אנו מכירים במימון DTRA לתמיכה של כתב היד הזה ומן ONR, DTRA, ו-NSF לתמיכה חלקית של המחקר הבסיסי.

<ol>
	<li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+generation+of+pH+gradients+in+microfluidic+devices+for+biofabrication+of+freestanding,+semi-permeable+chitosan+membranes.">In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes.</a> Lab Chip. 10, 59-65 (2010).</li><li>Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Activated+Ionic+Gelation+of+Common+Biopolymers.">Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers.</a> Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).</li><li>Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+capture+on+patterned+surfaces+coated+with+amphiphilic+biopolymers.">Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers.</a> Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+to+build+the+biology-device+interface.">Biofabrication to build the biology-device interface.</a> Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).</li><li>Yang, X., Shi, X. -. W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+Enzymatic+Reactions+for+the+Assembly+of+Proteins+at+Electrode+Addresses.">Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses.</a> Langmuir. 25, 338-344 (2008).</li><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+quantitative+visualization+and+characterization+of+chitosan+electrodeposition+with+paired+sidewall+electrodes.">In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes.</a> Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).</li><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+anodic+electrodeposition+of+calcium+alginate.">Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate.</a> Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).</li><li>Wu, L. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Selective+Deposition+of+a+Reactive+Polysaccharide+Layer+onto+a+Patterned+Template.">Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template.</a> Langmuir. 19, 519-524 (2003).</li><li>Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+antibodies+and+antigens+via+IgG-binding+domain+engineered+with+activatable+pentatyrosine+pro-tag.+Biotechnol.">Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol.</a> bioeng. , 103-231 (2009).</li><li>Shi, X. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagentless+Protein+Assembly+Triggered+by+Localized+Electrical+Signals.">Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals.</a> Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).</li><li>Shi, X. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroaddressing+of+Cell+Populations+by+Co-Deposition+with+Calcium+Alginate+Hydrogels.">Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels.</a> Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).</li><li>de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+based+microcapsules+for+immunoisolation+of+islet+cells.">Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells.</a> Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).</li><li>Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chitin+and+chitosan+nanofibers+and+their+biomedical+applications.">Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications.</a> Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).</li><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroaddressing+Functionalized+Polysaccharides+as+Model+Biofilms+for+Interrogating+Cell+Signaling.">Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling.</a> Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).</li><li>Meyer, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan-coated+wires:+conferring+electrical+properties+to+chitosan+fibers.">Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers.</a> Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).</li><li>Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -. C., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+biological+nanofactories+trigger+quorum+sensing+response+in+targeted+bacteria.">Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria.</a> Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).</li><li>Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+with+chitosan.">Biofabrication with chitosan.</a> Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).</li><li>Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACS+Symposium+Series+Ch.+4.">ACS Symposium Series Ch. 4.</a> Renewable and Sustainable Polymers. 1063, 61-71 (2011).</li><li>Koev, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan:+an+integrative+biomaterial+for+lab-on-a-chip+devices.">Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices.</a> Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).</li><li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+assembly+of+a+metabolic+pathway+enzyme+in+a+pre-packaged+reusable+bioMEMS+device.">Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device.</a> Lab Chip. 8, 420-430 (2008).</li><li>Spinks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+"dual+mode"+actuation+in+chitosan/polyaniline/carbon+nanotube+fibers.">A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers.</a> Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).</li><li>Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+assembly+of+genetically+modified+viral+nanotemplates+via+nucleic+acid+hybridization.">Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization.</a> Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).</li><li>Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-cycling+and+H2O2+generation+by+fabricated+catecholic+films+in+the+absence+of+enzymes.">Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes.</a> Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).</li><li>Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+transdermal+delivery+of+model+drug+compounds+by+MEMS+microneedle+array.">Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array.</a> Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).</li><li>Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microbial+biosensor+based+on+bacterial+cells+immobilized+on+chitosan+matrix.">A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix.</a> Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).</li><li>Selimoglu, S. M., Elibol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+as+an+immobilization+material+for+MAb+production+via+encapsulated+hybridoma+cells.">Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells.</a> Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).</li><li>Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentle+cell+trapping+and+release+on+a+microfluidic+chip+by+in+situ+alginate+hydrogel+formation.">Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation.</a> Lab Chip. 5, 553-559 (2005).</li><li>Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Film+Bioprocessing+and+Immunoanalysis+with+Electroaddressable+Stimuli-Responsive+Polysaccharides.">In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides.</a> Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).</li><li>Cheong, M., Zhitomirsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrodeposition+of+alginic+acid+and+composite+films.">Electrodeposition of alginic acid and composite films.</a> Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).</li><li>Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+induction+of+recombinant+proteins+by+minimally+rewiring+native+quorum+sensing+regulon+of+E.+coli.">Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli.</a> Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).</li></ol>

הפקה וגישה חופשית למאמר זה ממומן על ידי הרשות האמריקנית האיום הביטחון הפחתת.

הנהלים שלנו להפגין electrodeposition ו functionalization של סרטים biopolymer, תהליך שאנו טווח biofabrication. דרך functionalization עם תאים ביומולקולות אנחנו יוצרים משטחים ביולוגיים בעלי יכולת אינטראקציה זה עם זה ואת כתובת האלקטרודה הם התאספו על. צעד electrodeposition 1, מתרחש באמצעות הרכבה עצמית מופעלות של אלגינט, biopolymers ו chitosan במחקרים שלנו, בתגובה לאות חשמלי. כפי שצוין קודם לכן שיפוע pH מופק אשר יכול להיות נשלט על ידי צפיפות זרם וזמן בתצהיר, מתן שליטה נוספת על הממדים הסרט ומאפיינים 6,17. מצאנו כי מגוון של צפיפות הנוכחית זמן שילובים בתצהיר יכול לשמש את האלקטרודות המצוין בלוח 1. תוך שימוש באלקטרודות אחרים אינו ריאלי, התאמות ההליך יהיה צורך. לעומת טכניקות אחרות, של יצירת הסרט תהליך של electrodeposiהנחה זו היא פשוטה, מהירה reagentless. אין צורך רפרטואר רחב של ציוד יקר ההכנות מייגע. חשוב לציין כי התהליך יכול לעמוד סטיות ניסויים קטנים וניתן לעבוד בקלות מעל במקרה של בעיה. Chitosan הוא מסוגל להגיב שיפוע pH גבוה קתודית בשל תכונות פעילות חשובים המוקנות לו לפי תוכן גבוהה של אמינים ראשוניים. ב-pH גבוה (יותר מ pKa של ~ 6.3) אמינים הם deprotonated ו chitosan הופך מסיס, המאפשר יצירת הסרט. בעקבות בתצהיר, הסרטים יישאר מחובר האלקטרודה. עם זאת, היכולת קיימת delaminate אותם אם תרצה בכך. הסרטים תישאר יציבה כל עוד ה-pH של התמיסה לא לרדת מתחת pKa. פתרונות חומציים protonate את אמינים ואת repulsions אלקטרוסטטי הבאים להתנפח ג&#39;ל עד שהוא נמס 18. כלומר, תהליך ההרכבה / פירוק הפיך לפי דרישה AlloWS להסרת הסרטים שהופקדו ושימוש חוזר של אלקטרודות. נוח, טווח ה-pH שבו המעבר סול ג&#39;ל מתרחש קרוב לזה שבו מרכיבים ביולוגיים ביותר לתפקד בצורה אופטימלית. זה הופך את תהליך אידיאלי עבור השמירה של פונקציונליות במהלך הרכבת 6. הסרט היווצרות אלגינט הוא הקל על ידי אלקטרוליזה של מים anodic כמו גם נוכחות של סידן פחמתי 7. PH נמוך מקומי על האנודה solubilizes סידן פחמתי המוביל את קטיוני סידן שחרור. יונים אלה לטיפולי קלאציה של אלגינט, להקים רשת crosslinked על פני האלקטרודה. סרטים אלגינט הוא הפיך בעיקר על ידי תחרות על יוני סידן מן אחרים תרכובות chelating כגון ציטרט או EDTA, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לפזר את הסרטים, המאפשר שימוש חוזר של אלקטרודות היסוד. לכן, סרטים אלגינט שבירות יחסית, כאשר נתון בתנאים פיסיולוגיים כי יוני סידן הם בקלות שלcavenged של מטריקס ג&#39;ל, להחליש את המבנה שלה וקידום הסרט delamination או redissolution. כדי להתגבר על מגבלה זו, יש לנו כלל צעד הדגירה של הסרט ב 1 M CaCl 2 לחזק את הג&#39;ל. בנוסף, אנו ממליצים פתרון הדגירה של הסרט (מדיה נייד וכו &#39;) להשלים עם CaCl 2 בריכוז מ&quot;מ מיקרומטר-3 500. ההליך העיקרי השני הוא functionalization של הסרט שהופקדו עם רכיבים ביולוגיים רלוונטיים. זו יכולה להיות מושגת בשתי דרכים, לצמידה הראשון הוא אלקטרו, אסטרטגיה המאפשרת הרכבה מהירה reagentless של חלבונים עם שליטה מרחבית יוצא דופן 10. עם זאת, functionalization באופן זה הוא מוגבל על ידי דיפוזיה של Cl - יונים באמצעות הסרט אל האלקטרודה, כמו גם את הפצת HOCl, תגובתי שנוצר ביניים, חזרה אל הפתרון. היכולת של מולקולות פעילות electrochemically לעבורדרך הסרט מאפשר התמרה של אותות כימיים ביולוגיים לתוך קל לקרוא אותות חשמליים 15. הראינו טירוסינאז בתיווך צימוד כאסטרטגיה 2 עבור functionalization האנזים chitosan, שמפגינים קוולנטית חיבור AI-2 synthase. אסטרטגיה זו מאפשרת תהליך functionalization להיות מבוקרת סלקטיבית - תלוי מגיב מסוים, טירוסינאז, הפועל discriminately על חלבונים המכילים תג טירוזין 9. אנחנו מראים את התועלת ואת biocompatibility של הכתובת מרובה מערכות ידי שכפול מסלולים טבעיים על שבב. ראשית ארגנו שתי אוכלוסיות תאים (כלומר, &quot;שולחים&quot; ו &quot;מקלטי&quot;) על כתובות שונות, והראה כי הם אינטראקציה בין האלקטרודות הסמוכות לספק AI-2 וליצור תגובה פלואורסצנטי. תפיסה זו יש גם הוכחה על ידי נג et al. ב 14 שבבים microfluidic. אנחנו גם חיקה את האינטראקציה, אבל במקום להשתמשאנזים לסנתז AI-2 עבור משלוח. בדרך זו, מסלול תאיים סינתטי, AI-2 סינתזה, חזר על עצמו דרך biofabrication ופעל ככל שזה יהיה פתרון. בשני המקרים הרכבה של מספר כתובות מציג את האתגר של מניעת שאינו מחייב בין כתובות ספציפיות, כי כל פתרון חייב להיות מוצג בתצהיר למערך אלקטרודות כולו, למרות electrodeposition נועד רק לכתובת אחת. כביסה עדינה אך יסודית ניתן להסיר את רוב פתרון שיורית של מוטות שאינם אלקטרודות; השימוש זרימה בערוצים microfluidic עשוי לצמצם עוד יותר את הספציפיות לא. במיוחד biofabrication הסמוך chitosan וכתובות אלגינט, מומלץ להפקיד את הסרט chitosan 1, בעקבות זאת בצעדים biofunctionalization, ואחרי זה, electrodepositing אלגינט. למרות שלא עשינו אז הנה, מצאנו כי חסימת הסרט chitosan עם חלבונים אינרטי (כגון MILK, BSA, וכו &#39;) מפחיתה באופן משמעותי שאינם ספציפיים מחייב של מולקולות לא רצויות לפני השטח aminated של chitosan. מצאנו כלי עזר בהקמת אלקטרודות בדוגמת, לעתים קרובות למצוא מכשירים BioMEMS, בשם &quot;תוכניות&quot; של הסדר מורכב של תאים ביומולקולות. השימושים של electrodeposited chitosan ב BioMEMS התקנים יכול ללכת הרבה מעבר הדוגמאות שהוזכרו כאן 19. Chitosan יכול להיות מופקד על הגיאומטריות microscale שונים - כגון microchannels ועל משטחים לא מישוריים 20,15. הסרטים יכולים להיות גם שונה עם פולימרים אחרים וכן מגוון של חלבונים, דנ&quot;א, חלקיקים, ו חמזור פעילים מולקולות של מאפייני הרומן 21,22,23. במכשירים BioMEMS, סרטים chitosan שימשו למשלוח סמים, גילוי מולקולה חמזור וקטנים, Biocatalysis, ומחקרים סלולריים 20,23,24,25. באופן דומה, אלגינט הוא בשימוש נרחב כמו מטריקס תאים מלכודת ו נחקר על בלימה fluidic הפיך שלאוכלוסיות תאים בתוך הסרט immunoanalysis 26,27,28. סרטים מורכבים עבור יישומים הנדסת רקמות כבר מפוברק באמצעות electrodeposition אלגינט, עם מרכיבים כמו עם hydroxyapatite עבור שתלים אורתופדיים 29. בהפגנות שלנו biofabrication, הראינו גם את יחסי הגומלין בין מרכיבים ביולוגיים על פני ממשק ביו אלקטרונית לחול במידה שווה, זה מביא את האפשרות להגיע לשלב את כל סוגי אינטראקציות עבור ביצועים מתוחכמים של העברת אותות על השבב. בהתאם לכך, עשויה להקל על biofabrication ייצור של מכשירים עם &quot;גדלים תכונה מינימום&quot; צומצמו המשך ישיר על ההתפתחויות מהירים microfabrication, המונעים לעתים קרובות על ידי מוצרי האלקטרוניקה. כלומר, הבא של הדור הבא התקנים עלולה למעשה לכלול רכיבים ביולוגיים יציב המציעים הרכבה מופלאה של הטבע ויכולות זיהוי באריכות SCA קטן עוד יותרles מאשר מעשה ידי אדם מערכות. אנחנו מדמיינים לטווח הקרוב יישומים מכשור אנליטי, חיישנים סביבתיים, והתקנים מושתלת ביולוגית אפילו.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם הרכיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> ספק כוח </td><td> Keithley </td><td> SourceMeter 2400 </td></tr><tr><td> שלוש אלקטרודות potentiostat </td><td> CH מכשירים </td><td> Potentiostat / Galvanostat 600D </td></tr><tr><td> RE-5 ב Ag / AgCl הפניה אלקטרודה עם מחבר גמיש </td><td> בשיא </td><td> MF-2052 </td></tr><tr><td> סיליקון מצופה זהב רקיק, 500um סי, 12nm CR, 120nM Au, SiO 2 לבידוד </td><td> אישית מפוברק </td><td></td></tr><tr><td> אינדיום בדיל זכוכית מצופה תחמוצת שקופיות, מלבנית, 8-12 אוהם להתנגד </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 578274 </td></tr><tr><td> פלטינום גיליון / רדיד (0.002 ב) </td><td> Surepure Chemetals </td><td> 1897 </td></tr><tr><td> סלים קו 2 &quot;התנינים קליפים </td><td> RadioShack </td><td> 270-346 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> רב הערמה כבל בננה תיקון התוספת </td><td> TSElectronic </td><td> B-36-02 B-24-02 </td></tr><tr><td> SYLGARD 184 אלסטומר סיליקון ערכת </td><td> Dow Corning </td><td> NC9020938 מאת פישר </td></tr><tr><td> Fluorescecence סטראו </td><td> אולימפוס </td><td> MVX10 MacroView </td></tr><tr><td> cellSens רגיל </td><td> אולימפוס </td><td> גרסה 1.3 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. Electrodeposition וציוד הדמיה פלואורסצנטי. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Chitosan, משקל מולקולרי בינוני </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448877 </td></tr><tr><td> חומצה הידרוכלורית, ARISTAR. ACS, NF, ה-FCC כיתה </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td></tr><tr><td> נתרן הידרוקסידי, פתרון. 10.00N </td><td>VWR </td><td> VW3247 </td></tr><tr><td> חומצה Alginic, מלח נתרן </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 180947 </td></tr><tr><td> Multifex-MM זירז סידן פחמתי, חלקיקים 70nm </td><td> המומחיות מינרלים בע&quot;מ </td><td> 100-3630-3 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. Chitosan פתרון ריאגנטים אלגינט. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> סידן כלוריד, dihydrate </td><td> JT בייקר </td><td> 0504 </td></tr><tr><td> נתרן כלורי, מוסמך גבישי ACS </td><td> פישר מדעי </td><td> S271 </td></tr><tr><td> פוספט Monobasic אשלגן, נטול מים </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> פוספט Dibasic אשלגן, נטול מים </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3786 </td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו מלוחים </td><td> Sigma- אולדריץ </td><td> P4417 </td></tr></tbody></table> לוח 3. רכיבי פתרון אחר ריאגנטים חיץ. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברת / מקור </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> גלוקוז אוקסידאז של אספרגילוס ניז&#39;ר </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2133 </td></tr><tr><td> טירוסינאז מ פטריות </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3824 </td></tr><tr><td> LB מרק, מילר (מגורען) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP9723-2 </td></tr><tr><td> &quot;AI2-synthase&quot; (HGLPT) </td><td> מעבדת המניה 16 </td><td></td></tr><tr><td> W3110 wildtype תאים </td><td> מעבדת המניה 30 </td><td></td></tr><tr><td> MDAI2 + pCT6-lsrR - מגבר R + PET- <eמ&gt; dsRed - Kan-R תאים </td><td> מעבדת המניה 30 </td><td></td></tr><tr><td> FluoroSpheres: קוטר 1μm, אקס / em: 505/515 </td><td> Invitrogen </td><td> F8765 </td></tr><tr><td> 5 - (ו -6), carboxyrhodamine 6G succinimidyl אסתר, אקס / em: 525/560 </td><td> Invitrogen </td><td> C-6157 </td></tr><tr><td> DyLight נוגדנים תיוג קיט, 405 </td><td> Thermo Scientific </td><td> PI-53020 </td></tr></tbody></table> לוח 4. אנזימים, תאים, ריאגנטים functionalization אחרים.

bridging the bio-electronic interface with biofabrication

התקדמות ההבטחה על שבב מעבדת הטכנולוגיה לחולל מהפכה גם מחקר ורפואה באמצעות עלויות נמוכות יותר, רגישות יותר, ניידות, ותפוקה גבוהה יותר. שילוב של רכיבים ביולוגיים על גבי מערכות מיקרו ביולוגיים (BioMEMS) הראה פוטנציאל רב להשגת מטרות אלה. שבבים אלקטרוניים Microfabricated לאפשר מיקרומטר בקנה מידה תכונות, כמו גם חיבור חשמל עבור חישה actuation. רכיבים ביולוגיים פונקציונלית לתת למערכת יכולת זיהוי ספציפי של analytes, פונקציות אנזימטיות, וכן כל תא ויכולות. Microfabrication תהליכים סטנדרטיים ביו טכניקות אנליטיות כבר נוצלו בהצלחה במשך עשרות שנים בענפי מחשב ביולוגי, בהתאמה. שילוב שלהם ממשק בסביבת מעבדה על שבב, לעומת זאת, מביאה אתגרים חדשים. יש קריאה טכניקות שיכולות לבנות ממשק בין האלקטרודה ו compon הביולוגיאף אוזן גרון, כי היא קלה קל לפברק דפוס. Biofabrication, המתוארת כאן, היא אחת הגישות כך הראו הבטחה גדולה התאגדותה קל להרכיב רכיבים ביולוגיים עם צדדיות של פונקציות על שבב המופעלים. Biofabrication משתמש בחומרים ביולוגיים ומנגנונים ביולוגיים (הרכבה עצמית, הרכבה האנזימטית) להרכבה מלמטה למעלה היררכי. בעוד המעבדות שלנו הוכיחו את המושגים האלה בפורמטים רבים 1,2,3, כאן אנחנו מדגימים את תהליך ההרכבה מבוסס על electrodeposition ואחריו מספר יישומים של האות מבוססי אינטראקציות. תהליך ההרכבה כולל electrodeposition של גירויים, תגובה סרטים ביולוגית פולימר על אלקטרודות functionalization הבאים שלהם עם מרכיבים ביולוגיים כמו DNA, אנזימים, או תאים חיים 4.5. Electrodeposition מנצל את מפל pH נוצר על פני השטח של האלקטרודה מוטה מן אלקטרוליזהמים 6,7,. Chitosan ו אלגינט הם גירויים תגובה פולימרים ביולוגיים שניתן מופעלות עצמית יותך סרטים הידרוג&#39;ל בתגובה לאותות חשמליים הטילה 8. עובי של הידרוג אלה נקבעת על ידי המידה בה שיפוע pH משתרע בין האלקטרודה. זה יכול להיות שונה באמצעות צפיפויות שונות הנוכחית ושעות בתצהיר 6,7. פרוטוקול זה יתאר כמה סרטים chitosan מופקדים ו פונקציונליות ידי קוולנטית מצרף מרכיבים ביולוגיים לקבוצות שפע אמין העיקריים הקיימים על הסרט בין אם באמצעות שיטות אנזימטיות או אלקטרוכימי 9,10. סרטים אלגינט ו מלכודת שלהם תאים חיים גם להתייחס 11. לבסוף, תוכנית השירות של biofabrication מודגם באמצעות דוגמאות של אינטראקציה המבוססת על אותות כימיים, כולל אל חשמלי, תא תא אל, וגם אנזים אל התא אות השידור. שניהם electrodepositionו functionalization יכול להתבצע תחת תנאים פיזיולוגיים כמעט ללא צורך ריאגנטים ובכך לחסוך רכיבים ביולוגיים יציב ממצבים קשים. בנוסף, הן chitosan ו אלגינט כבר זמן רב למטרות ביולוגית הרלוונטיים 12,13. בסך הכל, biofabrication, טכניקה מהירה שיכולה להתבצע רק על benchtop, יכול לשמש ליצירת בקנה מידה מיקרון דפוסים של רכיבים ביולוגיים תפקודית על אלקטרודות והוא יכול לשמש עבור מגוון רחב של מעבדה על שבב יישומים.

Watch this Scientific Journal Video about Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication at JoVE.com

Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

מאמר זה מתאר גישה biofabrication: בתצהיר של גירויים, תגובה סוכרים בנוכחות אלקטרודות משוחדים ליצור סרטים ביולוגית אשר יכולה להיות פונקציונליות עם תאים או חלבונים. אנחנו מדגימים אסטרטגיה הספסל העליון לדור של סרטים כמו גם השימושים הבסיסיים ליצירת משטחים biofunctionalized אינטראקטיביים עבור מעבדה על שבב יישומים.

גישור ממשק ביו אלקטרונית עם Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and ...

bridging-the-bio-electronic-interface-with-biofabrication

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.6K Views.  University of Maryland. מאמר זה מתאר גישה biofabrication: בתצהיר של גירויים, תגובה סוכרים בנוכחות אלקטרודות משוחדים ליצור סרטים ביולוגית אשר יכולה להיות פונקציונליות עם תאים או חלבונים. אנחנו מדגימים אסטרטגיה הספסל העליון לדור של סרטים כמו גם השימושים הבסיסיים ליצירת משטחים biofunctionalized אינטר?...

Video: Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

זהב Nanostar סינתזה עם שיטת Seed כסף מתווכת צמיחה

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or erosion. Amelogenin has been proven to be a critical protein for controlling the organized growth of apatite crystals. In this paper, we present a detailed protocol for superficial enamel reconstruction by using a novel amelogenin-chitosan hydrogel. Compared to other conventional treatments, such as topical fluoride and mouthwash, this method not only has the potential to prevent the development of dental caries but also promotes significant and durable enamel restoration. The organized enamel-like microstructure regulated by amelogenin assemblies can significantly improve the mechanical properties of etched enamel, while the dense enamel-restoration interface formed by an in situ regrowth of apatite crystals can improve the effectiveness and durability of restorations. Furthermore, chitosan hydrogel is easy to use and can suppress bacterial infection, which is the major risk factor for the occurrence of dental caries. Therefore, this biocompatible and biodegradable amelogenin-chitosan hydrogel shows promise as a biomaterial for the prevention, restoration, and treatment of defective enamel.

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

In this article, we describe a protocol for fabricating an amelogenin-chitosan hydrogel for superficial enamel reconstruction. Organized in situ growth of apatite crystals in the hydrogel formed a dense enamel-restoration interface, which will improve the effectiveness and durability of restorations.

פיתוח של Hydrogel Amelogenin-chitosan עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; אמייל לצמיחה מחודשת עם ממשק צפוף

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

שיטות העצמי הוא השילוב של Biopolymers Megamolecular על ממשק האוויר-LC הייבוש

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

באמצעות ביולוגיה סינתטית מהנדס תאים חיים המתממשקות חומרים לתכנות

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Fabrication of the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in the Adult Rat

Recent advances in neuroprosthetics have enabled those living with extremity loss to reproduce many functions native to the absent extremity, and this is often accomplished through integration with the peripheral nervous system. Unfortunately, methods currently employed are often associated with significant tissue damage which prevents prolonged use. Additionally, these devices often lack any meaningful degree of sensory feedback as their complex construction dampens any vibrations or other sensations a user may have previously depended on when using more simple prosthetics. The composite regenerative peripheral nerve interface (C-RPNI) was developed as a stable, biologic construct with the ability to amplify efferent motor nerve signals while providing simultaneous afferent sensory feedback. The C-RPNI consists of a segment of free dermal and muscle graft secured around a target mixed sensorimotor nerve, with preferential motor nerve reinnervation of the muscle graft and sensory nerve reinnervation of the dermal graft. In rats, this construct has demonstrated the generation of compound muscle action potentials (CMAPs), amplifying the target nerve&#39;s signal from the micro- to milli-volt level, with signal to noise ratios averaging approximately 30-50. Stimulation of the dermal component of the construct generates compound sensory nerve action potentials (CSNAPs) at the proximal nerve. As such, this construct has promising future utility towards the realization of the ideal, intuitive prosthetic.

Fabrication of the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface C-RPNI in the Adult Rat

The following manuscript describes a novel method for developing a biologic, closed loop neural feedback system termed the composite regenerative peripheral nerve interface (C-RPNI). This construct has the ability to integrate with peripheral nerves to amplify efferent motor signals while simultaneously providing afferent sensory feedback.

ייצור של ממשק היקפי מורכב משובי היקפית (C-RPNI) בעכברוש למבוגרים

Recent advances in neuroprosthetics have enabled those living with extremity loss to reproduce many functions native to the absent extremity, and this is ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

הדמיית זרימת דם עם דופלר אולטרה מהיר

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits versus other methods: DIBs are stable and often long-lasting, bilayer area can be reversibly tuned, leaflet asymmetry is readily controlled via droplet compositions, and tissue-like networks of bilayers can be obtained by adjoining many droplets. Forming DIBs requires spontaneous assembly of lipids into high density lipid monolayers at the surfaces of the droplets. While this occurs readily at room temperature for common synthetic lipids, a sufficient monolayer or stable bilayer fails to form at similar conditions for lipids with melting points above room temperature, including some cellular lipid extracts. This behavior has likely limited the compositions&#8212;and perhaps the biological relevance&#8212;of DIBs in model membrane studies. To address this problem, an experimental protocol is presented to carefully heat the oil reservoir hosting DIB droplets and characterize the effects of temperature on the lipid membrane. Specifically, this protocol shows how to use a thermally conductive aluminum fixture and resistive heating elements controlled by a feedback loop to prescribe elevated temperatures, which improves monolayer assembly and bilayer formation for a wider set of lipid types. Structural characteristics of the membrane, as well as the thermotropic phase transitions of the lipids comprising the bilayer, are quantified by measuring the changes in electrical capacitance of the DIB. Together, this procedure can aid in evaluating biophysical phenomena in model membranes over various temperatures, including determining an effective melting temperature (TM) for multi-component lipid mixtures. This capability will thus allow for closer replication of natural phase transitions in model membranes and encourage the formation and use of model membranes from a wider swath of membrane constituents, including those that better capture the heterogeneity of their cellular counterparts.

This protocol details the use of a feedback temperature-controlled heating system to promote lipid monolayer assembly and droplet interface bilayer formation for lipids with elevated melting temperatures, and capacitance measurements to characterize temperature-driven changes in the membrane.

הרכבה ואפיון מבוקרי טמפרטורה של Bilayer ממשק טיפה

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

ייצור והפעלה של זרימה רציפה, מערכת מיקרו-אלקטרופורציה עם זיהוי חלחול

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...