Noi riconosciamo i finanziamenti DTRA per il supporto di questo manoscritto e da ONR, DTRA e NSF per il supporto parziale della ricerca di base.

1. Alginato elettrodeposizione <ol><li> Collegare un alimentatore agli elettrodi abitudine fabbricata tramite patch cord con morsetti a coccodrillo. Un ossido di indio e stagno (ITO), di cui vetrino fungerà da anodo (elettrodo di lavoro) e foglio di platino fungerà da catodo (contro-elettrodo). Posizionare gli elettrodi in modo che la superficie ITO da funzionalizzare oppone il controelettrodo ed è posizionato verticalmente per essere immerso in una soluzione o orizzontalmente in modo tale che la soluzione è contenuta deposizione sulla superficie. </li><li> Preparare una soluzione di alginato di deposizione mescolando 1% e 0,5% alginato CaCO 3 (in peso) in acqua distillata e poi la soluzione in autoclave. Si raccomanda di agitare continuamente la soluzione quando non in uso. </li><li> Immergere entrambi gli elettrodi nella soluzione di deposizione. L&#39;alginato usato può essere marcato in modo fluorescente con fluorosfere (Invitrogen), come da Cheng et al. 14, per consentire FLUORESCENTEce l&#39;imaging del film risultante. </li><li> Applicare una densità di corrente costante (3 A / m 2) per 2 minuti; tensione sposterà nell&#39;intervallo di 2-3 V. </li><li> Scollegare l&#39;elettrodo e rimuovere la soluzione non depositato. Lavare delicatamente il film con NaCl (0,145 M) per rimuovere alginato superfluo. </li><li> Incubare brevemente il film (~ 1 min) in CaCl 2 (0,1 M) per rafforzare il gel. Risciacquare con NaCl (0,145 M) e incubare in una soluzione desiderata supplementato con CaCl 2 (1 mM). </li><li> Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza (figura 1B). </li></ol> 2. Codeposition di popolazioni di cellule comunicanti in alginato <ol><li> Un segnale-mittente coltura cellulare (W3110 peso di E. coli), cresciute in un mezzo LB, e un segnale-ricevitore coltura cellulare (MDAI2 + pCT6-lsrR - amp r + pET-DsRed - kan r), cresciute in un mezzo LB + 50 pg / ml ciascuno di kanamicina e ampicillina, devono essere cresciuto uno nottend re-inoculato per la crescita ad una densità ottica (a 600 nm) di 1. Regolare la densità ottica della coltura cellulare ricevitore a 0,4-0,6 con LB prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare una soluzione di deposizione del 2% e 1% alginato CaCO 3, e mescolate con ogni coltura cellulare in un rapporto 1:1 a una concentrazione finale di 1% alginato, 0,5% CaCO 3, con le cellule diluite ad una densità di circa la metà la coltura densità. </li><li> Utilizzare un vetrino modellato con due elettrodi di ITO contenuti in un polidimetilsilossano (PDMS) e (preparata secondo le istruzioni Sylgard e tagliato a misura desiderata) e un contro elettrodo di platino. Collegare un elettrodo di ITO ad un alimentatore con il platino come descritto nella Procedura 1 (elettrodeposizione alginato). </li><li> Immergere gli elettrodi in una soluzione contenente le cellule deposizione ricevitore. Impostare l&#39;alimentazione di una corrente costante ad una densità di 3 A / m 2, dove è definita la dimensione di superficie dal singolo elettrodo sulla quale deposition si verificherà. </li><li> Applicare la corrente per 2 minuti per consentire codeposition delle celle della matrice di alginato. </li><li> Risciacquare il film come descritto nella Fase 1,5. </li><li> Passare il collegamento anodico al secondo, adiacente, elettrodo ITO. </li><li> Ripetere la procedura di deposizione (Fasi 2,4 - 2,7), ma questa volta introduce la soluzione contenente le cellule mittente. </li><li> Incubare la 2-elettrodo chip contenente cellule codeposited e calcio-alginato notte a 37 ° C in salina tamponata con fosfato (PBS) supplementato con mezzi LB 10% e 1 mM CaCl 2. </li><li> Dopo incubazione, l&#39;immagine usando un microscopio a fluorescenza (Figura 2B). </li></ol> 3. Chitosano elettrodeposizione <ol><li> Collegare l&#39;alimentatore agli elettrodi attraverso coccodrilli. Un chip di silicio rivestito in oro fungerà da catodo (elettrodo di lavoro) e un foglio di platino fungerà da anodo (contro-elettrodo). Posizionare superficie dell&#39;elettrodo d&#39;oro in modo tha si oppone il controelettrodo ed entrambi sono posizionati verticalmente per essere immerso in una soluzione o orizzontalmente in modo tale che la soluzione è contenuta deposizione sulla superficie. </li><li> Preparare una soluzione di chitosano mescolando fiocchi chitosano in acqua e aggiungendo lentamente 2 M HCl per sciogliere i polisaccaridi (finale pH 5.6), avendo cura di seguire la procedura descritta da Meyer et al. 15. </li><li> Posizionare gli elettrodi in una soluzione di chitosano (0,8%), sommergendo completamente la zona desiderata per la deposizione. Il chitosano usato può essere marcato in modo fluorescente con 5 - (e-6)-carboxyrhodamine 6G succinimmidil estere (Invitrogen), come da Wu et al 8, il film di immagine elettrodepositata mediante microscopia a fluorescenza.. </li><li> Applicare una densità di corrente costante (4 A / m 2) per 2 minuti. Tensione sposterà nell&#39;intervallo di 2-3 V. Calcolare la densità di corrente in funzione della superficie d&#39;oro dell&#39;elettrodo di lavoro esposto al Deposition soluzione. </li><li> Risciacquare l&#39;elettrodo con acqua deionizzata per rimuovere superfluo chitosano. Il chip può essere conservato in acqua o PBS (10 mM, pH 7,0). </li><li> Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza (Figura 3C). </li></ol> 4. Trasduzione elettrochimica con un film funzionalizzato Chitosan <ol><li> Codeposit chitosano e glucosio ossidasi (GOX) da una soluzione (1% di chitosano, 680 U / mL GOX, pH 5,6) ad una densità di corrente di 4 A / m 2 su un elettrodo modellato secondo la procedura 3 (elettrodeposizione Chitosan). Un film chitosano intrappolata in GOX verrà generato. </li><li> Attaccare l&#39;elettrodo trattati per un sistema a tre elettrodi come elettrodo di lavoro, un filo di platino come contro-elettrodo e Ag / AgCl come elettrodo di riferimento, come descritto in Figura 4A. </li><li> Immergere gli elettrodi in una soluzione tampone fosfato (0,1 M, pH 7,0) contenente NaCl (0,1 M). </li><li> Elettrochimicamente la proteina coniugato al chitosanopellicola applicando una tensione costante (0,9 V) per 60 s utilizzando chronoamperometry 10. </li><li> Posizionare il chip in tampone fosfato (0,1 M, pH 7.0) e lavare per 10 minuti su un agitatore orbitale per rimuovere qualsiasi GOX NaCl non ha reagito e non coniugata. </li><li> Ricollegare il sistema a tre elettrodi come descritto al punto 4.2 e immerso in una soluzione di glucosio al 5 mM. Utilizzando voltammetria ciclica, spazzare il potenziale in una direzione positiva a 0,7 V. utilizzare un film di controllo non contenente glucosio ossidasi come confronto per la quantità di ossidazione visto nella scansione (Figura 4B). </li><li> Rimuovere gli elettrodi dalla soluzione di glucosio e lavare con tampone fosfato (0,1 M, pH 7,0) quindi posizionare gli elettrodi in un becher da 10 mL contenente 8 ml di tampone fosfato (0,1 M, pH 7,0). Bias il GOX-funzionalizzato chip a 0,6 V per servire come elettrodo di lavoro (Figura 4C). </li><li> Aggiungere aliquote di glucosio nel buffer (ciascuna aliquota aumenta la concentrazione di glucosio da parte4 mM). </li><li> Generare una curva standard tra l&#39;attuale stato stazionario e la concentrazione di glucosio per il GOX pellicola chitosano funzionalizzato. </li></ol> 5. Protein Funzionalizzazione Utilizzo Assemblea enzimatico <ol><li> Utilizzare un vetrino modellato con un elettrodo d&#39;oro adiacente e ITO contenuta in un pozzo PDMS. Bias l&#39;elettrodo d&#39;oro con un potenziale catodico per electrodeposit chitosano come illustrato in precedenza. Sciacquare pellicola brevemente in acqua deionizzata e poi PBS con pipetta. </li><li> Aggiungere una soluzione di 3 pM fluorescente blu &quot;AI-2 Synthase&quot; 16 (usando un kit DyLight etichettatura) + 100 U / mL tirosinasi in PBS. </li><li> Incubare per 1 ora a temperatura ambiente, quindi risciacquare il film con PBS. </li><li> Applicare un potenziale anodico per l&#39;elettrodo di ITO codeposit una soluzione di deposizione di alginato contenente cellule ricevitore (come preparati nei passaggi 2.1-2.2). Seguire i passaggi della procedura 2,3-2,6 2 (Codeposition di popolazioni di cellule in alginato). </li><li> Per generareil segnale trasmesso (AI-2) enzimaticamente, dopo il risciacquo dei film aggiungere una soluzione di 500 pM S-adenosil omocisteina (SAH) in PBS, LB supplementato con mezzi 10% e 1 mM CaCl 2. Coprire gli elettrodi per evitare l&#39;evaporazione della soluzione ed incubare durante la notte a 37 ° C. Ciò consentirà una risposta cellulare ricevitore generando una proteina fluorescente rossa (DsRed). </li><li> Elettrodi adiacenti possono essere visualizzate con un microscopio a fluorescenza regolando i filtri per catturare la fluorescenza blu del AI-2 Synthase e fluorescenza rossa espressa dalle cellule codeposited ricevitore (Figura 5B). </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Imposti segnali elettrici possono creare microambienti localizzate (ad esempio, campi e gradienti) vicino a una superficie dell&#39;elettrodo e tali stimoli possono innescare l&#39;auto-assemblaggio di polisaccaridi come alginato e chitosano per depositare una pellicola idrogel sulla superficie dell&#39;elettrodo. Dato che tla transizione sol-gel si verifica sulla superficie dell&#39;elettrodo, la pellicola risultante è electroaddressed, con la sua geometria corrispondente al modello di elettrodo (figure 1B, 3C). Film biocompatibile come alginato e chitosano fornire superfici che possono essere funzionalizzati con componenti biologici. Utilizzando alginato, le popolazioni di cellule uniche sono state codeposited a separare gli indirizzi. Prove di loro electroaddressment è osservato dopo interazione tra il mittente e il ricevitore popolazione di cellule. La molecola autoinducer-2 (AI-2) diffonde dalle cellule del mittente e viene assorbito dalle cellule del ricevitore, con conseguente espressione della proteina fluorescente rossa DsRed (Figura 2A). In Figura 2B, fluorescenza rossa è stata osservata solo in corrispondenza dell&#39;elettrodo sono indirizzate ricevitori. I gruppi amminici presenti sul chitosano fornendo la capacità di risposta pH richiesto per elettrodeposizione così come una superficie adatta per la funzionalizzazione. Noiutilizzato queste caratteristiche uniche dal elettrochimicamente coniugando la biosensori enzima glucosio ossidasi (GOX) per elettrodepositata chitosano film. Questo enzima fornisce quindi la possibilità per il rilevamento di glucosio mediante una reazione enzimatica (Figura 4A) producendo perossido di idrogeno che può quindi essere ossidato elettrochimicamente per produrre una corrente di uscita. In questo modo, un segnale chimico può essere trasdotta in Figura elettrica. 4B mostra che i film in cui GOX è elettrochimicamente coniugato produrre un segnale forte anodico in presenza di glucosio rispetto a quelle pellicole non contenenti GOX. Questi risultati indicano GOX può essere montato su una pellicola depositata chitosano e mantiene l&#39;attività catalitica. Inoltre, la figura 4C mostra un passo-aumento di corrente anodica prodotta in risposta a concentrazioni crescenti di glucosio. La curva standard presenti anche nella figura 4C mostra che il passo di aumenti proceduto in una fas quasi linearehion dipende dalla quantità di glucosio aggiunto. Questi risultati mostrano che l&#39;enzima conserva anche la sua sensibilità alle concentrazioni crescenti di glucosio sulla coniugazione al film chitosano. Il limite inferiore di rilevamento non è stato studiato qui come è stato precedentemente caratterizzati per questo sistema nel lavoro di Meyer et. al. Abbiamo anche dimostrato l&#39;immobilizzazione covalente di un enzima di interesse, progettato per contenere un costume penta-tirosina tag, di chitosano enzimaticamente in un modo controllato. In particolare, questo processo è mediato da tirosinasi. Come si vede dallo schema in figura 5A (superiore), un enzima, AI-2 Synthase include un penta-tirosina tag. Tirosinasi agisce sul tag tirosina, ossidando i gruppi fenolici dei residui »di O-chinoni, che poi si legano in modo covalente alle ammine del chitosano. Prove di funzionalizzazione del film chitosano con l&#39;AI-2 Synthase dalla tirosinasi gruppo si osserva nella figura 5B </strong&gt;, dove l&#39;AI-2 Synthase è stato marcato in modo fluorescente blu. Poiché AI-2 Synthase genera AI-2 dal substrato omocisteina S-adenosil (SAH) nello stesso modo delle celle mittente, la vicinanza di cellule ricevitore codeposited in presenza di SAH causa anche le cellule ricevitore a rispondere fluorescente esprimendo DsRed (figura 5A (inferiore)). Fluorescenza rossa delle cellule ricevitore (Figura 5B) dimostra nuovamente l&#39;interazione tra gli indirizzi a causa della diffusione di AI-2 da uno all&#39;altro, e indica inoltre che gli enzimi immobilizzati per mantenere chitosano attività una volta legata in modo covalente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig1.jpg" /> Figura 1. Elettrodeposizione alginato. (A) Meccanismo di elettrodeposizione alginato: Come un elettrodo è anodicamente polarizzato, l&#39;elettrolisi dell&#39;acqua avviene alla sua superficie, generando un pH basso localizzato. Particelle di carbonato di calcio reagisce con l&#39;avanzodi protoni, rilasciando cationi di calcio come particelle sciogliere. In presenza di catene polimeriche alginato, gli ioni diventano chelati in una rete &quot;Eggbox&quot;, formando un idrogel reticolato all&#39;elettrodo. Poiché la distanza aumenta elettrodi, alginato ha una maggiore tendenza a rimanere in soluzione a causa della ridotta presenza di ioni calcio. (B) Una forma di L modellato elettrodo ITO è stata utilizzata per alginato electrodeposit. Un PDMS pozzo è stato fissato l&#39;elettrodo per contenere un alginato verde fluorescente-marcato (1%) e CaCO 3 (0,5%) soluzione di deposizione. Dopo elettrodeposizione per 2 min. ad una densità di corrente di 3A / m 2, l&#39;idrogel è stato ripreso electroaddressed alginato mediante microscopia a fluorescenza. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig2.jpg" /> Figura 2. Codeposition di popolazioni cellulari. (A) schema che mostra l&#39;interazione tra due E. ceppi di E.: Una popolazione produce autoinducer-2 (AI-2), Una molecola di segnalazione, e viene chiamato &quot;AI-2 mittente.&quot; L&#39;altra popolazione, denominato &quot;AI-2 ricevitore,&quot; è un reporter di AI-2, al ricevimento della AI-2 per diffusione da parte del mittente, che esprime la proteina fluorescente rossa DsRed. (B) l&#39;immagine di fluorescenza rossa coppia di elettrodi con la popolazione AI-2 mittente codeposited con alginato sull&#39;elettrodo sinistra e AI-2 popolazione ricevitore codeposited con alginato sull&#39;elettrodo di destra. Visualizzazione ingrandita dimostra l&#39;espressione DsRed dei soli AI-2 ricevitori. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig3.jpg" /> Figura 3. Elettrodeposizione Chitosan. (A) schema che mostra il pH-dipendente elettrodeposizione di chitosano. Elettrolisi dell&#39;acqua in un elettrodo polarizzato catodicamente provoca un pH elevato localizzato (indicato da un cambiamento di colore localizzata di un colorante indicatore di pH vicino al catodo in micrografia) che stimola la transizione sol-gel di chitosano in questa regione. (B) Le ammine presenti sul chitosano dòt pH-sensibili proprietà. Sopra un pH di 6,3 (pKa di chitosano) le ammine sono deprotonato, facilitare la transizione dalla sua forma protonata solubile alla sua forma di gel insolubile. (C) Un elettrodo d&#39;oro modellato è stato utilizzato per electrodeposit chitosano. L&#39;elettrodo, catodicamente collegato alla rete di alimentazione, è stato immerso in una verde fluorescente-marcato chitosano (0,8%) soluzione di deposizione. Dopo elettrodeposizione per 2 min. ad una densità di corrente di 4 A / m 2, il film electroaddressed chitosano è stato ripreso mediante microscopia a fluorescenza. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig4.jpg" /> Figura 4. Trasduzione elettrochimica con un film chitosano funzionalizzato. (A) schematico che mostra la configurazione di un sistema a tre elettrodi. Chitosano funzionalizzato pellicola funge da elettrodo di lavoro, un filo di platino come contro-elettrodo e Ag / AgCl come elettrodo di riferimento. Trasduzione elettrochimica dei proventi di glucosio attraverso °elettroniche reazioni enzimatiche e elettrochimica mostrati in cui perossido di idrogeno prodotto possono essere ossidati e rilevati in corrispondenza dell&#39;elettrodo di lavoro. (B) ciclico voltammagram (CV) ad elettrodo con una pellicola di chitosano contenente glucosio ossidasi elettrochimicamente coniugato (GOX) mostra un segnale forte anodica in una soluzione di glucosio 5 mM. Un film non contenente GOX servito come controllo e non mostrava alcun segnale nella stessa soluzione. (C) Una curva standard tra corrente anodica e la concentrazione di glucosio che presenta un rapporto quasi lineare (ciascuna aliquota aumentato la concentrazione di glucosio da 4 mM e aumentato anche l&#39;ampiezza della corrente nel grafico inserto in un modo graduale). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig5.jpg" /> Figura 5. Funzionalizzazione proteina usando montaggio enzimatica. (A, superiore) schema che mostra tirosina-tag &quot;AI-2 Synthase&quot; essere covalentemente legato a un film di chitosano dall&#39;assemblea tirosinasi. I residui di tirosina diventano ossidoized a O-chinoni dall&#39;azione tirosinasi e possono reagire con i gruppi amminici sulla pellicola chitosano, formando un legame covalente. (A, inferiore) L&#39;IA-2 Synthase genera AI-2 da un substrato (SAH), le cellule del ricevitore segnalare il generata AI-2 da DsRed espressione di fluorescenza. (B) immagini a fluorescenza che mostrano un film di chitosano su oro, funzionalizzati con blu-marcato AI-2 sintasi. Adiacenti, IA-2 cellule ricevitore sono codeposited con alginato su Ito. Dopo aggiunta del substrato enzimatico al pozzo e l&#39;incubazione, le cellule AI-2 ricevitore esprimono DsRed.

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	<li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+generation+of+pH+gradients+in+microfluidic+devices+for+biofabrication+of+freestanding,+semi-permeable+chitosan+membranes.">In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes.</a> Lab Chip. 10, 59-65 (2010).</li><li>Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Activated+Ionic+Gelation+of+Common+Biopolymers.">Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers.</a> Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).</li><li>Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+capture+on+patterned+surfaces+coated+with+amphiphilic+biopolymers.">Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers.</a> Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+to+build+the+biology-device+interface.">Biofabrication to build the biology-device interface.</a> Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).</li><li>Yang, X., Shi, X. -. W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+Enzymatic+Reactions+for+the+Assembly+of+Proteins+at+Electrode+Addresses.">Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses.</a> Langmuir. 25, 338-344 (2008).</li><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+quantitative+visualization+and+characterization+of+chitosan+electrodeposition+with+paired+sidewall+electrodes.">In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes.</a> Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).</li><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+anodic+electrodeposition+of+calcium+alginate.">Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate.</a> Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).</li><li>Wu, L. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Selective+Deposition+of+a+Reactive+Polysaccharide+Layer+onto+a+Patterned+Template.">Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template.</a> Langmuir. 19, 519-524 (2003).</li><li>Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+antibodies+and+antigens+via+IgG-binding+domain+engineered+with+activatable+pentatyrosine+pro-tag.+Biotechnol.">Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol.</a> bioeng. , 103-231 (2009).</li><li>Shi, X. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagentless+Protein+Assembly+Triggered+by+Localized+Electrical+Signals.">Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals.</a> Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).</li><li>Shi, X. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroaddressing+of+Cell+Populations+by+Co-Deposition+with+Calcium+Alginate+Hydrogels.">Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels.</a> Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).</li><li>de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+based+microcapsules+for+immunoisolation+of+islet+cells.">Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells.</a> Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).</li><li>Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chitin+and+chitosan+nanofibers+and+their+biomedical+applications.">Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications.</a> Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).</li><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroaddressing+Functionalized+Polysaccharides+as+Model+Biofilms+for+Interrogating+Cell+Signaling.">Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling.</a> Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).</li><li>Meyer, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan-coated+wires:+conferring+electrical+properties+to+chitosan+fibers.">Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers.</a> Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).</li><li>Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -. C., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+biological+nanofactories+trigger+quorum+sensing+response+in+targeted+bacteria.">Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria.</a> Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).</li><li>Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+with+chitosan.">Biofabrication with chitosan.</a> Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).</li><li>Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACS+Symposium+Series+Ch.+4.">ACS Symposium Series Ch. 4.</a> Renewable and Sustainable Polymers. 1063, 61-71 (2011).</li><li>Koev, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan:+an+integrative+biomaterial+for+lab-on-a-chip+devices.">Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices.</a> Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).</li><li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+assembly+of+a+metabolic+pathway+enzyme+in+a+pre-packaged+reusable+bioMEMS+device.">Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device.</a> Lab Chip. 8, 420-430 (2008).</li><li>Spinks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+"dual+mode"+actuation+in+chitosan/polyaniline/carbon+nanotube+fibers.">A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers.</a> Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).</li><li>Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+assembly+of+genetically+modified+viral+nanotemplates+via+nucleic+acid+hybridization.">Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization.</a> Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).</li><li>Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-cycling+and+H2O2+generation+by+fabricated+catecholic+films+in+the+absence+of+enzymes.">Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes.</a> Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).</li><li>Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+transdermal+delivery+of+model+drug+compounds+by+MEMS+microneedle+array.">Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array.</a> Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).</li><li>Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microbial+biosensor+based+on+bacterial+cells+immobilized+on+chitosan+matrix.">A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix.</a> Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).</li><li>Selimoglu, S. M., Elibol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+as+an+immobilization+material+for+MAb+production+via+encapsulated+hybridoma+cells.">Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells.</a> Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).</li><li>Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentle+cell+trapping+and+release+on+a+microfluidic+chip+by+in+situ+alginate+hydrogel+formation.">Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation.</a> Lab Chip. 5, 553-559 (2005).</li><li>Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Film+Bioprocessing+and+Immunoanalysis+with+Electroaddressable+Stimuli-Responsive+Polysaccharides.">In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides.</a> Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).</li><li>Cheong, M., Zhitomirsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrodeposition+of+alginic+acid+and+composite+films.">Electrodeposition of alginic acid and composite films.</a> Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).</li><li>Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+induction+of+recombinant+proteins+by+minimally+rewiring+native+quorum+sensing+regulon+of+E.+coli.">Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli.</a> Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).</li></ol>

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Le nostre procedure di dimostrare l&#39;elettrodeposizione e funzionalizzazione di film biopolimero, un processo che chiamiamo biofabrication. Attraverso funzionalizzazione con cellule e biomolecole creiamo superfici biologiche in grado di interagire con l&#39;altro e l&#39;indirizzo elettrodo sono assemblati su. Il primo passo, elettrodeposizione, avviene attraverso la attivato auto-assemblaggio di biopolimeri, chitosano e alginato nei nostri studi, in risposta ad un segnale elettrico. Come detto in precedenza un gradiente di pH viene generato che può essere controllato dalla densità di corrente e tempo di deposizione, fornendo ulteriore controllo sulla pellicola le dimensioni e le proprietà 6,17. Abbiamo trovato che una varietà di densità di corrente e combinazioni tempo di deposizione può essere utilizzata per gli elettrodi indicati nella Tabella 1. Anche se l&#39;uso di altri elettrodi è fattibile, adattamenti la procedura sarebbe necessario. Rispetto ad altre tecniche di formazione di pellicola del processo di electrodeposizione è semplice, rapido e reattivi. Non c&#39;è bisogno di un vasto repertorio di attrezzature costose e laboriose preparazioni. È importante sottolineare che il processo può sopportare piccole deviazioni sperimentali e può essere facilmente avviato in caso di problemi. Il chitosano è in grado di rispondere a un elevato gradiente di pH catodica a causa importanti proprietà funzionali conferite ad essa da un elevato contenuto di ammine primarie. A pH elevato (superiore al suo pKa di ~ 6,3) le ammine sono deprotonato e chitosano diventa insolubile, permettendo per formazione di pellicola. Dopo la deposizione, i film rimarrà attaccato alla elettrodo. Tuttavia, esiste la possibilità di delaminazione, se desiderato. I film sono stabili fino a quando il pH della soluzione non scenda sotto il pKa. Le soluzioni acide protonate le ammine e le successive repulsioni elettrostatiche gonfiare il gel fino a completa dissoluzione 18. Cioè, il montaggio / smontaggio processo è reversibile su richiesta e allows per la rimozione dei film depositati e il riutilizzo degli elettrodi. Opportunamente, l&#39;intervallo di pH in cui il sol-gel si perviene è vicino a quello in cui i componenti più biologici funzionare in modo ottimale. Ciò rende il processo ideale per la conservazione di funzionalità durante il montaggio 6. Formazione di pellicola alginato è facilitato dalla elettrolisi di acqua anodica nonché la presenza di carbonato di calcio 7. Il pH basso localizzato in corrispondenza dell&#39;anodo solubilizza il carbonato di calcio porta al rilascio i cationi di calcio. Questi ioni vengono chelato con alginato, formando una struttura reticolata sulla superficie dell&#39;elettrodo. Film di alginato sono reversibili particolare da competizione per ioni calcio da altri composti chelanti come EDTA, citrato o che possono essere utilizzate per sciogliere i film, consentendo per il riutilizzo degli elettrodi sottostanti. Così, i film di alginato sono relativamente fragili quando sottoposto a condizioni fisiologiche perché gli ioni calcio sono facilmente scavenged dalla matrice gel, indebolendo la sua struttura e la promozione di film di delaminazione o ridissoluzione. Per superare questa limitazione, abbiamo incluso un passaggio di incubazione per il film in 1 M CaCl 2 per rafforzare il gel. Inoltre, si consiglia di soluzione di incubazione del film (mezzi cellulari, ecc) è integrato con CaCl 2 alla concentrazione di 500 pM-3 mM. Il secondo procedimento principale è la funzionalizzazione del film depositato con relativi componenti biologici. Ciò può essere ottenuto in due modi, la prima coniugazione di essere elettrochimico, una strategia che consente una rapida, montaggio reattivi delle proteine ​​con eccezionale controllo spaziale 10. Tuttavia, funzionalizzazione in questo modo è limitata dalla diffusione di ioni Cl - attraverso il film per l&#39;elettrodo, nonché la diffusione della HOCl, l&#39;intermedio reattivo generato, indietro in soluzione. La capacità di molecole elettrochimicamente attivi passareattraverso il film consente di trasduzione di segnali chimici e biologici in facile da leggere segnali elettrici 15. Abbiamo dimostrato tirosinasi-mediata accoppiamento come una seconda strategia per funzionalizzazione enzima di chitosano, dimostra covalentemente collegando AI-2 Synthase. Questa strategia consente il processo di funzionalizzazione di essere controllato e selettivo - dipendente da un reagente specifico, tirosinasi, che agisce su discriminately proteine ​​contenenti un tag tirosina 9. Mostriamo l&#39;utilità e la biocompatibilità dei sistemi multi-indirizzo replicando vie naturali su un chip. In primo luogo abbiamo organizzato due popolazioni cellulari (ad esempio &quot;mittenti&quot; e &quot;riceventi&quot;) agli indirizzi distinti, e ha dimostrato che hanno interagito tra gli elettrodi adiacenti per fornire AI-2 e generare una risposta di fluorescenza. Questo concetto è stato anche dimostrato da Cheng et al. in un chip microfluidico 14. Abbiamo anche imitato l&#39;interazione, ma invece utilizzatoun enzima per sintetizzare AI-2 per la consegna. In questo modo, un percorso di sintesi intracellulare, AI-2 sintesi, è stata replicata attraverso biofabrication e funzionato quanto sarebbe in soluzione. In entrambi i casi, l&#39;assemblaggio di più indirizzi presenta il problema di evitare il legame non specifico tra indirizzi poiché ogni soluzione di deposizione devono essere introdotti agli elettrodi intero, anche se elettrodeposizione è destinato esclusivamente presso un indirizzo. Lavaggio delicato ma approfondito in grado di rimuovere la maggior parte della soluzione residua non-biased elettrodi, l&#39;uso del flusso nei canali microfluidici può ridurre ulteriormente non-specificità. In particolare per la biofabrication adiacente di chitosano e alginato indirizzi, si consiglia depositando il primo film di chitosano, seguendo questa procedura con biofunctionalization, e dopo questo, elettrodeposizione alginato. Anche se non abbiamo fatto qui, abbiamo scoperto che bloccando il film chitosano con proteine ​​inerti (come ad esempio milk, BSA, ecc) diminuisce notevolmente il legame non specifico di molecole indesiderate di superficie amminato chitosano. Abbiamo trovato utilità nella creazione di elettrodi a motivi geometrici, spesso si trovano in dispositivi bioMEMS, come il &quot;blueprint&quot; per un complesso sistema di cellule e biomolecole. Gli usi di elettrodepositata chitosano nei dispositivi BioMEMS può andare ben oltre gli esempi menzionati qui 19. Chitosano può essere depositato su varie geometrie microscala - come in microcanali e su superfici non piane 20,15. I film possono essere anche modificati con altri polimeri e una varietà di proteine, DNA, nanoparticelle, e redox-attivi molecole per nuove proprietà 21,22,23. Nei dispositivi bioMEMS, film chitosano sono stati utilizzati per la somministrazione di farmaci, di rilevamento e piccola molecola redox, biocatalisi, e studi sulle cellule 20,23,24,25. Analogamente, alginato è ampiamente usato come cellula-matrice e intrappolamento è stata esplorata per reversibile contenimento fluidicopopolazioni cellulari e in film immunoanalysis 26,27,28. Film compositi per applicazioni di ingegneria tissutale sono state fabbricate utilizzando elettrodeposizione alginato, con componenti quali con idrossiapatite per impianti ortopedici 29. Nelle nostre manifestazioni di biofabrication, abbiamo dimostrato entrambe le interazioni tra componenti biologiche e attraverso il bio-elettronico interfaccia ugualmente applicabile; questo porta nella raggiungere la prospettiva di integrare tutte le varietà di interazioni per prestazioni sofisticate in on-chip trasmissione del segnale. Di conseguenza, biofabrication può facilitare la realizzazione di dispositivi con ridotte dimensioni caratteristiche &quot;minime&quot; come un seguito diretto a rapidi sviluppi di microfabbricazione, come spesso motivati ​​da elettronica di consumo. Vale a dire, nei prossimi dispositivi di nuova generazione potrebbe infatti comprendere labili componenti biologiche che offrono il montaggio squisito della natura e le capacità di riconoscimento a lungo sca ancora più piccololes di sistemi creati dall&#39;uomo. Prevediamo a breve termine le applicazioni nella strumentazione analitica, sensori ambientali, dispositivi impiantabili e persino biocompatibili.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del componente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Alimentazione </td><td> Keithley </td><td> SourceMeter 2400 </td></tr><tr><td> Tre elettrodi potenziostato </td><td> CH Instruments </td><td> Potenziostato / galvanostato 600D </td></tr><tr><td> RE-5B Ag / AgCl Elettrodo di riferimento con connettore flessibile </td><td> BASI </td><td> MF-2052 </td></tr><tr><td> Wafer di silicio rivestito in oro, 500um Si, 12nm Cr, Au 120nM, SiO 2 per l&#39;isolamento </td><td> abitudine fabbricata </td><td></td></tr><tr><td> Indium Tin Oxide rivestito vetrino, rettangolare, 8-12 ohm resistere </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 578274 </td></tr><tr><td> Platinum foglio / foglio (0,002 in) </td><td> Surepure Chemetals </td><td> 1897 </td></tr><tr><td> Slim Line &quot;Alligator 2 clip </td><td> RadioShack </td><td> 270-346 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Multi-stacking Cavo Patch Banana Plug </td><td> TSElectronic </td><td> B-36-02 B-24-02 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 silicone kit elastomero </td><td> Dow Corning </td><td> NC9020938 Da Fischer </td></tr><tr><td> Fluorescecence stereomicroscopio </td><td> Olimpo </td><td> MVX10 MacroView </td></tr><tr><td> cellSens standard </td><td> Olimpo </td><td> versione 1.3 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Elettrodeposizione e attrezzature visualizzazione fluorescenza. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Chitosano, peso molecolare medio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448877 </td></tr><tr><td> Acido cloridrico, Aristar. ACS, NF, FCC Grade </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td></tr><tr><td> Idrossido di sodio, soluzione. 10.00N </td><td>VWR </td><td> VW3247 </td></tr><tr><td> L&#39;acido alginico, sale di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 180947 </td></tr><tr><td> Multifex-MM precipitato Carbonato di calcio, le particelle 70Nm </td><td> Specialità Minerals Inc. </td><td> 100-3630-3 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Chitosano e reagenti soluzione di alginato. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio, diidrato </td><td> JT Baker </td><td> 0504 </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio, Certified Cristallina ACS </td><td> Fischer Scientifico </td><td> S271 </td></tr><tr><td> Potassio fosfato monobasico, anidro </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> Potassio fosfato dibasico, anidro </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3786 </td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato </td><td> Sigma- Aldrich </td><td> P4417 </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Altri componenti della soluzione tampone e reagenti. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Società / Source </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Glucosio ossidasi da Aspergillus niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2133 </td></tr><tr><td> Tirosinasi da fungo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3824 </td></tr><tr><td> LB brodo, Miller (granulato) </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP9723-2 </td></tr><tr><td> &quot;AI2-sintasi&quot; (HGLPT) </td><td> Lab magazzino 16 </td><td></td></tr><tr><td> W3110 tipo selvatico cellule </td><td> Lab magazzino 30 </td><td></td></tr><tr><td> MDAI2 + pCT6-lsrR - amp r + pET- <em&gt; DsRed - kan r cellule </td><td> Lab magazzino 30 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorospheres: diametro 1 pm, Ex / Em: 505/515 </td><td> Invitrogen </td><td> F8765 </td></tr><tr><td> 5 - (e-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidil estere, Ex / Em: 525/560 </td><td> Invitrogen </td><td> C-6157 </td></tr><tr><td> DyLight anticorpo etichettatura kit, 405 </td><td> Thermo Scientific </td><td> PI-53020 </td></tr></tbody></table> Enzimi Tabella 4., Cellule e reagenti funzionalizzazione altri.

bridging the bio-electronic interface with biofabrication

I progressi nella promessa della tecnologia lab-on-a-chip di rivoluzionare sia la ricerca e la medicina attraverso la riduzione dei costi, una migliore sensibilità, portabilità e una maggiore produttività. L&#39;incorporazione di componenti biologiche biologici su sistemi microelettromeccanici (BioMEMS) ha mostrato un grande potenziale per il raggiungimento di questi obiettivi. Microfabbricati chip elettronici consentono micrometro scala caratteristiche nonché un collegamento elettrico per il rilevamento ed attuazione. Funzionali componenti biologiche dare al sistema la capacità di rilevamento specifico di analiti, le funzioni enzimatiche e di cellule intere capacità. Processi di microfabbricazione standard e tecniche di bio-analitici sono stati utilizzati con successo da decenni nel settore delle industrie informatiche e biologiche, rispettivamente. La loro combinazione e l&#39;interfacciamento in un lab-on-a-chip ambiente, tuttavia, produce nuove sfide. Vi è una richiesta per le tecniche che possono creare un&#39;interfaccia tra l&#39;elettrodo e compon biologicaent che è mite ed è facile da produrre e modello. Biofabrication, qui descritto, è un approccio di questo tipo che ha mostrato una grande promessa per il suo facile da montare incorporazione dei componenti biologici con versatilità nelle on-chip le funzioni che vengono attivate. Biofabrication utilizza materiali biologici e meccanismi biologici (self-assembly, assemblaggio enzimatica) per la bottom-up assembly gerarchico. Mentre i nostri laboratori hanno dimostrato questi concetti in molti formati 1,2,3, qui dimostriamo il processo di assemblaggio sulla base di elettrodeposizione seguita da più applicazioni di segnale a base di interazioni. Il processo di assemblaggio consiste l&#39;elettrodeposizione di biocompatibili stimoli-responsive pellicole polimeriche sugli elettrodi e la loro successiva funzionalizzazione con componenti biologiche quali DNA, enzimi, o cellule vive 4,5. Elettrodeposizione sfrutta il gradiente di pH creato sulla superficie di un elettrodo polarizzato dalla elettrolisidi acqua 6,7,. Chitosano e alginato sono stimoli-sensibili polimeri biologici che possono essere attivati ​​per auto-assemblano in film di idrogel in risposta a segnali elettrici imposti 8. Lo spessore di questi idrogel è determinata dalla misura in cui il gradiente di pH si estende dall&#39;elettrodo. Questo può essere modificato utilizzando diverse densità di corrente e tempi di deposizione 6,7. Questo protocollo descrive come film chitosano vengono depositati e funzionalizzati con covalentemente collegando componenti biologici ai gruppi amminici primari abbondanti presenti sulla pellicola sia attraverso metodi enzimatici o elettrochimico 9,10. Film di alginato e loro intrappolamento di cellule vive anche essere affrontato 11. Infine, l&#39;utilità di biofabrication è dimostrato attraverso esempi di segnale a base di interazione, tra chimico-a-elettrico, cellula-cellula, e anche enzima-cellula trasmissione del segnale. Sia l&#39;elettrodeposizionee funzionalizzazione può essere eseguita in condizioni fisiologiche quasi senza la necessità di reagenti e quindi risparmiare labili componenti biologici da condizioni dure. Inoltre, sia chitosano e alginato sono da tempo utilizzati per scopi biologicamente rilevanti 12,13. Complessivamente, biofabrication, una tecnica rapida che possono essere semplicemente eseguita su un banco, può essere utilizzato per la creazione di modelli in scala micron di componenti funzionali biologici su elettrodi e può essere utilizzato per una varietà di lab-on-a-chip.

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Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Questo articolo descrive un approccio biofabrication: deposizione di stimoli-responsive polisaccaridi in presenza di elettrodi polarizzati per creare film biocompatibili che possono essere funzionalizzati con cellule o proteine. Abbiamo dimostrare un banco strategia per la generazione dei film, nonché il loro uso base per creare superfici interattive biofunctionalized per lab-on-a-chip.

Colmare il Bio-Electronic Interface con Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and ...

bridging-the-bio-electronic-interface-with-biofabrication

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.7K Views.  University of Maryland. Questo articolo descrive un approccio biofabrication: deposizione di stimoli-responsive polisaccaridi in presenza di elettrodi polarizzati per creare film biocompatibili che possono essere funzionalizzati con cellule o proteine. Abbiamo dimostrare un banco strategia per la generazione dei film, nonché il loro uso base per creare superfici interattive biofunctionalized per lab-on-a-chip.

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Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Adesione saggio di frequenza per In Situ Analisi cinetica delle interazioni molecolari incrociati giunzionale alla cellula-cellula di interfaccia

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Ricerca

Bioingegneria

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Sintesi Nanostar oro con un metodo d&#39;argento crescita Seed Mediated

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or erosion. Amelogenin has been proven to be a critical protein for controlling the organized growth of apatite crystals. In this paper, we present a detailed protocol for superficial enamel reconstruction by using a novel amelogenin-chitosan hydrogel. Compared to other conventional treatments, such as topical fluoride and mouthwash, this method not only has the potential to prevent the development of dental caries but also promotes significant and durable enamel restoration. The organized enamel-like microstructure regulated by amelogenin assemblies can significantly improve the mechanical properties of etched enamel, while the dense enamel-restoration interface formed by an in situ regrowth of apatite crystals can improve the effectiveness and durability of restorations. Furthermore, chitosan hydrogel is easy to use and can suppress bacterial infection, which is the major risk factor for the occurrence of dental caries. Therefore, this biocompatible and biodegradable amelogenin-chitosan hydrogel shows promise as a biomaterial for the prevention, restoration, and treatment of defective enamel.

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

In this article, we describe a protocol for fabricating an amelogenin-chitosan hydrogel for superficial enamel reconstruction. Organized in situ growth of apatite crystals in the hydrogel formed a dense enamel-restoration interface, which will improve the effectiveness and durability of restorations.

Sviluppo di amelogenina-chitosano Hydrogel per<em&gt; In Vitro</em&gt; Smalto ricrescita con una interfaccia Dense

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

Metodi per la Self-integrazione di Megamolecular biopolimeri sul asciugatura ad aria-LC Interfaccia

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Utilizzando biologia sintetica per Ingegnere cellule viventi che si interfacciano con materiali programmabili

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Fabrication of the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in the Adult Rat

Recent advances in neuroprosthetics have enabled those living with extremity loss to reproduce many functions native to the absent extremity, and this is often accomplished through integration with the peripheral nervous system. Unfortunately, methods currently employed are often associated with significant tissue damage which prevents prolonged use. Additionally, these devices often lack any meaningful degree of sensory feedback as their complex construction dampens any vibrations or other sensations a user may have previously depended on when using more simple prosthetics. The composite regenerative peripheral nerve interface (C-RPNI) was developed as a stable, biologic construct with the ability to amplify efferent motor nerve signals while providing simultaneous afferent sensory feedback. The C-RPNI consists of a segment of free dermal and muscle graft secured around a target mixed sensorimotor nerve, with preferential motor nerve reinnervation of the muscle graft and sensory nerve reinnervation of the dermal graft. In rats, this construct has demonstrated the generation of compound muscle action potentials (CMAPs), amplifying the target nerve&#39;s signal from the micro- to milli-volt level, with signal to noise ratios averaging approximately 30-50. Stimulation of the dermal component of the construct generates compound sensory nerve action potentials (CSNAPs) at the proximal nerve. As such, this construct has promising future utility towards the realization of the ideal, intuitive prosthetic.

Fabrication of the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface C-RPNI in the Adult Rat

The following manuscript describes a novel method for developing a biologic, closed loop neural feedback system termed the composite regenerative peripheral nerve interface (C-RPNI). This construct has the ability to integrate with peripheral nerves to amplify efferent motor signals while simultaneously providing afferent sensory feedback.

Fabbricazione dell'interfaccia nervo periferica rigenerativa composita (C-RPNI) nel ratto adulto

Recent advances in neuroprosthetics have enabled those living with extremity loss to reproduce many functions native to the absent extremity, and this is ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Imaging del flusso sanguigno con Doppler ultraveloce

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits versus other methods: DIBs are stable and often long-lasting, bilayer area can be reversibly tuned, leaflet asymmetry is readily controlled via droplet compositions, and tissue-like networks of bilayers can be obtained by adjoining many droplets. Forming DIBs requires spontaneous assembly of lipids into high density lipid monolayers at the surfaces of the droplets. While this occurs readily at room temperature for common synthetic lipids, a sufficient monolayer or stable bilayer fails to form at similar conditions for lipids with melting points above room temperature, including some cellular lipid extracts. This behavior has likely limited the compositions&#8212;and perhaps the biological relevance&#8212;of DIBs in model membrane studies. To address this problem, an experimental protocol is presented to carefully heat the oil reservoir hosting DIB droplets and characterize the effects of temperature on the lipid membrane. Specifically, this protocol shows how to use a thermally conductive aluminum fixture and resistive heating elements controlled by a feedback loop to prescribe elevated temperatures, which improves monolayer assembly and bilayer formation for a wider set of lipid types. Structural characteristics of the membrane, as well as the thermotropic phase transitions of the lipids comprising the bilayer, are quantified by measuring the changes in electrical capacitance of the DIB. Together, this procedure can aid in evaluating biophysical phenomena in model membranes over various temperatures, including determining an effective melting temperature (TM) for multi-component lipid mixtures. This capability will thus allow for closer replication of natural phase transitions in model membranes and encourage the formation and use of model membranes from a wider swath of membrane constituents, including those that better capture the heterogeneity of their cellular counterparts.

This protocol details the use of a feedback temperature-controlled heating system to promote lipid monolayer assembly and droplet interface bilayer formation for lipids with elevated melting temperatures, and capacitance measurements to characterize temperature-driven changes in the membrane.

Assemblaggio a temperatura controllata e caratterizzazione di un bistrato di interfaccia a goccia

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

La fabbricazione e il funzionamento di un sistema di micro-elettroporazione a flusso continuo con rilevamento di permeabilizzazione

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...