Reconocemos la financiación de la DTRA para el apoyo de este manuscrito y de la ONR, DTRA, y la NSF para el apoyo parcial de la investigación subyacente.

<ol>
	<li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+generation+of+pH+gradients+in+microfluidic+devices+for+biofabrication+of+freestanding,+semi-permeable+chitosan+membranes.">In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes.</a> Lab Chip. 10, 59-65 (2010).</li><li>Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Activated+Ionic+Gelation+of+Common+Biopolymers.">Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers.</a> Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).</li><li>Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. 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M., Elibol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+as+an+immobilization+material+for+MAb+production+via+encapsulated+hybridoma+cells.">Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells.</a> Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).</li><li>Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentle+cell+trapping+and+release+on+a+microfluidic+chip+by+in+situ+alginate+hydrogel+formation.">Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation.</a> Lab Chip. 5, 553-559 (2005).</li><li>Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Film+Bioprocessing+and+Immunoanalysis+with+Electroaddressable+Stimuli-Responsive+Polysaccharides.">In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides.</a> Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).</li><li>Cheong, M., Zhitomirsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrodeposition+of+alginic+acid+and+composite+films.">Electrodeposition of alginic acid and composite films.</a> Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).</li><li>Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+induction+of+recombinant+proteins+by+minimally+rewiring+native+quorum+sensing+regulon+of+E.+coli.">Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli.</a> Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).</li></ol>

La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por la Agencia de los Estados Unidos de Defensa de Reducción de Amenazas.

Nuestros procedimientos de demostrar la electrodeposición y funcionalización de películas de biopolímeros, un proceso que llamamos biofabrication. A través de funcionalización con las células y biomoléculas que crear superficies biológicas capaces de interactuar entre sí y la dirección de electrodos están montados sobre. El primer paso, electrodeposición, se lleva a cabo a través de la activa auto-ensamblaje de biopolímeros, alginato y quitosano en nuestros estudios, en respuesta a una señal eléctrica. Como se indicó anteriormente un gradiente de pH se genera que puede ser controlado por la densidad de corriente y el tiempo de deposición, proporcionando un control adicional sobre las dimensiones y propiedades de película 6,17. Hemos encontrado que una variedad de densidad de corriente y combinaciones de deposición de tiempo puede ser utilizado para los electrodos indicados en la Tabla 1. Mientras que el uso de otros electrodos es factible, ajustes en el procedimiento sería necesario. En comparación con otras técnicas de formación de la película el proceso de electrodeposición es simple, rápida y reactivos,. No hay necesidad de un extenso repertorio de equipos costosos y laboriosos preparativos. Es importante destacar que el proceso puede soportar pequeñas desviaciones experimentales y se pueden iniciar fácilmente por si ocurre algún problema. El quitosano es capaz de responder a un gradiente de pH alto catódica debido a importantes propiedades funcionales que le confiere un alto contenido de aminas primarias. A pH elevado (mayor que su pKa de ~ 6,3) las aminas se desprotona y quitosano se vuelve insoluble, lo que permite la formación de película. Tras la deposición, las películas permanecerá unida al electrodo. Sin embargo, existe la capacidad para deslaminar si se desea. Las películas se mantiene estable siempre y cuando el pH de la solución no caiga por debajo del pKa. Las soluciones ácidas protonar las aminas y las repulsiones electrostáticas posteriores engrosar el gel hasta que se disuelva 18. Es decir, el proceso de montaje / desmontaje es reversible en la demanda y alloeb para la eliminación de películas depositadas y la reutilización de los electrodos. Convenientemente, el rango de pH en el que la transición sol-gel tiene lugar está cerca de aquel en el que los componentes más biológicos funcionar de manera óptima. Esto hace que el ideal procedimiento para la retención de la funcionalidad durante el montaje 6. Formación alginato película se ve facilitada por la electrólisis anódica de agua, así como la presencia de carbonato de calcio 7. El pH bajo localizada en el ánodo solubiliza el carbonato de calcio que conduce a los cationes de liberación de calcio. Estos iones están quelado por alginato, formando una red reticulada sobre la superficie del electrodo. Películas de alginato son notablemente reversible por la competencia por los iones de calcio procedentes de otros compuestos quelantes tales como citrato o EDTA, que pueden ser utilizados para disolver las películas, lo que permite la reutilización de los electrodos subyacentes. Así, las películas de alginato son relativamente frágiles cuando se somete a condiciones fisiológicas debido a los iones de calcio son fácilmente scavenged de la matriz de gel, lo que debilita su estructura y la promoción de delaminación o redisolución. Para superar esta limitación, se ha incluido una etapa de incubación para la película en 1 M CaCl 2 para reforzar el gel. Además, se recomienda que la solución de la película de incubación (medios celulares, etc) se suplementado con CaCl 2 a una concentración de 500 mM-3 mM. El procedimiento mayor segunda es la funcionalización de la película depositada con los correspondientes componentes biológicos. Esto se puede conseguir de dos maneras, siendo la primera conjugación electroquímica, una estrategia que permite un montaje rápido, reactivos, de las proteínas con un control excepcional espacial 10. Sin embargo, la funcionalización de esta manera está limitada por la difusión de los iones Cl - a través de la película al electrodo, así como la difusión de HOCl, la generada intermedio reactivo, de vuelta a cabo en solución. La capacidad de las moléculas electroquímicamente activas para pasara través de la película permite la transducción de señales químicas y biológicas en fácil de leer las señales eléctricas 15. Hemos demostrado la tirosinasa mediada por acoplamiento como una segunda estrategia para funcionalización enzima a quitosano, demostrado por unión covalente de AI-2 sintasa. Esta estrategia permite que el proceso de funcionalización a ser controlada y selectiva - depende de un reactivo específico, la tirosinasa, que actúa en forma discriminatoria las proteínas que contienen una etiqueta de la tirosina 9. Se demuestra la utilidad y la biocompatibilidad de los sistemas multi-dirección mediante la replicación de las vías naturales en un chip. En primer lugar se organizaron dos poblaciones de células (es decir &quot;remitentes&quot; y &quot;receptores&quot;) en direcciones distintas, y demostró que se relacionaban a través de electrodos adyacentes para entregar el AI-2 y generar una respuesta de fluorescencia. Este concepto también se ha demostrado por Cheng et al. en un 14 chip de microfluidos. También imitó la interacción, pero en lugaruna enzima para sintetizar el AI-2 para la entrega. De este modo, una vía de síntesis intracelular, AI-2 síntesis, se replica a través biofabrication y funcionaban tanto como lo haría en solución. En ambos casos, el montaje de varias direcciones presenta el desafío de evitar no específicos de unión entre las direcciones porque cada solución de deposición deben ser introducidos a la matriz de electrodos todo, aunque electrodeposición sólo está destinado a una dirección. Lavado suave pero completa puede eliminar la mayor parte de la solución residual de electrodos e imparciales, el uso del flujo en canales de microfluidos puede además reducir al mínimo la no especificidad. En particular, para la biofabrication adyacente de quitosano y direcciones de alginato, se recomienda depositar la película de quitosano primero, después de esto con pasos biofuncionalización, y después de esto, electrodepositing alginato. A pesar de que no lo han hecho aquí, hemos encontrado que el bloqueo de la película de quitosano con proteínas inertes (tales como milésimask, BSA, etc) disminuye en gran medida no específicos de unión de las moléculas no deseadas a la superficie del quitosano aminado. Hemos encontrado utilidad en el establecimiento de electrodos con dibujos, a menudo se encuentran en dispositivos bioMEMS, como los &quot;planos&quot; de un arreglo complejo de células y biomoléculas. Los usos de electrodepositado quitosano en dispositivos bioMEMS puede ir mucho más allá de los ejemplos aquí mencionados 19. El quitosano se puede depositar sobre diversos geometrías microescala, como en microcanales y sobre superficies no planas de 20,15. Las películas también se pueden modificar con otros polímeros y una variedad de proteínas, ADN, nanopartículas y moléculas activas redox para 21,22,23 propiedades novedosas. En los dispositivos bioMEMS, las películas de quitosano se han utilizado para la administración de fármacos, la detección de moléculas redox y pequeño, biocatálisis, y los estudios de células 20,23,24,25. De manera similar, el alginato se utiliza ampliamente como una matriz de células-atrapamiento y ha sido explorado para la contención de fluidos reversiblelas poblaciones de células y en la película inmunoanálisis 26,27,28. Películas compuestas para aplicaciones de ingeniería de tejidos han sido fabricados utilizando electrodeposición alginato, con componentes tales como con hidroxiapatita para implantes ortopédicos 29. En nuestras manifestaciones de biofabrication, hemos demostrado tanto las interacciones entre los componentes biológicos ya través de la interfaz de bio-electrónico para ser igualmente aplicables; esto trae en llegar a la perspectiva de la integración de todas las variedades de interacciones para un rendimiento sofisticado en la transmisión de señales en el chip. En consecuencia, biofabrication puede facilitar la fabricación de dispositivos con la reducción de tamaños de la característica &quot;mínimo&quot;, como una consecuencia directa de la rápida evolución de la microfabricación, como a menudo motivados por la electrónica de consumo. Es decir, próximos dispositivos de próxima generación podría, de hecho, son lábiles componentes biológicos que ofrecen conjunto exquisito de la naturaleza y las capacidades de reconocimiento en detalle aún más pequeño scales de los sistemas artificiales. Tenemos la visión de corto plazo en aplicaciones de instrumentación analítica, sensores ambientales, y los dispositivos implantables, incluso biocompatibles.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del componente </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Fuente de alimentación </td><td> Keithley </td><td> Fuente-2400 </td></tr><tr><td> Tres electrodos potenciostato </td><td> CH Instruments </td><td> Potenciostato / Galvanostato 600D </td></tr><tr><td> RE-5B de Ag / AgCl Electrodo de referencia con un conector flexible </td><td> BASI </td><td> MF-2052 </td></tr><tr><td> Oro oblea de silicio recubierto, 500um de Si, 12nm de Cr, 120 nM Au, SiO 2 para aislamiento </td><td> fabricado a </td><td></td></tr><tr><td> El óxido de estaño e indio corredera de vidrio revestido, rectangular, 8-12 ohmios resistir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 578274 </td></tr><tr><td> Platinum hoja / hoja (0,002 pulgadas) </td><td> Surepure Chemetals </td><td> 1897 </td></tr><tr><td> Línea delgada &quot;2 pinzas de cocodrilo </td><td> RadioShack </td><td> 270-346 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Multi-Stacking Cable Plug banana parche </td><td> TSElectronic </td><td> B-36-02 B-24-02 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 kit de silicona de elastómero </td><td> Dow Corning </td><td> NC9020938 Desde Fischer </td></tr><tr><td> Fluorescecence microscopio estereoscópico </td><td> Olimpo </td><td> MVX10 MacroView </td></tr><tr><td> cellSens estándar </td><td> Olimpo </td><td> la versión 1.3 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Electrodeposición y el equipo de visualización de fluorescencia. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> El quitosano, peso molecular medio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448877 </td></tr><tr><td> Ácido clorhídrico, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grado </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td></tr><tr><td> Hidróxido de sodio, solución. 10.00N </td><td>VWR </td><td> VW3247 </td></tr><tr><td> El ácido algínico, sal de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 180947 </td></tr><tr><td> Multifex-MM precipitado Carbonato de calcio, las partículas de 70 nm </td><td> Especialidad Minerals Inc. </td><td> 100-3630-3 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Quitosano y reactivos de alginato de solución. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> El cloruro de calcio, dihidratado </td><td> JT Baker </td><td> 0504 </td></tr><tr><td> Cloruro de Sodio, certificado Cristalina ACS </td><td> Fischer Científico </td><td> S271 </td></tr><tr><td> Fosfato de potasio monobásico, anhidro </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> Fosfato de potasio dibásico, anhidro </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3786 </td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino </td><td> Sigma- Aldrich </td><td> P4417 </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Otros componentes de la solución y los reactivos de amortiguamiento. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa / Fuente </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> La glucosa oxidasa de Aspergillus niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2133 </td></tr><tr><td> La tirosinasa de hongos </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3824 </td></tr><tr><td> LB caldo, Miller (granulado) </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP9723-2 </td></tr><tr><td> &quot;AI2-sintasa&quot; (HGLPT) </td><td> LAB 16 </td><td></td></tr><tr><td> W3110 células de tipo salvaje </td><td> Laboratorio de acción 30 </td><td></td></tr><tr><td> MDAI2 + pCT6-LSRR - amplificador de I + pET- <em&gt; DsRed - Kan ® células </td><td> Laboratorio de acción 30 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoroesferas: diámetro 1um, Ex / Em: 505/515 </td><td> Invitrogen </td><td> F8765 </td></tr><tr><td> 5 - (y-6)-6G carboxyrhodamine succinimidil éster, Ex / Em: 525/560 </td><td> Invitrogen </td><td> C-6157 </td></tr><tr><td> DyLight anticuerpos kit de etiquetado, 405 </td><td> Thermo Scientific </td><td> PI-53020 </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Las enzimas, células, y otros reactivos de funcionalización.

bridging the bio-electronic interface with biofabrication

Los avances en la promesa de la tecnología de laboratorio-en-un-chip para revolucionar la investigación y la medicina a través de menores costos, una mejor sensibilidad, portabilidad, y un mayor rendimiento. La incorporación de componentes biológicos biológicos Desciende en sistemas microelectromecánicos (bioMEMS) ha mostrado un gran potencial para el logro de estos objetivos. Microfabricated chips electrónicos para permitir características escala micrómetro-así como una conexión eléctrica para la detección y accionamiento. Funcionales componentes biológicos dar al sistema la capacidad para la detección específica de analitos, funciones enzimáticas y las capacidades de células enteras. Los procesos estándar de microfabricación y técnicas de bio-analíticos se han utilizado con éxito durante décadas en las industrias de la informática y biológica, respectivamente. Su combinación y la interconexión en un entorno de laboratorio-en-un-chip, sin embargo, da a luz a nuevos desafíos. Hay una convocatoria de técnicas que puede crear una interfaz entre el electrodo y COMPON biológicaENT que es suave y es fácil de fabricar y el patrón. Biofabrication, que se describe aquí, es un enfoque de tal manera que se ha demostrado una gran promesa para su fácil montaje incorporación de los componentes biológicos con una versatilidad en las funciones en el chip que están habilitadas. Biofabrication utiliza materiales biológicos y los mecanismos biológicos (auto-ensamblaje, ensamblaje enzimática) de abajo hacia arriba asamblea jerárquica. Mientras que nuestros laboratorios han demostrado que estos conceptos en muchos formatos 1,2,3, aquí se demuestra el proceso de montaje sobre la base de electrodeposición seguido de múltiples aplicaciones de base de la señal de las interacciones. El proceso de montaje consiste en la electrodeposición de películas de polímeros biocompatibles estímulos-respuesta en los electrodos y su funcionalización posterior con componentes biológicos tales como ADN, enzimas, o células vivas 4,5. La electrodeposición se aprovecha de la gradiente de pH creado en la superficie de un electrodo sesgado de la electrólisisde agua 6,7,. El quitosano y alginato son sensibles a estímulos polímeros biológicos que se pueden activar a la auto-ensamblan para formar películas de hidrogel en respuesta a señales eléctricas impuestas por el 8. El espesor de estos hidrogeles se determina por el grado en que el gradiente de pH se extiende desde el electrodo. Esto se puede modificar mediante diferentes densidades de corriente y los tiempos de deposición 6,7. Este protocolo se describe cómo las películas de quitosano se depositan y funcionalizado por unión covalente de los componentes biológicos de los grupos amina primarios abundantes presentes en la película a través de cualquiera de los métodos enzimáticos o electroquímica 9,10. Películas de alginato y su atrapamiento de células vivas también se abordarán 11. Finalmente, la utilidad de biofabrication se demuestra mediante ejemplos de la señal basada en la interacción química, incluyendo-a-eléctrica, de célula a célula, y también enzima-a-célula de transmisión de la señal. Tanto la electrodeposicióny funcionalización puede llevarse a cabo en condiciones próximas a las condiciones fisiológicas sin la necesidad de reactivos y, por tanto sobra lábiles componentes biológicos de las duras condiciones. Además, tanto el quitosano y alginato han sido utilizados para los propósitos biológicamente relevantes 12,13. En general, biofabrication, una técnica rápida que puede ser simplemente realiza en una mesa de trabajo, se puede utilizar para crear patrones micras escala de funcionales componentes biológicos en los electrodos y se puede utilizar para una variedad de laboratorio en un chip aplicaciones.

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Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Este artículo describe un enfoque biofabrication: deposición de estímulos-respuesta polisacáridos en la presencia de electrodos sesgadas para crear películas biocompatibles que pueden ser funcionalizados con células o proteínas. Se demuestra una estrategia de sobremesa para la generación de las películas, así como sus usos básicos para crear superficies interactivas biofuncionalizadas de laboratorio-en-un-chip de aplicaciones.

Reducción de la interfaz de Bio-electrónica con Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and ...

bridging-the-bio-electronic-interface-with-biofabrication

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.6K vistas.  University of Maryland. Este artículo describe un enfoque biofabrication: deposición de estímulos-respuesta polisacáridos en la presencia de electrodos sesgadas para crear películas biocompatibles que pueden ser funcionalizados con células o proteínas. Se demuestra una estrategia de sobremesa para la generación de las películas, así como sus usos básicos para crear superficies interactivas biofuncionalizadas de laboratorio-en-un-chip de aplicaciones.