המחברים מבקשים להודות לצוות PXRR בNSLS (ברוקהייבן המעבדה הלאומית) לקבלת סיוע במהלך איסוף נתונים ומוניקה Pillon לעזרה בטיהור ה-DNA. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לחקר בריאות (MOP 67189).

1. טיהור חלבון המקשר הגמיש חיבור N-(oligomerization) ו-C-מסוף (DNA המחייב) תחומי SeqA עזרי ההכרה חוזרת GATC hemimethylated המופרד 02:59 מדליק את ה-DNA. במחקר זה, שהייתי גרסה של dimeric SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) עם מוטציה נקודתית בתחום N-המסוף המונעת המשך oligomerization ומקשר קצר שמגביל את ה-DNA המחייבת לטנדם GATC חוזר מופרדת באופן בלעדי על ידי סיבוב אחד בדנ&quot;א (איור 1) 2,8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרה (DE3) BL21 תאים עם SeqA הקידוד פלסמיד תחת השליטה של ​​אמרגן T7, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת השינוי בתגובת צלחות LB-אגר כולל 100 מיקרוגרם / המ&quot;ל אמפיצילין, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבות מעורבות לחסן תרבות לילה בקנה מידה הקטנה (תקשורת LB עם 100 מיקרוגרם / המ&quot;ל אמפיצילין), </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר לחסן 1 ליטר של מדיה באמצעות דילול של 1:100 overniתרבות ght, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את התאים לOD 600 של ~ 0.7 ולגרום לייצור חלבון על ידי תוספת של איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לריכוז סופי של 1 מ&quot;מ, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך הדגירה של 3 שעות ב 37 ° C עם רעד מסלולית ולאחר מכן לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה (10 דקות ב 3300 ז), </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא הגלול במאגר הטיהור וlyse ידי sonication, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה lysate ידי צנטריפוגה (40 דקות ב 39000 ז) ולטעון את supernatant על עמודה מתאזנת עם חיץ הטיהור הפרין, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute SeqA באמצעות שיפוע ליניארי לM NaCl 1 (SeqA elutes ב ~ 0.7 מ &#39;NaCl), </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברכה את שברי SeqA המכילים יחד, לדלל להנמיך את העוצמת היונית של המדגם ועומס בעמודת כרומטוגרפיה קטיון מטבע מתאזן עם חיץ טיהור, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשיפוע מלח ליניארי, SeqA הטהור elutes ב ~ 0.4 מ &#39;NaCl, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברכה את שברי SeqA המכילים יחד, concentratדואר (3 מ&quot;ג / מ&quot;ל) וחנות במאגר האחסון. </li></ol> 2. טיהור DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזמין oligonucleotides unmethylated והמפוגל משלימים מהחברה האהובה עליך, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס μmol 1 מתוך כל דנ&quot;א גדיל הבודד lyophilized בשנת 800 μl של autoclaved DDH 2 O, מערבולת ולתת לו לשבת במשך 10-20 דקות, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 800 μl של חיץ הטעינה 2X חומם מראש לכל oligonucleotide, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למשך 20-30 נוקלאוטידים oligonucleotides הארוך, להכין 10% ג&#39;ל denaturing גדול (160 x 250 x מ&quot;מ 1): * מערבב היטב 80 מ&quot;ל של 10% תמהיל PAGE, TEMED 80 μl וpersulfate אמוניום μl 800 לג&#39;ל ולשפוך, * מפולמר פעם, להסיר את המסרק ולשטוף את הבארות עם DDH 2 O ביסודיות, * הרכיב את הג&#39;לי על גבס ג&#39;ל כולל צלחת קירור ולאחר מכן למלא את המאגרים העליונים ותחתונים עם ריצת חיץ (1X TBE), * מראש להפעיל את הג&#39;ל ב700-750 V כדי לחמם את הג&#39;ל עד 55 מעלות צלזיוס, * תפסיק לרוץ ולשטוף בארות thoroughly עם ריצת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם את oligonucleotides עד 90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת ולסובב את הדגימות ומייד לפני טעינת ג&#39;ל, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל ב~ 700 V ולעצור אותו הפעם אחת oligonucleotide הגר באמצע הדרך. (שים לב שעל 10% ג&#39;ל polyacrylamide הכחול bromophenol שיתוף נודד עם oligonucleotides ~ 20 בסיסים ארוכים וקסילן cyanol FF עם ~ 60 בסיסים ארוכים), </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את הג&#39;ל, לפרק אותו מתיבת ג&#39;ל ולהסיר את המפרידים, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על משטח שטוח, הסר צלחת זכוכית אחת ולכסות את הג&#39;ל בניילון נצמד, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל בסביבה, להסיר את צלחת זכוכית האחרת ולכסות אותו בניילון נצמד, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את הרצועות באמצעות אור UV וצלחת ניאון מאחורי הג&#39;ל לראות את צל ה-DNA, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את הרצועה בסכין גילוח לחתיכות קטנות ולהעביר אותם לתוך צינור מ&quot;ל סטרילי 15, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מ&quot;ל של חיץ elution וelute לילה על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להעביר את הפתרוןלצינור צנטריפוגה autoclaved באמצעות קצה פיפטה ג&#39;ל טעינה כדי למנוע חתיכות acrylamide מעבירים ולהוסיף 1 מ&quot;ל של נתרן יצטט M 3 ב-pH 7 (1:10 דילול) בתוספת 25 מ&quot;ל של אתנול 100% מצונן (2.5 כרכים), </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב -20 ° C לפחות 3 שעות, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה ולהעביר את supernatant לצינור נפרד, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את הכדור במהירות-VAC בחום בינוני, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלול ב 400 μl של autoclaved DDH 2 O ולהעביר לצינור טרי, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסיפו 40 μl יצטט M 3 נתרן בשעת 7 pH ו1 מ&quot;ל של אתנול 100%; מערבב היטב (מערבולת) ודגירה 30 דקות בטמפרטורת חדר ואחרי 30 דקות ב -20 ° C, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין במשך 15 דקות ב18,000 גרמו וזורק supernatant, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור עם 100 μl של אתנול קר 70% להסיר מלח השיורי מהגלולה והספין ל6 דקות ב18,000 גרמו. השלך אתנול ולייבש את הגלולה במהירות-VAC, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הגלולה בסך של 100 μl של autoclaved DDH <sub&gt; 2 O. למדוד את הריכוז של oligonucleotide, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשל את דופלקסים DNA hemimethylated, לערבב ריכוזי equimolar של גדילים המשלימים ולחמם את התערובות עד 95 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 5 דקות ולאחר מכן לתת להם להתקרר לטמפרטורת חדר באיטיות בתוך אמבט המים. </li></ol> 3. חלבון ה-DNA גיבוש וניתוח מורכב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב כמויות שווות של המטוהרים SeqAΔ (41-59)-A25 (81 מיקרומטר) ודנ&quot;א hemimethylated (81 מיקרומטר), </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים להשתמש בו, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך לתנאי התגבשות באמצעות מסכי מסחר דליל מטריצה, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמוביל התגבשות ראשוני זוהה, לייעל את התנאים לגדל גבישים באיכות עקיפה, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotect גבישי תוצאת SeqA-DNA או על ידי הגדלת הכמות של 400 הווה PEG בפתרון ההתגבשות לריכוז סופי של 25% (v / v) או הוספת גליצרול 20% (v / v) לפתרון ההתגבשות, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סקופ גבישים בודדים עם לולאת ניילון, ותקפיא אותם בחנקן נוזלי, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את גבול ההשתברות של כל גביש ב 100 ק </li></ol> 4. נציג תוצאות כדי להשיג את המבנה הגבישי של SeqAΔ (41-59)-A25R הקשור ל-DNA hemimethylated, אנו רציפות מותאמת שלושה פרמטרים על ה-DNA: (i) הפרדה בין רצפי GATC hemimethylated (ii) אורך של הדופלקס וכן (iii) היעדרות / הנוכחות מסוכך 5 &#39;. מבחני משמרת אלקטרו ניידות עולים כי SeqAΔ (41-59)-A25R מעדיף נקשר חוזרת GATC מופרד 9-10 זוגות בסיסים (איור 1). לכן, אנחנו בהתחלה הוקרנו דופלקסים 23-24 זוגות בסיסים (סל&quot;ש) ארוך המכילים שני רצפי GATC hemimethylated מופרד או 9 או 10 סיביים לשנייה. שלושה דופלקסים הניבו גבישים יפים בצורה (איור 2). אללמרות שאיש מגבישי diffracted לרזולוציה גבוהה, 23 bps הארוך דופלקס עם שני אתרי GATC המופרדים ב9 סל&quot;ש מתפזר טוב יותר משאר צילומי רנטגן, המציין כי הפרדת GATC של 9 סל&quot;ש הועדפה להתגבשות. לכן, סדר את המרווח בין GATC עד 9 סל&quot;ש לכל המסכים שלאחר מכן. באופן כללי, התגבשות DNA היא העדיף לאורכים מתאימים למדויקים סיבובי סליל דופלקס כי מולקולות דנ&quot;א מרובות יכולות לערום את הראש אל זנב בצורת B-DNA מתמשך בתוך 9 גביש. לכן, אנו קצרנו את האורך הכולל של עד 21 דופלקסים סל&quot;ש (שני סיבובים כלומר סליל). בעוד דופלקס 21 סל&quot;ש עם קצוות קהים לא הניב גבישים עקיפים איכותיים (מידע לא מוצג), דופלקס 21 סיבי לשנייה עם סככת 5 &#39;נוקלאוטיד יחידה בכל קצה לא תניב גבישים שמתפזרים כדי 5 A במקור הבית שלנו. השיפור בגבול ההשתברות הציע שקצה לקצה דופלקס עמותה אכן הייתה מעדיפהאריזת ing גביש. מאז SeqA אינטראקציה עם רצפי GATC כי הם על אותו הפרצוף של ה-DNA, פן ההפוכות של הדופלקס הדנ&quot;א צריכות להיות חשופות לממס. כדי לשפר עוד יותר את הגבישים של המתחם, אז אנחנו שונים הרצף של הדופלקס לכלול dinucleotide CG בין שני אתרי GATC לקדם אינטראקציות גרוב-עמוד שדרה עם מולקולות DNA סמוכות בגביש באמצעות הפנייה השנייה של דופלקס, שיטה שנעשה שימוש כדי לשפר את התגבשות DNA ב10 העבר. עם זאת, גבול ההשתברות של הגבישים גדלו עם דופלקס CG המכיל היה זהה לאלה שגדלו עם דופלקס דנ&quot;א דומה שלא הכיל dinucleotide CG (איור 3). תוצאה זו מצביעה על כך שאינטראקציות גרוב-עמוד שדרה לא היו חשובות במקרה זה. אנחנו מכן מותאמים האורך של מסוכך על ידי השוואה בין הגבישים גדלו עם דופלקס דנ&quot;א שהיו שני נוקליאוטידים נוספים בכל5 הסוף &#39;. שינוי זה השפיע באופן דרסטי על מורפולוגיה גביש, כמו גם, גבול השתברות המציין כי נוקליאוטידים נוספים שינו את המגעים המולקולריים וארגון משופר גביש (איור 3) באופן דרמטי. המבנה הגבישי של SeqAΔ (41-59)-A25R חייב דופלקס זו האחרונה דנ&quot;א אשר כי הפנייה ללא דופלקס דנ&quot;א אינה עוסקת בקשר של גביש, כצפוי מההשפעה המוגבלת של החדרת CG-dinucleotide. למרות הגודל היחסי של חלבונים ו-DNA, רוב האינטראקציות בין בני זוג סימטריה מתווכות על ידי אינטראקציות בין חלבונים וחלבון ה-DNA (איור 4). מעניין לציין שבמקרה הספציפי הזה, ההשפעה המועילה של סככת dinucleotide 5 &#39;היא לא עקב ההיווצרות של DNA פסאודו רציף. במקום זאת, סופו 5 &#39;מפרויקטי הגדיל המפוגלים הרחק מצירי DNA ומקיים אינטראקציה עם מולקולת SeqA הפרוקסימלי של המתחם, המסביר מדוע נוקלאוטידים 2 w<html> פה נדרש להקפיד לשנות את גביש אריזה 8,11. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig1.jpg" /> איור 1. עקידת SeqAΔ (41-59)-A25R ל-DNA hemimethylated. () תרשים סכמטי של תחומי SeqA שoligomerization וDNA החלבון לתווך מחייב. (ב) assay electrophoretic ניידות המשמרת של SeqAΔ (41-59)-A25R עם DNAs המכיל שני רצפי GATC hemimethylated מופרדים על ידי מספר גדל והולך של זוגות בסיסים ( X). הנתיב השמאלי ביותר (שכותרת ריקה) מכיל תערובת של equimolar DNAs עם 5, 7, 12, 21, 25 ו 34 זוגות בסיסים בין שני רצפי GATC בהעדר SeqAΔ (41-59)-A25R. (C) תרשים המתאר את השלושה המשתנים מותאמים על DNA דופלקסים להשיג גבישים באיכות עקיפה. upload/4266/4266fig2.jpg &quot;fo: תוכן רוחב =&quot; 6in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg &quot;/&gt; איור 2. השפעה של שינוי מרחק. הסיכום בין GATC של oligonucleotides משמש וגבישים שהושגו עם 23-24 דופלקסים ארוכים BP המכילים שני אתרי GATC hemimethylated המופרד ב9 או 10 זוגות בסיסים. כל התמונות של גבישים נלקחו באותו הגדלה וסרגל קנה המידה מציין 100 מיקרומטר. מגבלת הרזולוציה של כל SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA גביש מתבסס על תמונות שנאספו על עקיפת Rigaku RU-300 מערכת גנרטור רנטגן. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3highres.jpg" /> איור 3. השפעה של שינוי DNA מסתיימת. סיכום של tהוא oligonucleotides שימוש, וגבישים שהושגו עם 21 bps דופלקסים ארוכים המכילים שני אתרי GATC hemimethylated המופרד ב9 זוגות בסיסים וכוללים 0, 1 או 2 מסוכך נוקלאוטיד 5 &#39;קצה. כל התמונות של גבישים נלקחו באותו הגדלה וסרגל קנה המידה מציין 100 מיקרומטר. מגבלת הרזולוציה של כל SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA הגביש מתבסס על תמונות שנאספו בעקיפת beamlines X12C וX29 (NSLS, BNL). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig4.jpg" /> איור 4. האריזה של SeqAΔ קריסטל (41-59)-A25R חייב DNA עם סככת dinucleotide: נצפה מ() למעלה ובצד (B). היחידה אסימטרית מכילה 2 SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA מתחמים שבו החלבון מוצג באפור תוך הדנ&quot;א מוצג בכתום. Symmetר&quot;י הקשור SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA מולקולות מוצגות בלבן והצהוב לחלבון ה-DNA. נתון זה הוכן באמצעות 12 PyMOL. נתון זה קשור לסרט 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> סרט 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266movie1.avi" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט.</a>

<ol>
	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אחד האתגרים הגדולים ביותר בקריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן הוא קבלת גבישים באיכות עקיפה. במקרה של חלבון או חלבון-DNA תסביכים, אתגר זה מתעצם בשל משתנים הנוספים שצריך להיות מותאמים. הוא האמין נרחב כי אורכו של ה-DNA ואת הנוכחות של מסוכך דביק כדי לשפר את הקשר בין מולקולות דנ&quot;א ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (DTT) </td><td> יו היסוד בע&quot;מ </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> סולפט dodecyl נתרן (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> אוריאה </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% Bis 29:1 / acrylamide </td><td> יו היסוד בע&quot;מ </td><td> A0007-500ml </td><td> לאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> חומצה בורה </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> קסילן cyanol FF </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> בלו Bromophenol </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> מערכת ג&#39;ל כפולה מתכוונן אנכי </td><td> CBC המדעי חברה בע&quot;מ </td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td> מסך התגבשות אינדקס </td><td> המפטון מחקר </td><td> HR2-144 </td><td> לאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> מסך התגבשות אני אשף </td><td> אמרלד BioSystems </td><td> EBS-Wiz-1 </td><td> לאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> מסך התגבשות השנייה אשף </td><td&gt; אמרלד BioSystems </td><td> EBS-Wiz-2 </td><td> לאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> קלאסיקות מסך התגבשות </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> לאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> מגשי Intelliplate </td><td> אמנות רובינס מכשירים </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> פתרונות חיץ חלבון טיהור: 100 המ&quot;מימ TRIS pH 8, 2 המ&quot;מ EDTA, mM DTT 2 ו 5% גליצרול. חיץ חלבון אחסון: 20 המ&quot;מ TRIS pH 8, 150 המ&quot;מ NaCl, 5 המ&quot;מ DTT, 0.5 המ&quot;מ EDTA ו5% גליצרול. תמהיל ג&#39;ל טעינה: הוסף 20 גרם של סוכרוז, 25 מ&quot;ג של כחול bromophenol, 25 מ&quot;ג של cyanol FF קסילן, 1 מ&quot;ל של 10% w / v SDS ו10 מ&quot;ל של TBE 10X עד 70 מ&quot;ל של autoclaved DDH 2 O. מערבב עם חימום קל עד סוכרוז נמס ולהתאים הסופייםנפח עד 100 מ&quot;ל עם autoclaved DDH 2 O. לאחסן ב 4 ° C. חיץ הטעינה 2X: הוסף 11 גרם של אוריאה עד 10 מ&quot;ל של תערובת טעינת ג&#39;ל. מערבב בצלחת חמה עד האוריאה מתמוססת. Aliquot ב 2 צינורות מ&quot;ל ולאחסן ב 4 ° C. תמהיל העמוד 10X: מיקס 420.4 גרם של אוריאה, 100 מ&quot;ל של TBE 10X (autoclaved), 250 מ&quot;ל של 40% 29:1 Bis / acrylamide בDDH 2 O. מערבב עד שהיא נמסה לחלוטין ולהתאים את הנפח 1 ליטר. אחסן בבקבוקים כהים ב 4 ° C. TBE 10X: ממס 108 גרם לטריס, 55 גרם של חומצה בורה ו9.3 גרם של EDTA ב1 ליטר של DDH 2 O. חיטוי וחנות בטמפרטורת חדר. חיץ elution: לדלל 8 מ&quot;ל של 5 M NaCl, 2 מ&quot;ל של M TRIS pH 1 7.5, 0.4 מ&quot;ל של 0.5 מ &#39;EDTA pH 8 ב 200 מ&quot;ל של DDH 2 O. חיטוי וחנות בטמפרטורת חדר. </td></tr></tbody></table&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

Escherichia coli SeqA הוא רגולטור שלילי של שכפול הדנ&quot;א שמונע פגי אירועי reinitiation לפי אשכולות GATC hemimethylated sequestering בתוך המקור של שכפול 1. מעבר למקור, SeqA נמצא במזלגות שהכפולים, שבו הוא מארגן את ה-DNA המשוכפל חדשה למבנים מסודרים גבוהים יותר 2. מקורבי SeqA רק בחולשה עם רצפי GATC בודדים, אבל הוא יוצר קומפלקסי זיקה גבוהות עם דופלקסים DNA המכילים אתרי GATC מרובים. היחידה התפקודית ומבנית המינימאלית של SeqA היא דימר, ובכך הסבירה את הדרישה של לפחות שני רצפי GATC כדי ליצור מורכבות-זיקה גבוהה עם DNA hemimethylated 3. בנוסף, ארכיטקטורת SeqA, עם oligomerization ותחומי ה-DNA מחייבים מופרדים מקשר גמיש, מאפשרת מחייבת לחוזר GATC המופרד עד שלושה סיבובי סליל. לפיכך, הבנת הפונקציה של SeqA ברמה מולקולרית דורשת ana המבניתמוגה של SeqA חייבת רצפי GATC מרובים. בהתגבשות החלבון ה-DNA, ה-DNA יכול להיות אף להשפעה יוצאת דופן על אינטראקציות האריזה בהתאם לגדלים והארכיטקטורה היחסיים של החלבונים והדנ&quot;א. אם החלבון הוא גדול יותר מאשר ה-DNA או טביעות רגליים של רוב ה-DNA, אריזת הגביש מתווכת בעיקר על ידי אינטראקציות בין חלבונים. לעומת זאת, כאשר החלבון הוא באותו גודל או קטן יותר מאשר DNA או שהוא מכסה חלק קטן של ה-DNA, ה-DNA DNA-DNA וחלבון האינטראקציות רק שולט אריזת גביש. לכן, התגבשות של קומפלקסים-DNA חלבון דורשת הקרנה השיטתית של 4 אורך הדנ&quot;א ומסתיים DNA (בוטה או סככה) 5-7. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים כיצד לעצב, לייעל, לטהר ולהתגבש דופלקסים DNA המכילים hemimethylated חוזר טנדם GATC במתחם בוריאצית dimeric של SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) כדי לקבל גבישים מתאימים לקביעת מבנה.

Watch this Scientific Journal Video about Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes at JoVE.com

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

מבנה הגבישי של קומפלקסים-DNA חלבון יכול לספק תובנות לגבי תפקוד חלבון, מנגנון, כמו גם, את אופי האינטראקציה הספציפית. כאן, אנו מדווחים איך לייעל את האורך, רצף וקצוות של DNA דופלקס להתגבשות שיתוף עם<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; SeqA, רגולטור שלילי של ייזום שכפול.

איטרטיבי אופטימיזציה של דופלקסים DNA להתגבשות של מכלולי SeqA-DNA

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

iterative-optimization-dna-duplexes-for-crystallization-seqa-dna

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K Views.  McMaster University. מבנה הגבישי של קומפלקסים-DNA חלבון יכול לספק תובנות לגבי תפקוד חלבון, מנגנון, כמו גם, את אופי האינטראקציה הספציפית. כאן, אנו מדווחים איך לייעל את האורך, רצף וקצוות של DNA דופלקס להתגבשות שיתוף עם חיידקי Escherichia SeqA, רגולטור שלילי של ייזום שכפול.

Video: Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

הערכת דו מימדי ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה קטנים ללימודי לביולוגיה מבנית על ידי קריסטלוגרפיה אלקטרונים

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

חלבון התגבשות של קריסטלוגרפיה רנטגן

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

מיפוי מבוסס AFM של תכונות אלסטיות של קירות תא: ברקמות, נייד, והחלטות subcellular

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 complexes consist of 14 protein subunits including Ino80, a SNF2-like ATPase, which serves both as the catalytic subunit and the scaffold for assembly of the complexes. Functions of the other subunits and the mechanisms by which they contribute to the INO80 complex&#39;s chromatin remodeling activity remain poorly understood, in part due to the challenge of generating INO80 subassemblies in human cells or heterologous expression systems. This JOVE protocol describes a procedure that allows purification of human INO80 chromatin remodeling subcomplexes that are lacking a subunit or a subset of subunits. N-terminally FLAG epitope tagged Ino80 cDNA are stably introduced into human embryonic kidney (HEK) 293 cell lines using Flp-mediated recombination. In the event that a subset of subunits of the INO80 complex is to be deleted, one expresses instead mutant Ino80 proteins that lack the platform needed for assembly of those subunits. In the event an individual subunit is to be depleted, one transfects siRNAs targeting this subunit into an HEK 293 cell line stably expressing FLAG tagged Ino80 ATPase. Nuclear extracts are prepared, and FLAG immunoprecipitation is performed to enrich protein fractions containing Ino80 derivatives. The compositions of purified INO80 subcomplexes can then be analyzed using methods such as immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry. The INO80 and INO80 subcomplexes generated according to this protocol can be further analyzed using various biochemical assays, which are described in the accompanying JOVE protocol. The methods described here can be adapted for studies of the structural and functional properties of any mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.

This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.

דור וטיהור של מכלולי אדם INO80 הכרומטין שיפוץ וSubcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...