center מוסדיות בנק (ITB) על תיאום הפצה וגביית רקמות והקלת מחקר translational, כמו גם ד&quot;ר איגנסיו Wistuba, ד&quot;ר ויקטור פרייטו, מחלקת מרכז סרטן MD Anderson ב פתולוגיה ולנומה ירח Shot התכנית. לבסוף, המחברים מבקשים להודות לכל החולים ומשפחות שנפגעו על ידי מלנומה.

הצהרת אתיקה: פרוטוקול זה אושר על ידי אוניברסיטת טקסס מרכז סרטן MD Anderson. 1. רכש דגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות רקמה מגידול עודף מחקר ורקמות נורמליות קשורות 10-12. דגימות חנות על קרח רטוב כדי למנוע autolysis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח את כל הרקמות, מכשירים רפואיים וגופים זרים הוסרו במהלך ניתוח למחלקה לפתולוגיה לבדיקה הכרחית על מנת להקל על אבחנה פתולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידית רקמה שהוקצתה למחקר בהתאם למחקר רלוונטי ומדיניות בנקאות רקמות ונהלים. הערה: אוסף Biospecimen כרוך בתיאום של הפתולוגים, &#39;פתולוגים עוזרים, histotechnologists ומומחי רכש רקמות. </li></ol> 2. פתולוגיה אבטחת איכות (QA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם ולאמת רשומות מטופל כאמצעי QA מוקדם ולהתייעץ פתולוג לסקור רשות אבחוןרשומות tient (דוחות פתולוגיה, שקופיות רקמה, וכו &#39;) ודגימות רקמה. דגימות רקמת שופט על מאפיינים מורפולוגיים של עניין, כגון אחוז הגידול, נמק, ממשק רקמת גידול, וכו &#39;זה הוא בהתאם לשיטות עבודה מומלצות biorepository 10-12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סקירה ראשונית, לערוך בדיקות תקופתיות של נתונים biorepository ודגימות מחקר במהלך כל משך שהות של biospecimen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות קישור וביאורים מההיסטופתולוגיים ואחרות חקירות לדגימות ולספק את הנתונים לחוקרים באמצעות מערכת תוכנת קניינית biorepository. הערה: תהליכי QA להבטיח את השלמות של שני היבטים הקליניים וטכניים של פעולות biorepository. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בדיקות גנטיות ומולקולריות כדי לאמת ולאפיין את הדגימות לשימוש קליני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ולנתח נתונים המבוססים על משוב מחוקרים שכבר משתמשים דוגמאות לניסויי מעבדה. מַסלוּלדגימות באמצעות טכנולוגית הברקוד. מערכת מעקב אלקטרונית זה גם דגלה בשיטות עבודה המומלצות biorespository 10-12. </li></ol> 3. דגימה / עיבוד רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד לאחסן דגימות רקמה טריות על קרח רטוב, ותהליך מהר ככל האפשר, על מנת להגביל את השינויים הנגרמים על ידי מיצוי של דגימת הרקמה מסביבתו הטבעית. נורמלי תהליך גידול בהתאמה ודגימות רקמת גידול בנפרד, כדי למנוע זיהום צולב. הערה: מבוסס על פרוטוקולי מחקר, עיבוד biospecimen יכול לערב אוסף של הדגימות בסוג אחד או יותר של תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת התהליך, להכין צלחת פטרי סטרילית תרבות, אזמל, כמו גם מחט או מלקחיים לעיבוד רקמות. ודא שצינורות ערוכים, שכותרתו, והניחו את כדי להגביל את הזמן של עיבוד מדגם (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל המידע רלוונטי הרקמה, כגון שם החולה, מספר, טיפול, תאריךניתוח, ומידע רלוונטי אחר כפי שיהיה מתאים למחקר, צריך להיעשות נגישים בבסיס נתוני רקמות מוסדיים. מידע על חולה מוגבל צריך להתקיים במעבדה בנייר או בצורת גיליון אלקטרוני. הערה:. לאסוף מידע biospecimen רלוונטי לאופי של דהינו המחקר רק, מחקר בסיסי ביו-רפואי, מחקר קליני, מחקר translational, וכו &#39;לקבלת מידע ספציפית למחלה, צוות biorepository צריך לאסוף נתונים ההכרחיים בספרות הנוכחית וארגונים המסדירים ל להבטיח אבחון נכון ומחקר משמעותי. זה כולל אך אינו מוגבל לציוני גידול ומידע בימוי סרטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנן את כל הניסויים הבאים הרצויים מראש, כדי להחליט על הגודל של חלקי רקמות הנדרשים לכל סוג של ניתוח, כמו גם את המיקום של חתכים. באופן אידיאלי, אם כי בלתי אפשרי, כל הניתוחים צריכים להיות נציג של סעיף הרקמה כל כדי להסביר heterogenei הרקמהטאי והטית מגבלה של ניתוחים במורד הזרם. הנח את כל פריטים הנדרשים מראש כמתואר באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את דגימת הרקמה בצלחת פטרי התרבות הפתוחה, שטוחה על המשטח. הערה: אפשר מורשה בלבד צוות biorepository לטפל דגימות מזוהות ולסקור נתונים בריאות זיהו. חוקרים צריכים לגשת רק מי מזהה מטופל כפי שמתיר נחתמו ההסכמות הודיעו וכפי שמוסדר על ידי IRB. כל הדגימות חייבת להיות מסומנות כראוי וצריכה לכלול במינימום, סוג מספר זיהוי רקמות ורקמות ייחודי. אינו כולל כל אובדן כושר עבודה בתוויות, בהתאם לתקנות HIPAA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק מדגם מכל הזוויות, כדי להשיג הבנה טובה יותר של המבנה וממדיו. הצמד את המדגם לתחתית הצלחת עם המחט, ולהמשיך לחצות את הרקמות לאורך הציר הגדול ונציג הטוב ביותר שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור פיסה קטנה של רקמה ולמקם אותו בMICR 1.5 מיליליטר סטריליצינור ocentrifuge מכיל 1ml של פתרון הייצוב-רנ&quot;א. מדגם זה יכול להיות ממוקם על קרח למשך שארית התהליך ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד צורך. הערה: כאשר עובד עם RNA, תמיד צריכה להיות משוחק כפפות, ויש להשתמש בי טיפים מסנן RNAse ללא להגביל את הסיכויים של השפלה וזיהום RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קלטת ביופסיה פתוחה ושכותרתו מראש במכסה של צלחת פטרי התרבות. לגזור פרוסה של רקמה לא עבה יותר 3 עד 5 מ&quot;מ ולהעביר אותו לקלטת. מניחים את הקלטת ב 10% שנאגרו פורמלין ניטרלי (NBF) למינימום של 72 שעות. העבר את קלטת אתנול 70% לאחסון לטווח ארוך לפני פרפין-הטבעה. הערה: תיוג של קלטות צריכה להתבצע בעיפרון או עם סמנים מומלצים כשימוש בקסילן במהלך העיבוד יהיה אחרת למחוק תוויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור פיסת הרקמה ולמקם אותו בתבנית רקמה. מכסה את קטע הרקמה בטמפרטורה אופטימלית חיתוך מתחם (אוקטובר), ולהקפיא אותו באופן מיידיב -20 ° C לcryosectioning. סעיף רקמה זו עשויה להיות מאוחסן ב -20 ° C עד מוכן לcryosectioning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור אחד או חלקים רבים של רקמות ולהעביר אותם לצינור 50 מיליליטר מכיל מאגר MACS (1x ופר פוספט (PBS), 0.5% בסרום שור עוברי (FBS), 2 מ&quot;מ חומצת Ethylenediaminetetraacetic (EDTA)) לזרימה לאחר ניתוח cytometry . לcytometry זרימה, דגימות גדולות יותר עשויות להיות עדיפות כתאים עלולים ללכת לאיבוד בהתנערות גידול, קיבוע התא וpermeabilization בעת צורך. בדרך כלל, סעיף זה עשוי להילקח בסוף, לאחר שכל החלקים האחרים כבר מעובד. שאריות מדגם גידול נציג עשוי לשמש לcytometry זרימה. לחלופין, צינור זה ניתן לאחסן על 4 מעלות CO / N או המשמש לעיכול מייד לאחר צביעת הזרימה cytometric להשעית תא (ראה שלב 4 - זרימת Cytometric מכתים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך שארית הרקמה לחתיכות לא גדולות יותר מגודל מרבי של 0.5 מ&quot;מ x 0.5 מ&quot;מ ולהעביר אותם לקירורבקבוקונים להקפאה מיידית בחנקן נוזלי. דגימות Snap-קפוא אלה עשויות לשמש לעתיד ניתוחים ומטרות משותפות. הערה: טיפול נוסף יש לנקוט בעת עבודה עם חנקן נוזלי כקשר ישיר יכול לגרום לפציעה חמורה. עיניים צריכה להיות מוגנות עם משקפיים בטיחות עם מגיני צד או עם מגן פנים. צריכים גם להיות משוחק כפפות קריוגני כדי להגן מפני כוויות חנקן נוזליים הנגרמות על ידי תזה ומגע ישיר. כפפות צריכים להתאים כראוי אבל להיות משוחרר מספיק כדי להסיר במהירות צריך להתיז חנקן הנוזלי לתוכם. </li></ol> 4. זרימה Cytometric מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenization רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני עיכול עם DMEM (40 מיליליטר), DNase אני (50 U / ml) וCollagenase אני (2 מ&quot;ג / מיליליטר). מניחים גידול טרי או O / מאוחסן-N במאגר MACS במכסה של צלחת פטרי, ולצלול עם מדיום עיכול. הערה:. שיטות עיכול שונות קיימות, כל אחד עם יתרונות כלומר, לשעבר חלבון פני תא (pression, כדאיות). ודא שיש לך את השיטה המתאימה ליישום במורד הזרם הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידול צמד לתחתית הצלחת עם מחט, ולחתוך ממחוץ למרכז עם אזמל, עד הגידול בעל מרקם כמו דבק. העבר את תערובת גידול לשפופרת 50 מיליליטר, חותם ומקום בשקית פלסטיק, כדי למנוע הדלפות. העבר את הצינור לחממה, ולסובב ב 225 סל&quot;ד, 37 ° C, 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן השעיה תא סרטנית דרך מסננת תא 70μm. השעיה תא צנטריפוגה ב 250 XG, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות. גלולה תא גלולה במאגר 1 מיליליטר FACS (500 מיליליטר PBS, 1 מיליליטר 0.5 M המניה EDTA, FCS 10 מיליליטר או FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer מחדש להשעות בריכוז של 1x10 מיליליטר / 7 תאים. העברה לכל גם 100 μl (10 6 תאים) בצלחת תחתונה גם עגולה 96 לצביעה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדאיות ונוגדן מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של פתרון כתם כדאיות היטב כל אחד ולערבב. Incuבייט במשך 30 דקות, בשעת 4 מעלות צלזיוס, בחושך. ספין למטה תאים ב 250 XG, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות, ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תערובת נוגדנים בריכוז מומלץ / טיטרציה (לפי יצרן) לאנטיגנים משטח ב200 μl של חיץ FACS. דגירה תאים ב 4 מעלות צלזיוס, 30 דקות, בחושך. ספין למטה תאים ב 250 XG, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות, ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 200 μl של חיץ FACS, ספין למטה תאים ב 250 XG, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות, ולשאוב supernatant. Resuspend תאים ב200 μl של חיץ FACS ולהמשיך לזרום cytometer לרכישה וניתוח. הערה: אם ביצוע צביעת cytometry זרימה תאית, לבצע קיבוע וצעדי permeabilization וצביעה תאית בין צעדי 4.2.2 ו4.2.3. אם ביצוע מכתים ציטוקינים, תאים צריכים להיות הכתמה קודמת הופעל מראש מומלצים, ומעכב של תחבורה תאית חלבון והפרשה כגון monensin יש להשתמש בעת הפעלה ללהבטיח שמירה על גורמים מסיסים. תאים קבועים ניתן לאחסן לטווח קצר (שבוע) על 4 מעלות צלזיוס בלפני הרכישה הכהה על cytometer זרימה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology.+Fixing+problems+with+cell+lines.">Cell Biology. Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346, 1452-1453 (2014).</li><li>van der Worp, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+animal+models+of+disease+reliably+inform+human+studies.">Can animal models of disease reliably inform human studies.</a> , (2010).</li><li>McCabe, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+disease.">Animal models of disease.</a> Physiol. Behav. 68, 501-507 (2000).</li><li>Woolf, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meaning+of+translational+research+and+why+it+matters.">The meaning of translational research and why it matters.</a> JAMA. 299, 211-213 (2008).</li><li>Brockbank, K. G., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Preservation.">Tissue Preservation.</a> Advances in Biopreservation. , 157-159 (2006).</li><li>Bulmer, M., Gilbert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ethics+of+social+research.">The ethics of social research.</a> Researching social life. , 45-57 (2001).</li><li>Penslar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IRB guidebook. , (1993).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures. 3, (2009).</li><li>Ruffell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+composition+of+human+breast+cancer.">Leukocyte composition of human breast cancer.</a> Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical flow cytometry. , (2005).</li><li>Baker, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+phosphoprotein+as+a+biological+marker+of+tumor+signaling.">Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling.</a> Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).</li><li>Jacobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+processing+considerations+for+detecting+copy+number+changes+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).</li><li>Chung, J. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+in+tissue+handling+and+processing+that+impact+RNA+obtained+from+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+procedure+for+protein+extraction+from+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues+for+reverse+phase+protein+arrays.">An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays.</a> Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).</li><li>Feldman, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+mRNA+amplification+for+microarray+analysis.">Advantages of mRNA amplification for microarray analysis.</a> Biotechniques. 33, 906-914 (2002).</li><li>Francino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+real-time+PCR+assay+for+diagnosis+and+monitoring+of+canine+leishmaniosis.">Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis.</a> Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).</li><li>Grunberg-Manago, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+stability+and+its+role+in+control+of+gene+expression+in+bacteria+and+phages.">Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages.</a> Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).</li><li>Lesnik, E. A., Freier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+thermodynamic+stability+of+DNA,+RNA,+and+DNA:RNA+hybrid+duplexes:+relationship+with+base+composition+and+structure.">Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure.</a> Biochemistry. 34, 10807-10815 (1995).</li><li>MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+and+proteomics.">Protein microarrays and proteomics.</a> Nat Genet. 32, 526-532 (2002).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

סופו של דבר, שיטות העיבוד חייבים להיות מוכתבות על ידי ההשערה הרצויה וצפויות מבחני טכניים שיש לבצע (איור 1). הסעיף הבא משמש כסקירה לתאר מבחני פוטנציאליים שעלולות להתבצע על סעיפי רקמות כזה. זה בשום פנים וסקירה ממצה, אבל הוא נועד לסייע לשיטות עיבוד מדגם מדריך ובח...

מחקר רפואי נהנה מאוד מהמחקר של שני שורות תאים אנושיות ומודלים של בעלי חיים. שורות תאים מאפשרות שליטה טובה יותר של רכיבים במערכת, כמו גם שימוש בתאים מאורגניזם הנכון. עבודה עם תאים אנושיים, ואילו יותר נציג, מציג תמונת מצב פשוטה באופן דרסטי של מנגנונים שעשויות להיות אחראי לבריאות ומחלה, משום ששורות תאים עשויות שלא לשחזר את ההשפעה של תאים אחרים, רכיבי סטרומה, ואיברים אשר עשוי להשפיע 1 תגובות. מצד השני, מודלים של בעלי החיים, אם כי לא לגמרי מדויק בשחזור מחלה אנושית וההטרוגניות גנטית, להציע תובנה נוספת על ידי מתן אפשרות להזנה של מערכות חיות שלמות ברוב הדגמים 2,3. חסרונות בצד, יש לי שתי השיטות היתרונות שלהם והם משלימים. עם זאת, המטרה העיקרית נשארה ללמוד בתאים אנושיים ואיברים, בגוף מלא, מערכת רב-איבר. בהתאם לכך, יש מחקר translational taken צעדים גדולים בקידום המחקר של איברים ורקמות שחולצו מחולים אנושיים, על מנת להבין טוב יותר את מנגנוני מחלה בסיסית. מחקר translational מציע את היתרון של לימוד התוצאה מטיפולים ומחלות בכל הגוף ובתאים מתאימים, ובכך לספק את המיטב משני העולמות בין תא ובעלי חי עבודה 4. מחקר translational הוא גם לא בלי פגמים. דגימות שנקטפו מחולים אנושיים, עם ההסרה מהמארח, חשופות באופן מיידי לאיסכמיה וגורמים חיצוניים אחרים שממנו הם יהיו מוגנים אחרים. זה עלול לגרום לשינויים מולקולריים וגנטיים שנגרם עקב מתח, ולגרום להטיה במחקרים שלאחר מכן. לכן, הרבה מאמץ כבר הכניס לתוך חילוץ ועיבוד רקמות באמצעות שיטות קפדניות לשמירה הטובה ביותר איבר ושלמות תא ללימודים במורד הזרם 5. חשוב לציין, יישומים עתידיים יש לקחת בחשבון בעת ​​בחירה מקרוב שיטות oו עיבוד דגימות אנושיות, כמו שיטות מסוימות עלולות לפגוע במרכיבים תאיים ומסלולי איתות תוך חוסך אחרים. לכל מחקר מעורב רקמות אנושיות, נושאי רגולטורים יש לטפל. לאחר דיווחי Tuskegee ולמונט, היה הולכים וגדל בעובדה שהמחקר ביו-רפואי היה קשור בסיכונים הגלומים לעתים קרובות וכתוצאה מכך דילמות אתיות בלתי נמנעות 6. הצורך בסטנדרטים לאומיים הוכר והממשלה הפדרלית יצרה לוחות סקירה מוסדיים (IRBs) כאמצעי לשמירה על עקרונות הדו&quot;ח בלמונט (כבוד לאנשים, חסד, המשפטים). IRB כל מוסד הוא ועדה של רופאים, חוקרים וחברי קהילה שהם אחראים להגנת משתתפי מחקר. זה דורש כי הסכמה מרצון לקבל מכל משתתפי מחקרים ביו-רפואיים, וכי הסכמה זו תתועד בהסכמה מהדעת FO<html> rm. תהליך ההסכמה מהדעת שמטרתו לספק מידע הולם למשתתף, כך שהחלטה מושכלת עשויה להיות על האם או לא להירשם ללימודים, או להמשיך השתתפות. בהקשר זה, מסמך ההסכמה מהדעת חייב להיות קריאה טובה וצריך להיות כתוב בשפה שיכול להיות מובנת בקלות (רמת קריאת הכיתה ה -6 עד 8 ​​ה) על ידי אוכלוסיית היעד. האפשרות של כפייה או השפעה בלתי הוגנת חייבת להיות ממוזערת, והנושא יש לתת מספיק זמן לשקול השתתפות. המשתתף חייב להיות גם תוכל לממש את זכותם ללבטל את ההסכמה בכל שלב במהלך המחקר ללא קנס. הסכמה מדעת מרצון היא תנאי מוקדם הכרחי להשתתפותו של נושא במחקר והוא גם יעיל 7 באופן חוקי. בהתאם לתקנות להגנה על האדם מכפיף 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html&quot;&gt;http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), יש ליידע משתתפי מחקר של מטרת המחקר, נהלים מעורבים במחקר, חלופות להשתתפות, כל סיכונים הנראה לעין ואי נוחות (כולל פגיעה לא רק פיזית אלא גם נזק פסיכולוגי, חברתי, כלכלי או אפשרי, אי נוחות, או אי נוחות), יתרונות של המחקר לחברה ואולי לאדם, משך זמן הנושא צפוי להשתתף, האדם ליצור קשר לקבלת תשובות לשאלות או במקרה של פגיעה הקשורות למחקר או לשעת חירום, הודעה, כי ההשתתפות היא בהתנדבות והסירוב שלהשתתף לא יגרום לכל השלכות או כל אובדן של הטבות כגון פשרה בטיפול קליני רגיל כי המשתתף זכאי אחר לקבל כתוצאה מ/ אבחנותיו, ובסופו הצהרה בדבר זכותו של הכפופים לסודיות וזכות לסגת מהמחקר בכל עת ללא כל השלכות. דגימות רקמה ממשתתפים שלבטל את ההסכמה במהלך המחקר לא צריכים להיות הפקידה ויש למצות באופן מיידי. ויתור של אחד או יותר אלמנטים של הסכמה מדעת ניתן לקבל מIRB לכמה פרויקטי מחקר שלא יכל כמעט להיעשות ללא שינוי לאלמנטים הנדרשים או ללימודים שבו אלמנטים הנדרשים אינם ישימים. יש לנקוט בזהירות רבה על מנת להבטיח סודיות הנתונים. ביטוח בריאות הטלטלות הדין והחשבון Act (HIPAA) הוא חוק פדרלי שמונע את שימוש באו גילוי &quot;מידע מוגן בריאות&quot; (PHI) ללא הסכמה בכתב מהמשתתפים. אובדן כושר עבודה כוללת אך לא מוגבל למידע המועבר בבריאות או נשמר בכל צורה או בינוני וכולל תחומים שיכולים לשמש לזיהוי 9 בודדים. דרך עבודה זו, אנו שואפים להתוות את הפרוטוקול שיש אחריו במהלך tissuעיבוד דואר - כוללים רכש, ואחסון ומדגישים את החשיבות של ביצוע הנחיות הקפדניות אלה כדי למזער את ההטיות שעלולות לגרום בשל לחצי רקמת נתונה על חילוץ. גם אנחנו נשתדל לספק סקירה קצרה של מבחני או ניתוחים (איור 1) שיכול להתבצע על דגימות כאלה במורד הזרם, כך שקוראים יכולים לעשות שיפוט מוסמך על מה assay (ים) המתאימים ביותר לצרכיהם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel disposable scalpels</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Cassettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>58931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA-stabilizing solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MAX-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>StatLab Medical Products</td>
			<td>28600-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Containers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-032-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting temperature solution (OCT)</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70&#956;m cell strainers</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead stain solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

working with human tissues for translational cancer research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

<html> התוצאות מוצגות להלן מתארות אסטרטגית gating cytometry זרימה לphenotyping חיסוני רחב על גידול מלנומה מעובד. היום של צביעה, דגימת רקמה הייתה מתעכל והומוגני עם אני collagenase וDNase אני דגירה של 60 דקות, על 37 מעלות צלזיוס מתחת 225 סל&quot;ד סיבוב. בעקבות עיכול, השעיה תא הייתה מסוננת דרך מסננת ת?...

Watch this Scientific Journal Video about Working with Human Tissues for Translational Cancer Research at JoVE.com

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

עבודה עם רקמות אנושיות לחקר סרטן Translational

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

working-with-human-tissues-for-translational-cancer-research

Research

JoVE Journal

Medicine

9.8K Views.  University of Texas MD Anderson Cancer Center. Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Video: Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Generation of Comprehensive Thoracic Oncology Database - Tool for Translational Research

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer specimens and clinical data to be available to researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database also captures a large volume of genomic and proteomic data obtained from various tumor tissue studies. A team of clinical and basic science researchers, a biostatistician, and a bioinformatics expert was convened to design the database. Variables of interest were clearly defined and their descriptions were written within a standard operating manual to ensure consistency of data annotation. Using a protocol for prospective tissue banking and another protocol for retrospective banking, tumor and normal tissue samples from patients consented to these protocols were collected. Clinical information such as demographics, cancer characterization, and treatment plans for these patients were abstracted and entered into an Access database. Proteomic and genomic data have been included in the database and have been linked to clinical information for patients described within the database. The data from each table were linked using the relationships function in Microsoft Access to allow the database manager to connect clinical and laboratory information during a query. The queried data can then be exported for statistical analysis and hypothesis generation.

A thoracic oncology database was developed to serve as a comprehensive repository for clinical and laboratory data for the purposes of translational research. The database will serve translational cancer researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database is adaptable to other cancer models, as well as other human diseases.

הדור של מסד נתונים מקיף החזה אונקולוגיה - כלי למחקר Translational

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

הקמה התפשטות של גידולים רטינובלסטומה האדם עכברים החיסון לקויה

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex Vivo זיהום של רקמה חיה עם וירוסים oncolytic

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

הדור ניסויית של קרצינומה-Associated Fibroblasts (CAFs) מ Fibroblasts החלב אנוש

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

עיבוד של הפחתה מאמופלסטית אדם ורקמות כריתה לתא תרבות

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma and devastating tissue loss. Despite favorable and highly encouraging early and intermediate functional outcomes, rejection of the highly immunogenic skin component of a VCA and potential adverse effects of chronic multi-drug immunosuppression continue to hamper widespread clinical application of VCA. Therefore, research in this novel field needs to focus on translational studies related to unique immunologic features of VCA and to develop novel immunomodulatory strategies for immunomodulation and tolerance induction following VCA without the need for long term immunosuppression.
This article describes a reliable and reproducible translational large animal model of VCA that is comprised of an osteomyocutaneous flap in a MHC-defined swine heterotopic hind limb allotransplantation. Briefly, a well-vascularized skin paddle is identified in the anteromedial thigh region using near infrared laser angiography. The underlying muscles, knee joint, distal femur, and proximal tibia are harvested on a femoral vascular pedicle. This allograft can be considered both a VCA and a vascularized bone marrow transplant with its unique immune privileged features. The graft is transplanted to a subcutaneous abdominal pocket in the recipient animal with a skin component exteriorized to the dorsolateral region for immune monitoring.
Three surgical teams work simultaneously in a well-coordinated manner to reduce anesthesia and ischemia times, thereby improving efficiency of this model and reducing potential confounders in experimental protocols. This model serves as the groundwork for future therapeutic strategies aimed at reducing and potentially eliminating the need for chronic multi-drug immunosuppression in VCA.

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation VCA Research

Vascularized Composite Allotransplantations (VCA) have become a clinical reality. However, broad clinical application of VCA is limited by chronic multi-drug immunosuppression. The authors present a reliable and reproducible large animal model to translate novel immunomodulatory strategies that can minimize or potentially eliminate the need of immunosuppression in VCA.

דגם השתלות Heterotopic החזירים הינד איבר השתנה לTranslational vascularized Composite Allotransplantation מחקר (VCA)

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

MR הדמיה המולקולרית של סרטן הערמונית עם חומר ניגוד ממוקד המולקולרי קטן CLT1 פפטיד

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

מוות של תאים הקשורים מיטוזה חריגה נצפה על ידי ההדמיה Confocal בתאי סרטן חיים

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...