Nous reconnaissons le financement de DTRA pour le soutien de ce manuscrit et de l&#39;ONR, DTRA, et la NSF pour le soutien partielle de la recherche sous-jacente.

<ol>
	<li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+generation+of+pH+gradients+in+microfluidic+devices+for+biofabrication+of+freestanding,+semi-permeable+chitosan+membranes.">In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes.</a> Lab Chip. 10, 59-65 (2010).</li><li>Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Activated+Ionic+Gelation+of+Common+Biopolymers.">Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers.</a> Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).</li><li>Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+capture+on+patterned+surfaces+coated+with+amphiphilic+biopolymers.">Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers.</a> Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+to+build+the+biology-device+interface.">Biofabrication to build the biology-device interface.</a> Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).</li><li>Yang, X., Shi, X. -. W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+Enzymatic+Reactions+for+the+Assembly+of+Proteins+at+Electrode+Addresses.">Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses.</a> Langmuir. 25, 338-344 (2008).</li><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+quantitative+visualization+and+characterization+of+chitosan+electrodeposition+with+paired+sidewall+electrodes.">In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes.</a> Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).</li><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+anodic+electrodeposition+of+calcium+alginate.">Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate.</a> Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).</li><li>Wu, L. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Selective+Deposition+of+a+Reactive+Polysaccharide+Layer+onto+a+Patterned+Template.">Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template.</a> Langmuir. 19, 519-524 (2003).</li><li>Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+antibodies+and+antigens+via+IgG-binding+domain+engineered+with+activatable+pentatyrosine+pro-tag.+Biotechnol.">Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol.</a> bioeng. , 103-231 (2009).</li><li>Shi, X. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagentless+Protein+Assembly+Triggered+by+Localized+Electrical+Signals.">Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals.</a> Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).</li><li>Shi, X. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroaddressing+of+Cell+Populations+by+Co-Deposition+with+Calcium+Alginate+Hydrogels.">Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels.</a> Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).</li><li>de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+based+microcapsules+for+immunoisolation+of+islet+cells.">Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells.</a> Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).</li><li>Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chitin+and+chitosan+nanofibers+and+their+biomedical+applications.">Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications.</a> Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).</li><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroaddressing+Functionalized+Polysaccharides+as+Model+Biofilms+for+Interrogating+Cell+Signaling.">Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling.</a> Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).</li><li>Meyer, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan-coated+wires:+conferring+electrical+properties+to+chitosan+fibers.">Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers.</a> Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).</li><li>Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -. C., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+biological+nanofactories+trigger+quorum+sensing+response+in+targeted+bacteria.">Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria.</a> Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).</li><li>Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+with+chitosan.">Biofabrication with chitosan.</a> Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).</li><li>Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACS+Symposium+Series+Ch.+4.">ACS Symposium Series Ch. 4.</a> Renewable and Sustainable Polymers. 1063, 61-71 (2011).</li><li>Koev, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan:+an+integrative+biomaterial+for+lab-on-a-chip+devices.">Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices.</a> Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).</li><li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+assembly+of+a+metabolic+pathway+enzyme+in+a+pre-packaged+reusable+bioMEMS+device.">Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device.</a> Lab Chip. 8, 420-430 (2008).</li><li>Spinks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+"dual+mode"+actuation+in+chitosan/polyaniline/carbon+nanotube+fibers.">A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers.</a> Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).</li><li>Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+assembly+of+genetically+modified+viral+nanotemplates+via+nucleic+acid+hybridization.">Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization.</a> Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).</li><li>Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-cycling+and+H2O2+generation+by+fabricated+catecholic+films+in+the+absence+of+enzymes.">Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes.</a> Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).</li><li>Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+transdermal+delivery+of+model+drug+compounds+by+MEMS+microneedle+array.">Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array.</a> Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).</li><li>Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microbial+biosensor+based+on+bacterial+cells+immobilized+on+chitosan+matrix.">A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix.</a> Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).</li><li>Selimoglu, S. M., Elibol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+as+an+immobilization+material+for+MAb+production+via+encapsulated+hybridoma+cells.">Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells.</a> Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).</li><li>Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentle+cell+trapping+and+release+on+a+microfluidic+chip+by+in+situ+alginate+hydrogel+formation.">Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation.</a> Lab Chip. 5, 553-559 (2005).</li><li>Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Film+Bioprocessing+and+Immunoanalysis+with+Electroaddressable+Stimuli-Responsive+Polysaccharides.">In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides.</a> Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).</li><li>Cheong, M., Zhitomirsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrodeposition+of+alginic+acid+and+composite+films.">Electrodeposition of alginic acid and composite films.</a> Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).</li><li>Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+induction+of+recombinant+proteins+by+minimally+rewiring+native+quorum+sensing+regulon+of+E.+coli.">Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli.</a> Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).</li></ol>

La production et l&#39;accès gratuit à cet article est sponsorisé par l&#39;Agence américaine de défense des États réduction de la menace.

Nos procédures de démontrer l&#39;électrodéposition et la fonctionnalisation des films en biopolymère, un processus que nous appelons biofabrication. Grâce à fonctionnalisation avec des cellules et des biomolécules on crée des surfaces biologiques capables d&#39;interagir les uns avec les autres et l&#39;électrode d&#39;adressage sont assemblés sur. La première étape, l&#39;électrodéposition, a lieu à travers l&#39;auto-assemblage a déclenché des biopolymères, de l&#39;alginate et de chitosane dans nos études, en réponse à un signal électrique. Comme indiqué précédemment un gradient de pH est généré qui peut être commandé par la densité de courant et le temps de dépôt, fournir un contrôle supplémentaire sur les dimensions des films et des propriétés 6,17. Nous avons trouvé qu&#39;une variété de densité de courant et les combinaisons de temps de dépôt peut être utilisé pour les électrodes indiquées dans le tableau 1. Bien que l&#39;utilisation d&#39;autres électrodes est possible, des ajustements à la procédure serait nécessaire. En comparaison avec d&#39;autres techniques de formation d&#39;un film sur le processus de electrodeposition est simple, rapide et réactif,. Il n&#39;y a pas besoin d&#39;un vaste répertoire de matériel coûteux et des préparations laborieuses. Surtout, le processus peut résister à des écarts mineurs expérimentales et peut être facilement commencé plus si un problème survient. Le chitosane est capable de répondre à un gradient de pH cathodique élevé en raison de propriétés fonctionnelles importantes qui lui sont conférées par une teneur élevée des amines primaires. À un pH élevé (supérieur à son pKa de 6,3 ~) les amines sont déprotoné et le chitosane devient insoluble, ce qui permet la formation du film. Après dépôt, les films resteront attachés à l&#39;électrode. Toutefois, la capacité existe pour les décoller si vous le souhaitez. Les films reste stable aussi longtemps que le pH de la solution ne chute pas en dessous du pKa. Solutions acides protoner les amines et les répulsions électrostatiques ultérieures gonfler le gel jusqu&#39;à ce qu&#39;il se dissout 18. Autrement dit, le processus de montage / démontage est réversible à la demande et allows pour l&#39;enlèvement des films déposés et la réutilisation des électrodes. Idéalement, la gamme de pH à laquelle la transition sol-gel a lieu est proche de celui dans lequel les composants les plus biologiques fonctionner de manière optimale. Cela rend le processus idéal pour la conservation de la fonctionnalité lors de l&#39;assemblage 6. Formation d&#39;un film d&#39;alginate est facilitée par l&#39;électrolyse anodique de l&#39;eau ainsi que la présence de carbonate de calcium 7. Le pH faible localisée à l&#39;anode solubilise le carbonate de calcium conduisant à des cations calcium libération. Ces ions sont chélaté par l&#39;alginate, formant un réseau réticulé sur la surface d&#39;électrode. Des films d&#39;alginate sont notamment réversible par compétition pour des ions calcium à partir de composés chélatants tels que l&#39;EDTA ou du citrate, qui peuvent être utilisés pour dissoudre les films, permettant la réutilisation des électrodes sous-jacentes. Ainsi, les films d&#39;alginate sont relativement fragiles lorsqu&#39;ils sont soumis à des conditions physiologiques, car les ions calcium sont facilement scavenged de la matrice de gel, ce qui affaiblit sa structure et la promotion du film délamination ou redissolution. Pour surmonter cette limitation, nous avons inclus une étape d&#39;incubation pour le film en 1 M CaCl 2 à renforcer le gel. En outre, nous recommandons que la solution d&#39;incubation du film (milieux cellulaires, etc) être complétée par CaCl 2 à une concentration de 500 uM-3 mM. La procédure deuxième grande est la fonctionnalisation du film déposé avec les composants biologiques. Ceci peut être réalisé de deux façons, la première étant de conjugaison électrochimique, une stratégie qui permet de montage rapide et réactif, avec des protéines de contrôle du territoire exceptionnelle de 10. Cependant, fonctionnalisation de cette manière est limitée par la diffusion de Cl - ions à travers le film à l&#39;électrode ainsi que la diffusion de HOCl, l&#39;réactive générée intermédiaire, retourner dans la solution. La capacité des molécules électrochimiquement actifs afin de transmettreà travers le film permet pour la transduction de signaux chimiques et biologiques dans le facile à lire des signaux électriques 15. Nous avons montré la tyrosinase médiée couplage comme une deuxième stratégie pour la fonctionnalisation enzyme au chitosane, démontré par liaison covalente AI-2 synthase. Cette stratégie permet au processus de fonctionnalisation d&#39;être contrôlée et sélective - dépend d&#39;un réactif spécifique, la tyrosinase, qui agit de façon discriminatoire sur les protéines contenant un tag tyrosine 9. Nous montrons l&#39;utilité et la biocompatibilité des systèmes multi-adresses en reproduisant les voies naturelles sur une puce. D&#39;abord, nous avons organisé deux populations cellulaires (ie &quot;expéditeurs&quot; et &quot;récepteurs&quot;) à des adresses distinctes, et a montré que leur interaction entre les électrodes adjacentes pour fournir AI-2 et de générer une réponse de fluorescence. Ce concept a également été démontrée par Cheng et al. dans une puce 14 microfluidique. Nous avons également imité l&#39;interaction, mais plutôt utiliséune enzyme pour synthétiser IA-2 pour la livraison. De cette manière, une voie de synthèse intracellulaire, AI-2 de synthèse, a été reproduit par le biais biofabrication et fonctionnait beaucoup comme il le ferait dans une solution. Dans les deux cas, l&#39;assemblage de plusieurs adresses présente le défi d&#39;éviter la non-spécifiques de liaison entre les adresses parce que chaque solution de dépôt doit être présenté à la matrice d&#39;électrodes ensemble, même si électrodéposition est uniquement destiné à une seule adresse. Le lavage doux et en profondeur peut révoquer la majorité de la solution résiduelle de non-biaisées électrodes; l&#39;utilisation de l&#39;écoulement dans les canaux microfluidiques peut réduire encore davantage la non-spécificité. En particulier pour l&#39;biofabrication adjacente de chitosane et des adresses d&#39;alginate, il est recommandé le dépôt du film de chitosan première suite de cela avec les étapes biofonctionnalisation, et après cela, l&#39;alginate de dépôt électrolytique. Bien que nous n&#39;avons pas fait ici, nous avons découvert que le blocage du film chitosane avec des protéines inertes (comme milk, BSA, etc) diminue fortement non-spécifiques de liaison de molécules indésirables à la surface aminée de chitosane. Nous avons trouvé une utilité dans l&#39;établissement électrodes à motifs, on retrouve souvent dans les dispositifs BioMEMS, comme les «Blueprints» pour un arrangement complexe de cellules et des biomolécules. Les utilisations de chitosane électrodéposé dans les dispositifs bioMEMS peut aller bien au-delà des exemples cités ici 19. Chitosan peut être déposée sur différentes géométries microscopique, tels que dans des microcanaux et sur ​​des surfaces non planes 20,15. Les films peuvent également être modifiées avec d&#39;autres polymères et une variété de protéines, l&#39;ADN, les nanoparticules, et d&#39;oxydo-réduction des molécules actives pour 21,22,23 de nouvelles propriétés. Dans les dispositifs BioMEMS, films de chitosane ont été utilisés pour la livraison de drogue, la détection de molécules redox et petite, la biocatalyse, et les études de cellules 20,23,24,25. De même, l&#39;alginate est largement utilisé comme une matrice de cellules-piège et a été explorée pour le confinement fluidique réversible depopulations de cellules et dans le film-immunoanalyse 26,27,28. Des films composites pour les applications d&#39;ingénierie tissulaire ont été fabriqués en utilisant électrodéposition alginate, avec des composants tels que l&#39;hydroxyapatite pour implants orthopédiques 29. Dans nos manifestations de biofabrication, nous avons montré à la fois les interactions entre les composantes biologiques et à travers l&#39;interface bio-électronique pour être également applicable, ce qui met en arriver à la perspective de l&#39;intégration de toutes les variétés d&#39;interactions pour une performance sophistiquée dans la transmission du signal sur la puce. En conséquence, biofabrication peut faciliter la fabrication de dispositifs à une réduction des &quot;tailles minimales métrages&quot; en tant que suite directe à l&#39;évolution rapide de la microfabrication, comme souvent motivés par l&#39;électronique grand public. C&#39;est, next-génération d&#39;appareils pourrait en fait inclure des composants biologiques labiles qui offrent ensemble exquis de la nature et les capacités de reconnaissance sur une longueur encore plus petit scales plus artificielles systèmes. Nous envisageons à court terme des applications dans l&#39;instrumentation analytique, les capteurs environnementaux, et même biocompatibles implantables.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de la composante </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Alimentation </td><td> Keithley </td><td> SourceMeter 2400 </td></tr><tr><td> Trois potentiostat électrode </td><td> CH Instruments </td><td> Potentiostat / galvanostatique 600D </td></tr><tr><td> RE-5B Électrode de référence Ag / AgCl avec connecteur flexible </td><td> BASi </td><td> MF-2052 </td></tr><tr><td> Plaquette de silicium revêtu d&#39;or, 500um Si, Cr 12nm, 120nm Au, SiO 2 pour l&#39;isolation </td><td> fabriqués sur mesure </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;oxyde d&#39;indium étain lame de verre enduite, rectangulaire, 8-12 ohms résister à </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 578274 </td></tr><tr><td> Feuille de platine / feuille (0,002 in) </td><td> Chemetals Surepure </td><td> 1897 </td></tr><tr><td> Slim Line Clips 2 Alligator &quot; </td><td> RadioShack </td><td> 270-346 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Multi-Stacking Banana Patch Cord Plug- </td><td> TSElectronic </td><td> B-36-02 B-24-02 </td></tr><tr><td> Kit SYLGARD 184 élastomère de silicone </td><td> Dow Corning </td><td> NC9020938 De Fischer </td></tr><tr><td> Stéréomicroscope Fluorescecence </td><td> Olympe </td><td> MVX10 MacroView </td></tr><tr><td> cellSens standard </td><td> Olympe </td><td> version 1.3 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Électrodéposition et l&#39;équipement de visualisation de fluorescence. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Chitosan, de poids moléculaire moyen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448877 </td></tr><tr><td> Acide chlorhydrique, ARISTAR. ACS, NF, FCC année </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td></tr><tr><td> Hydroxyde de sodium, Solution. 10.00N </td><td>VWR </td><td> VW3247 </td></tr><tr><td> L&#39;acide alginique, sel de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 180947 </td></tr><tr><td> Multifex-MM précipité Carbonate de calcium, des particules 70nm </td><td> Spécialité Minerals Inc </td><td> 100-3630-3 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Chitosan et réactifs solution d&#39;alginate. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Le chlorure de calcium, dihydrate </td><td> JT Baker </td><td> 0504 </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium, certifié Cristallin ACS </td><td> Fischer Scientifique </td><td> S271 </td></tr><tr><td> Phosphate de potassium monobasique, anhydre </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> Phosphate de potassium dibasique anhydre </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3786 </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Sigma- Aldrich </td><td> P4417 </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Autres composants de la solution et les réactifs tampons. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société / Source </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> La glucose oxydase d&#39;Aspergillus Niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2133 </td></tr><tr><td> La tyrosinase de champignon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3824 </td></tr><tr><td> Bouillon LB, Miller (granulé) </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP9723-2 </td></tr><tr><td> &quot;AI2-synthase» (HGLPT) </td><td> Lab stock 16 </td><td></td></tr><tr><td> W3110 cellules de type sauvage </td><td> Lab Disponible 30 </td><td></td></tr><tr><td> MDAI2 + pCT6-LSRR - amp r + pET- <em&gt; DsRed - kan cellules r </td><td> Lab Disponible 30 </td><td></td></tr><tr><td> FluoroSphères: diamètre 1 micron, Ex / Em: 505/515 </td><td> Invitrogen </td><td> F8765 </td></tr><tr><td> 5 - (et-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex / Em: 525/560 </td><td> Invitrogen </td><td> C-6157 </td></tr><tr><td> DyLight anticorps kit de marquage, 405 </td><td> Thermo Scientific </td><td> PI-53020 </td></tr></tbody></table> Enzymes Tableau 4., De cellules et de réactifs de fonctionnalisation d&#39;autres.

bridging the bio-electronic interface with biofabrication

Les progrès de la technologie de la promesse de laboratoire-sur-une-puce de révolutionner la recherche et la médecine par une baisse des coûts, une meilleure sensibilité, la portabilité et un débit plus élevé. L&#39;incorporation de composants biologiques biologiques sur les systèmes microélectromécaniques (BioMEMS) a montré un grand potentiel pour atteindre ces objectifs. Microfabriqués puces électroniques permettent échelle micrométrique caractéristiques ainsi que une connexion électrique pour la détection et d&#39;actionnement. Fonctionnelles des composants biologiques donner au système la capacité pour la détection spécifique des analytes, des fonctions enzymatiques, et de cellules entières capacités. Procédés de microfabrication standard et bio-analytiques techniques ont été utilisées avec succès depuis des décennies dans les industries de l&#39;informatique et biologique, respectivement. Leur combinaison et d&#39;interface dans un environnement de laboratoire-sur-une-puce, cependant, fait naître de nouveaux défis. Il est un appel à des techniques qui peuvent construire une interface entre l&#39;électrode et Compon biologiqueent qui est doux et facile à fabriquer et le motif. Biofabrication, décrit ici, est une telle approche qui a montré de grandes promesses pour sa facilité-à-assembler l&#39;incorporation de composants biologiques avec une polyvalence dans les fonctions sur la puce qui sont activées. Biofabrication utilise des matériaux biologiques et les mécanismes biologiques (auto-assemblage, l&#39;assemblage enzymatique) pour bottom-up assemblage hiérarchique. Alors que nos laboratoires ont démontré ces concepts dans de nombreux formats 1,2,3, ici, nous démontrons le processus d&#39;assemblage basée sur électrodéposition suivie par plusieurs applications de signal basés sur des interactions. Le processus d&#39;assemblage se compose de l&#39;électrodéposition de films polymères biocompatibles stimuli-sensibles sur des électrodes et leur fonctionnalisation ultérieure avec des composants biologiques comme l&#39;ADN, les enzymes, ou des cellules vivantes 4,5. Électrodéposition tire parti du gradient de pH créée à la surface d&#39;une électrode polarisée provenant de l&#39;électrolysede l&#39;eau 6,7,. Le chitosane et l&#39;alginate sont stimuli-sensibles polymères biologiques qui peuvent être déclenchés à s&#39;auto-assembler en films d&#39;hydrogel imposées en réponse à des signaux électriques 8. L&#39;épaisseur de ces hydrogels est déterminée par la mesure dans laquelle le gradient de pH s&#39;étend de l&#39;électrode. Ceci peut être modifié en utilisant différentes densités de courant et les temps de dépôt 6,7. Ce protocole décrire comment les films sont déposés chitosane et fonctionnalisé par liaison covalente des composants biologiques à des groupes amine primaires présents abondantes sur le film à travers soit méthodes enzymatiques ou électrochimique 9,10. Films d&#39;alginate et de leur piégeage de cellules vivantes seront également abordés 11. Enfin, l&#39;utilité de biofabrication est démontrée par des exemples de l&#39;interaction fondée sur le signal, y compris les produits chimiques-électrique, la cellule à cellule, et aussi la transmission du signal enzyme-à-cellule. Tant le électrodépositionet la fonctionnalisation peut être réalisée dans des conditions proches des conditions physiologiques, sans la nécessité pour les réactifs et épargner ainsi les composantes biologiques labiles à partir des conditions très dures. En outre, à la fois le chitosane et l&#39;alginate ont été longtemps utilisées à des fins pertinentes biologiquement 12,13. Dans l&#39;ensemble, biofabrication, une technique rapide qui peut être tout simplement exécutée sur un établi, peut être utilisé pour créer des motifs de l&#39;échelle du micron fonctionnelles des composants biologiques sur des électrodes et peut être utilisé pour une variété de lab-on-a-chip applications.

Watch this Scientific Journal Video about Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication at JoVE.com

Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Cet article décrit une approche biofabrication: dépôt de stimuli-sensibles polysaccharides en présence d&#39;électrodes biaisées pour créer des films biocompatibles qui peuvent être fonctionnalisés avec des cellules ou des protéines. Nous démontrons une stratégie de paillasse pour la génération des films ainsi que leurs utilisations de base pour créer des surfaces interactives pour biofonctionnalisés lab-on-a-chip applications.

Combler l&#39;interface bio-électronique avec Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and ...

bridging-the-bio-electronic-interface-with-biofabrication

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.7K vues.  University of Maryland. Cet article décrit une approche biofabrication: dépôt de stimuli-sensibles polysaccharides en présence d'électrodes biaisées pour créer des films biocompatibles qui peuvent être fonctionnalisés avec des cellules ou des protéines. Nous démontrons une stratégie de paillasse pour la génération des films ainsi que leurs utilisations de base pour créer des surfaces interactives pour biofonctionnalisés lab-on-a-chip applications.

Vidéo: Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Essai Fréquence d&#39;adhérence pour In Situ Analyse cinétique de la Croix-jonctionnelle interactions moléculaires à l&#39;interface cellule-cellule

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Recherche

Bio-ingénierie

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Or Nanostar synthèse avec une méthode de graines Silver croissance Mediated

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or erosion. Amelogenin has been proven to be a critical protein for controlling the organized growth of apatite crystals. In this paper, we present a detailed protocol for superficial enamel reconstruction by using a novel amelogenin-chitosan hydrogel. Compared to other conventional treatments, such as topical fluoride and mouthwash, this method not only has the potential to prevent the development of dental caries but also promotes significant and durable enamel restoration. The organized enamel-like microstructure regulated by amelogenin assemblies can significantly improve the mechanical properties of etched enamel, while the dense enamel-restoration interface formed by an in situ regrowth of apatite crystals can improve the effectiveness and durability of restorations. Furthermore, chitosan hydrogel is easy to use and can suppress bacterial infection, which is the major risk factor for the occurrence of dental caries. Therefore, this biocompatible and biodegradable amelogenin-chitosan hydrogel shows promise as a biomaterial for the prevention, restoration, and treatment of defective enamel.

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

In this article, we describe a protocol for fabricating an amelogenin-chitosan hydrogel for superficial enamel reconstruction. Organized in situ growth of apatite crystals in the hydrogel formed a dense enamel-restoration interface, which will improve the effectiveness and durability of restorations.

Le développement de l&#39;Amelogenin-chitosane Hydrogel pour<em&gt; In Vitro</em&gt; Émail repousse avec une interface dense

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

Méthodes pour l&#39;auto-intégration de Megamolecular biopolymères sur le séchage à l&#39;air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Utilisation de la biologie synthétique à l&#39;ingénieur cellules vivantes Interface avec les matériaux programmables

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Fabrication of the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in the Adult Rat

Recent advances in neuroprosthetics have enabled those living with extremity loss to reproduce many functions native to the absent extremity, and this is often accomplished through integration with the peripheral nervous system. Unfortunately, methods currently employed are often associated with significant tissue damage which prevents prolonged use. Additionally, these devices often lack any meaningful degree of sensory feedback as their complex construction dampens any vibrations or other sensations a user may have previously depended on when using more simple prosthetics. The composite regenerative peripheral nerve interface (C-RPNI) was developed as a stable, biologic construct with the ability to amplify efferent motor nerve signals while providing simultaneous afferent sensory feedback. The C-RPNI consists of a segment of free dermal and muscle graft secured around a target mixed sensorimotor nerve, with preferential motor nerve reinnervation of the muscle graft and sensory nerve reinnervation of the dermal graft. In rats, this construct has demonstrated the generation of compound muscle action potentials (CMAPs), amplifying the target nerve&#39;s signal from the micro- to milli-volt level, with signal to noise ratios averaging approximately 30-50. Stimulation of the dermal component of the construct generates compound sensory nerve action potentials (CSNAPs) at the proximal nerve. As such, this construct has promising future utility towards the realization of the ideal, intuitive prosthetic.

Fabrication of the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface C-RPNI in the Adult Rat

The following manuscript describes a novel method for developing a biologic, closed loop neural feedback system termed the composite regenerative peripheral nerve interface (C-RPNI). This construct has the ability to integrate with peripheral nerves to amplify efferent motor signals while simultaneously providing afferent sensory feedback.

Fabrication de l’interface nerveuse périphérique régénératrice composite (C-RPNI) chez le rat adulte

Recent advances in neuroprosthetics have enabled those living with extremity loss to reproduce many functions native to the absent extremity, and this is ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Imagerie du flux sanguin avec Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits versus other methods: DIBs are stable and often long-lasting, bilayer area can be reversibly tuned, leaflet asymmetry is readily controlled via droplet compositions, and tissue-like networks of bilayers can be obtained by adjoining many droplets. Forming DIBs requires spontaneous assembly of lipids into high density lipid monolayers at the surfaces of the droplets. While this occurs readily at room temperature for common synthetic lipids, a sufficient monolayer or stable bilayer fails to form at similar conditions for lipids with melting points above room temperature, including some cellular lipid extracts. This behavior has likely limited the compositions&#8212;and perhaps the biological relevance&#8212;of DIBs in model membrane studies. To address this problem, an experimental protocol is presented to carefully heat the oil reservoir hosting DIB droplets and characterize the effects of temperature on the lipid membrane. Specifically, this protocol shows how to use a thermally conductive aluminum fixture and resistive heating elements controlled by a feedback loop to prescribe elevated temperatures, which improves monolayer assembly and bilayer formation for a wider set of lipid types. Structural characteristics of the membrane, as well as the thermotropic phase transitions of the lipids comprising the bilayer, are quantified by measuring the changes in electrical capacitance of the DIB. Together, this procedure can aid in evaluating biophysical phenomena in model membranes over various temperatures, including determining an effective melting temperature (TM) for multi-component lipid mixtures. This capability will thus allow for closer replication of natural phase transitions in model membranes and encourage the formation and use of model membranes from a wider swath of membrane constituents, including those that better capture the heterogeneity of their cellular counterparts.

This protocol details the use of a feedback temperature-controlled heating system to promote lipid monolayer assembly and droplet interface bilayer formation for lipids with elevated melting temperatures, and capacitance measurements to characterize temperature-driven changes in the membrane.

Ensemble à température contrôlée et caractérisation d’une bicouche d’interface de gouttelettes

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

La fabrication et l’exploitation d’un système de micro-électroporation à flux continu avec détection de perméabilisation

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...